转拟南芥P5CS1基因增强羽衣甘蓝的耐旱性

为提高羽衣甘蓝的耐旱性,本文将拟南芥Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS1）基因经农杆菌介导转入羽衣甘蓝植株中,检测转基因株系与野生型植株在干旱胁迫下P5CS1 mRNA表达量、幼苗脯氨酸含量、株系根系性状、整株干重、鲜重和整株存活率。结果表明,在15%PEG6000渗透胁迫下,转基因植株的P5CS1基因mRNA表达量明显增加,转基因植株脯氨酸含量是野生型的2.4倍;主根长、最长侧根长、侧根数目、整株干重和鲜重均高于野生型,干重/鲜重则低于野生型,转基因植株的平均存活率为78%,极显著高于野生型。数据显示,AtP5CS1基因在羽衣甘蓝中的表达明显改善了转基因植株的耐旱性。     

烟草胞质6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因的克隆及表达分析

采用电子克隆的方法,结合RT-PCR和SMART RACE技术,首次从烟草(Nicotiana tabacum)中克隆到1个胞质6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)基因的c DNA序列,命名为Nt6PGDH(Gen Bank登录号:KM211534)。该基因c DNA全长1 932bp,开放阅读框1 455 bp,编码484个氨基酸,与番茄(Solanum lycopersicum)和马铃薯(Solanum tuberosum)的6PGDH氨基酸序列一致性最高,为95%。生物信息学分析表明,Nt6PGDH氨基酸序列不存在信号肽和转运肽,无跨膜结构域,定位于细胞质。对烟草不同发育时期Nt6PGDH基因的表达情况分析发现,Nt6PGDH基因在烟草旺长期根、茎、叶中的表达量均高于苗期,并且在同一发育时期,烟草根中表达量最强,茎次之,叶片最弱。     

pFGC5941的改造及拟南芥NAC1和SIP1双基因反义表达载体的构建和遗传转化

拟南芥中的SIP1基因编码的蛋白与拟南芥盐胁迫应答中的关键蛋白SOS2存在互作关系,而NAC1为拟南芥中介导生长素信号促进其侧根发生的蛋白。本研究中我们将SIP1基因和NAC1正义基因以及SIP1基因和NAC1反义基因分别整合到一个经改造的具有2个35S启动子的可用于双基因表达的载体pFGC5941S中,构建了两个双基因表达载体pFGC5941S SIP1 NAC1 sense和pFGC5941S SIP1 NAC1 anti。并将这两个载体通过农杆菌介导的方法转化到野生型拟南芥中,共获得15株转基因植株。对这些转基因植株进行盐胁迫实验发现,在含75mmol·L-1 NaCl的MS培养基上,相比于野生型,pFGC5941S SIP1 NAC1 sense转基因植株主根增长,侧根数量明显增多,而pFGC5941S SIP1 NAC1 anti转基因植株长势与野生型苗相似。由此我们推测可能只有当SIP1和NAC1同时过表达时,才会促进盐胁迫下拟南芥侧根的发育。     

油菜素内酯合成酶基因DAS5促进杨树生长及提高抗旱性的作用

以河北杨(Populus hopeiensis)为材料, 研究拟南芥(Arabidopsis thaliana)油菜素内酯(BR)生物合成酶基因DAS5对其生长表型、生物量及抗旱性的影响。结果表明: (1) 转DAS5基因河北杨植株的根长、地径、叶柄及叶片长度均显著大于野生型植株, 且地上、地下部分干重及根冠比显著高于野生型, 其拥有发达的根系; (2) 在干旱胁迫下, 转DAS5基因河北杨植株失水褪绿速度较野生型植株缓慢, 在复水后转基因植株能够较早较好地恢复活力, 萌发较多的新幼芽且长势良好; (3)控水期间, 转基因河北杨的相对生长率显著高于野生型, 且随着干旱胁迫程度的加剧, 其可溶性糖含量、游离脯氨酸含量、过氧化氢酶(CAT)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性均显著高于野生型。实验结果表明, 与野生型相比, 转基因植株具有较高的生长量与较强的抗干旱胁迫能力, 说明来自拟南芥的BR生物合成酶基因DAS5可以显著增加河北杨的生长量并在抵御干旱胁迫机制中发挥重要作用。     

