苏云金芽孢杆菌Rpp02菌株cry1Ac20基因的克隆及表达

Rpp02菌株是本实验室分离的一株对鳞翅目等多种害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌莫里逊亚种 (Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni), 经PCR检测,它含有cry1Ac基因。对其基因组DNA进行PCR扩增,得到大约4 kb的产物。测序结果表明,该片段含有一个较大的ORF框,基因编码区为3 534 bp,编码1 177个氨基酸,分子量为133.144 kD,pI 4.952, 为弱酸性蛋白质,亮氨酸（Leu）、丝氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）3种氨基酸含量最高,分别为8.0%、7.8%、7.7%。该基因序列与cry1Ac序列同源性达到99%,并被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry1Ac20。生物测定表明,该基因在大肠杆菌中得到了表达,表达产物具有较强的杀虫效果,试喂菜青虫48 h后,校正死亡率为88.78%。     

阿维菌素和哒螨灵亚致死剂量对土耳其斯坦叶螨实验种群生命表的影响

为了了解阿维菌素和哒螨灵对土耳其斯坦叶螨Tetranychus turkestani Ugarov et Nikolski实验种群的亚致死效应, 为新疆土耳其斯坦叶螨的综合防治提供理论依据, 我们在室内通过叶碟饲养的方法, 利用生命表技术研究了阿维菌素和哒螨灵亚致死剂量对土耳其斯坦叶螨实验种群成螨和卵的影响。结果表明: 阿维菌素和哒螨灵LC₂₀、LC₁₀剂量处理成螨后, 可使成螨的产卵量、平均寿命和卵孵化率显著降低; 卵期、幼螨期、若螨期和产卵前期明显延长, 而成螨期和雌螨寿命又明显低于对照; 对次代种群的影响表现在净生殖率(R₀)、 周限增长率(λ)降低、生存率和平均每雌日产卵率明显降低, 内禀增长率（r_m）由0.37降低至0.17～0.29, 平均世代历期(T)除阿维菌素LC₂₀处理时长于对照外, 其他处理均低于对照, 种群倍增时间(Dt)延长。两种药剂亚致死剂量处理卵后, 内禀增长率（r_m）由0.32降低至0.11～0.22, 净生殖率(R₀)降低, 平均世代历期(T)和周限增长率(λ)降低, 而种群加倍时间(Dt)增长; 幼螨期、若螨期和产卵前期明显长于对照, 成螨期和雌螨寿命显著低于对照; 生存率和平均每雌日产雌率明显降低。这些结果证明, 在亚致死剂量下, 阿维菌素和哒螨灵能够降低土耳其斯坦叶螨种群的发育速率, 这对土耳其斯坦叶螨的综合防治策略的制定有积极意义。     

共生菌Cardinium对朱砂叶螨的生殖调控作用