超量表达MrCN基因提高烟草植株对TMV的抗性

利用农杆菌介导的遗传转化法将含有普通烟草Ubi．U4启动子驱动MrCN基因表达的元件导入TMV敏感烟草品种K326中,对筛选鉴定出的T0代转基因植株接种TMV,测定其接种前后不同时期的理化指标,以接种TMV的野生型植株为对照。结果显示,转基因植株和野生型植株接种TMV前叶绿素（Chl）和MDA含量YLSOD、POD和CAT酶活力均无显著差异,但接种TMV后野生型植株Chl含量逐渐降低,转基因植株Chl含量先增后降,在接种TMV后5d时转基因植株叶片Chl含量显著高于野生型植株。接种前期（0-3d）转基因植株MDA含量略低于野生型植株,但差异不显著;但接种后期（3～5d）前者的MDA含量显著低于后者。接种TMV后转基因植株中SOD、POD及CAT酶活性变化幅度较野生型植株高,以CAT的变幅最为显著。另外,Real-timePCR分析结果表明,接种TMV后3d时转基因植株删蹦、PR-1α及NrCN表达量均显著高于野生型植株。以上结果表明,通过转基因技术提高烟草抗病基NNrCN的表达量,能提高防御酶活性及病程相关基因的表达量,从而延缓植株感染TMV的发病时间,增强敏感植株对TMV的抗性。     

大豆转录因子GmC2H2基因转化拟南芥效果分析

GmC2H2转录因子基因是本实验室获得的一个编码172个氨基酸携带516bp核苷酸的转录因子,属于经典C2H2型锌指蛋白.通过构建植物表达载体GmC2H2-pCAMBIA1304,借助优化的Floral-dip法转化模式植物拟南芥,经潮霉素Hygromycine( 45-50 mg/L)抗性筛选获得转基因拟南芥植株.GUS组织染色分析表明,GmC2H2基因在生长12d的转基因拟南芥幼苗中,表达部位主要集中在根部.对转基因拟南芥进行了低温(1℃)和脱落酸(200 μmol/L)胁迫处理,测定其生理生化指标,通过real-time qPCR确定目的基因在转基因拟南芥中的表达情况.结果表明,携带GmC2H2目的基因的转基因拟南芥中脯氨酸和可溶性糖水平要高于野生型植株,而丙二醛水平要低于野生型,在抗逆性方面明显优于野生型拟南芥植株;并且胁迫处理下的转基因拟南芥中GmC2H2基因的表达量要高于未胁迫处理的转基因植株,说明GmC2H2基因的表达受低温和ABA的诱导,初步明确了该转录因子基因的功能.     

超量表达NrCN基因提高烟草植株对TMV的抗性

利用农杆菌介导的遗传转化法将含有普通烟草Ubi.U₄启动子驱动NrCN基因表达的元件导入TMV敏感烟草品种K326中,对筛选鉴定出的T₀代转基因植株接种TMV,测定其接种前后不同时期的理化指标,以接种TMV的野生型植株为对照。结果显示,转基因植株和野生型植株接种TMV前叶绿素（Chl）和MDA含量及SOD、POD和CAT酶活力均无显著差异,但接种TMV后野生型植株Chl含量逐渐降低,转基因植株Chl含量先增后降,在接种TMV后5 d时转基因植株叶片Chl含量显著高于野生型植株。接种前期（0³ d）转基因植株MDA含量略低于野生型植株,但差异不显著;但接种后期（3⁵ d）前者的MDA含量显著低于后者。接种TMV后转基因植株中SOD、POD及CAT酶活性变化幅度较野生型植株高,以CAT的变幅最为显著。另外,Real-time PCR分析结果表明,接种TMV后3 d时转基因植株MAPK、PR-1a及NrCN表达量均显著高于野生型植株。以上结果表明,通过转基因技术提高烟草抗病基因NrCN的表达量,能提高防御酶活性及病程相关基因的表达量,从而延缓植株感染TMV的发病时间,增强敏感植株对TMV的抗性。     

pFGC5941的改造及拟南芥NAC1和SIP1双基因反义表达载体的构建和遗传转化

拟南芥中的SIP1基因编码的蛋白与拟南芥盐胁迫应答中的关键蛋白SOS2存在互作关系,而NACl为拟南芥中介导生长素信号促进其侧根发生的蛋白。本研究中我们将SIPl基因和NAC1正义基因以及SIP1基因和NAC1反义基因分别整合到一个经改造的具有2个35S启动子的可用于双基因表达的载体pF—GC5941S中,构建了两个双基因表达载体pFGC5941S-SIP1-NAC1-sense和pFGC5941S-SIP1-NACl-anti。并将这两个载体通过农杆菌介导的方法转化到野生型拟南芥中,共获得15株转基因植株。对这些转基因植株进行盐胁迫实验发现,在含75mnlol·L-1 NaCl的MS培养基上,相比于野生型,pFGC5941S-SIP1-NAC1-sense转基因植株主根增长,侧根数量明显增多,而pFGC5941S-SIP1-NAC1-anti转基因植株长势与野生型苗相似。由此我们推测可能只有当SIP1和NAC1同时过表达时,才会促进盐胁迫下拟南芥侧根的发育。     

转天山雪莲sikPIP3基因烟草的获得及抗逆性鉴定

利用PCR技术从实验室建立的天山雪莲DNA文库中克隆了天山雪莲质膜水孔蛋白基因sikPIP3,构建了植物表达载体pBI121-sikPIP3,通过农杆菌介导法转化烟草品种NC89,经PCR和RT-PCR检测证明目的基因成功导入并得到了表达,采用水分胁迫进行抗旱分析和采用冷冻胁迫进行抗寒性分析。结果显示:(1)克隆出具有水孔蛋白基因特性的sikPIP3基因。(2)经断水干旱处理,转基因烟草的生长表型优于野生型烟草,特别是在断水9d的情况下,野生型烟草已经完全萎蔫,转基因烟草萎蔫症状较轻;生理指标测量结果显示,转基因烟草的相对电导率和MDA的含量低于野生型烟草,相对含水量和CAT活性高于野生型烟草。试验表明转sikPIP3烟草的抗旱性高于野生型烟草。(3)经不同温度胁迫处理,转基因烟草的生长表型优于野生型烟草,特别是在-4℃冷处理6h情况下,野生型烟草已经完全萎蔫,转基因烟草只出现少量伤斑;生理指标分析结果表明,转基因烟草的相对电导率和MDA的含量低于野生型烟草,CAT活性高于野生型烟草。试验表明转sikPIP3烟草的抗寒性高于野生型烟草。综合结果表明:sikPIP3基因在抗逆基因工程方面具有较高的应用前景。     

转彩色马铃薯StAN1基因的烟草幼苗耐旱性分析

该研究以转彩色马铃薯StAN1基因烟草为材料、野生型烟草(WT)为对照,测定分析转StAN1基因烟草在种子萌发期、幼苗期和苗期对干旱(甘露醇)处理的耐受情况,并对苗期旱热共同胁迫的耐受情况进行测定分析,以探讨彩色马铃薯StAN1基因的功能,为耐旱彩色马铃薯育种提供新路径。结果显示:(1)转StAN1基因烟草鉴定显示,阳性率为82.6%,且转基因烟草的叶片明显变紫,花青素含量极显著高于野生型烟草。(2)在培养基甘露醇浓度为150 mmol/L时,点播在培养基上的转基因烟草种子第5天时的萌发率达到了7%,是野生型烟草萌发率的2.3倍。(3)在甘露醇浓度为0和100 mmol/L的培养基上竖直培养时,转基因烟草的根长分别是野生型烟草的1.46和1.30倍,根长比野生型烟草显著增长。(4)在干旱胁迫下,转基因烟草幼苗叶片中的脯氨酸含量以及超氧化物歧化酶活性均显著高于野生型烟草,丙二醛含量均显著低于野生型烟草。(5)转基因烟草LEA基因和ERF基因在干旱和旱热处理中的相对表达量均高于野生型烟草。研究表明,StAN1基因在提高植物花青素含量的同时也提高了植物的耐旱性。     

蔗糖合酶基因AtSUS3干涉后对拟南芥角果发育的影响

蔗糖合酶(SuSy)是植物蔗糖代谢关键酶之一,该研究利用反向遗传学手段,采用RNAi技术抑制拟南芥中AtSUS3基因的表达,测定纯系转基因植株的抽苔率,并对酶活性、糖含量等指标以及糖代谢相关基因的表达进行了检测,探讨SuSy在植物发育中的作用。结果显示:(1)转基因拟南芥的抽苔平均早于野生型植株2～3d,且优先3～4d完成抽苔。(2)开花后生长天数对角果蔗糖和葡萄糖含量有显著影响,而对果糖含量影响不显著;开花后5d时,野生型株系的葡萄糖含量显著高于转基因株系SUS3-2,至15d时,两种转基因株系葡萄糖含量均显著低于野生型株系。(3)开花后生长天数对SuSy、SPS、INV的活性均有显著影响,随开花时间延长,野生型株系SuSy活性显著低于转基因株系,而SPS和INV则相反。(4)AtSUS3基因沉默对其他糖代谢基因有不同程度的影响,开花后5d时,转基因植株的角果中AtCesA1、AtCesA7和AtCINV1的表达量较野生型都有所增加;开花后15d时,转基因植株的角果中AtCesA1、AtCesA7的表达量较野生型高,而AtCINV、AtCwINV的表达量比野生型低。研究表明,拟南芥AtSUS3基因沉默后,在正常生长条件下未造成植株发育异常,同时还可能通过同源家族中其他SuSy的表达水平增加,促进了该酶及糖代谢相关基因整体水平的增加,有助于角果成熟。     

拟南芥热激转录因子耐高温功能分析

从拟南芥基因组中克隆了热激转录因子(At Hsf A6a),构建了过量表达(over-expression,OE)和反义(anti-sense,AS)植物表达载体并转化拟南芥,获得了拟南芥纯合转基因株系。对其进行耐高温处理,结果显示:43℃处理2 h,过量表达转基因植株存活率(86%)远高于野生型(59%);而反义转基因植株存活率则只有43%,显著低于野生型。43℃处理0.5 h,过量表达转基因植株的离子渗漏水平显著低于野生型,而反义转基因植株则大幅度升高。基因表达分析证明,AtHsfA6a的表达受热胁迫诱导,并且Hsp70是受AtHsfA6a调控的下游靶基因。上述结果表明,拟南芥AtHsfA6a可能通过调节Hsp70表达,提高植物耐受高温胁迫的能力。     

羊草LcPIP基因遗传转化露地菊及其抗盐性鉴定

PIP是重要的水孔蛋白之一,与植物的抗逆性有关。本文用叶盘法将羊草LcPIP遗传转化露地菊火焰,通过常规PCR和GUS染色方法鉴定转基因株系,Real-time PCR检测盐胁迫下转基因和野生植株中CmPIP1和CmPIP2的相对表达量,并测定SOD、POD活性和MDA含量。结果显示,在转LcPIP基因的露地菊植株叶片中,CmPIP1和CmPIP2基因表达量均上升,是野生型植株的2倍;根部的CmPIP1与CmPIP2基因的表达量均上升,CmPIP1上升程度高于CmPIP2。在200 mmol·L~(-1) NaCl的胁迫下,野生型植株中CmPIP1基因表达量明显下降,而转基因植株中CmPIP1基因表达量在12~48 h出现明显的上升;在盐胁迫12 h后,转基因植株中CmPIP2基因表达量上升程度明显高于野生型植株。盐胁迫12 h后,转基因植株的SOD活性提高更为明显。在盐胁迫前期(0~24 h)转基因植株MDA含量增加幅度低于野生型植株;在盐胁迫后期(48~72 h)转基因露地菊POD活性出现明显上升,而野生型露地菊呈下降趋势。     

超表达AVP1基因提高甜菜的耐低磷和耐盐抗旱性

为探讨H⁺-焦磷酸酶编码基因对甜菜磷吸收和抗性的影响，实现优良基因在甜菜基因工程中的利用，研究在甜菜中超表达拟南芥液泡膜H⁺-焦磷酸酶编码基因AVP1,对转基因甜菜分析其耐低磷、耐盐性和抗旱性。结果显示，AVP1基因在甜菜植株的叶片和块根中表达，且在逆境胁迫下增强表达量响应胁迫；低磷处理条件下，转基因甜菜与野生型甜菜相比具有更高的含磷量，可提高甜菜对磷的吸收利用效率；干旱、盐胁迫处理条件下，AVP1基因在转基因甜菜中显著上升，在盐胁迫或干旱处理条件下，转基因植株的生长受抑程度相对较轻。随着盐和干旱胁迫的加剧，转基因植株体内MDA含量与野生型植株相比较低而脯氨酸含量显著增加，AVP1基因可通过减轻逆境对甜菜细胞膜的损伤及提高甜菜细胞的渗透调节能力，进而增强甜菜对高盐和干旱胁迫的抗性。     

中国水仙NtSAMT基因的克隆及转化金鱼藤

本研究以中国水仙花瓣总RNA为模板进行反转录PCR,扩增得到与预期大小相同的PCR产物带,回收反转录PCR产物,将其与p EASY-T1克隆载体连接并导入大肠杆菌DH5α进行克隆,经菌落PCR和双酶切鉴定,筛选带有目的基因的重组质粒并进行测序。测序结果表明中国水仙花香基因SAMT c DNA的ORF片段1 131 bp编码376个氨基酸残基,与已报导的中国水仙SAMT(JX273470)的同源性为99.2%。将目的基因片段与PBI121表达载体连接,并利用农杆菌介导法将Nt SAMT基因转化到金鱼藤(Asarina procumbens)中,以金鱼藤无菌苗茎段为遗传转化外植体,通过抗性筛选获得12株转化植株,对获得的12株疑似转基因植株进行PCR检测,其中有8株呈阳性;通过RT-PCR检测得到的阳性植株,其中有5株呈阳性。检测结果表明,该研究成功克隆水仙花Nt SAMT基因并在金鱼藤植物中得到表达。     

普通烟草鸟氨酸转氨酶基因Ntδ-OAT的克隆与表达分析

鸟氨酸转氨酶是以鸟氨酸为前体合成脯氨酸的关键酶,对植物适应逆境胁迫起关键作用。本研究根据其已知保守序列设计兼并引物,从普通烟草品种中烟14中克隆到一条425bp的中间片段,应用RACE方法设计特异性引物扩增得到5′末端和3′末端cDNA序列,经BLAST验证,首次从普通烟草中克隆到了鸟氨酸转氨酶基因,命名为Ntδ-OAT,其GenBank登录号为GU144571。该基因cDNA全长为1781bp,共编码477个氨基酸。系统进化树分析显示,Ntδ-OAT基因的进化符合传统的生物学分类,主要功能域在生物进化中保守性较高。Real-time PCR分析表明,Ntδ-OAT基因受干旱、高盐、低温、ABA等多种胁迫处理的诱导表达,可能参与普通烟草体内抗渗透胁迫过程。     

高粱ATP合成酶E亚基基因(SbATPase-E)的克隆及其抗逆功能研究

高粱是一种抗旱性较强的禾谷类作物。本研究在高粱中克隆到一个全长为693 bp的编码ATP合成酶E亚基的基因(SbATPase-E)。在高粱幼苗期,SbATPase-E基因受Na Cl和脱落酸(ABA)处理诱导上调表达。该基因在拟南芥中过量表达可提高转基因植株的耐旱性和耐盐性,在逆境胁迫条件下转基因拟南芥植株较野生型植株根系发达,可能是转基因植株耐旱性和耐盐性提高的主要原因。在干旱胁迫条件下,转基因植株中DREB2A、P5CS1、RD29A、RAB18和ABI1基因的表达量相对于野生型植株中的表达量提高更为显著;在高盐处理条件下,转基因植株中SOS1和SOS2基因的表达量也较野生型植株中的表达量明显提高。这些抗逆相关基因的上调表达可能是转基因植株抗逆性提高的主要分子机制。     

无苞芥锌指蛋白基因OpZFP提高烟草耐盐性的研究

旨在研究C2H2型锌指蛋白在植物生长发育、非生物胁迫信号转导过程中的作用。前期从新疆无苞芥中克隆的一个单锌指基因Op ZFP,利用叶盘法将Op ZFP基因转入普通烟草中。半定量RT-PCR表明,在转基因植株中Op ZFP基因能够高效表达。烟草耐盐性分析显示,在高盐胁迫下,转基因植株的根长要长于野生型植株,且转基因烟草丙二醛(MDA)的含量要明显低于野生型植株;并且高盐胁迫处理,野生型烟草离体叶片叶绿素降解率高于转基因植株。这些结果表明,过量表达Op ZFP的转基因植株可以提高植物对盐胁迫的抗性。     

过表达大豆类受体蛋白激酶基因RLPK2促进转基因拟南芥叶片的衰老北大核心CSCD

大豆RLPK2基因(GenBank登录号:AY687391)是一个编码N-末端富含亮氨酸重复序列的类受体蛋白激酶基因。为分析大豆RLPK2基因的功能,该研究以野生型拟南芥和大豆RLPK2基因过表达拟南芥植株为材料,通过农杆菌介导法转化野生型拟南芥,构建了大豆RLPK2基因过表达载体,分析了叶片衰老过程中叶绿素荧光参数、抗氧化酶活性及衰老相关基因表达量的变化。结果表明:(1)无论是野生型还是转基因拟南芥,随着叶片衰老进程的进行,光系统Ⅱ(PSⅡ)的最大光化学效率(F_(v)/F_(m))、PSⅡ实际光化学效率(Φ_(PSⅡ))、光化学淬灭系数(qP)和光合电子传递速率(ETR)均呈下降趋势,但后者下降趋势更明显;(2)激发压(1-qP)在叶片衰老前期的变化较为平稳,后期则急剧增加,且转基因型比野生型拟南芥增加更明显;(3)在叶片衰老的各个时期,转基因拟南芥叶片丙二醛(MDA)含量均显著高于野生型,而超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性均显著低于野生型;(4)实时荧光定量PCR检测结果表明,RLPK2转基因拟南芥中衰老标志基因ATSAG12,衰老关键转录因子ATNAP、ATWRKY6和叶绿素降解关键酶编码基因ATACD1表达量显著上调。综上认为,大豆类受体蛋白激酶基因RLPK2参与调控植物叶片衰老进程,其表达对叶片衰老具有促进作用。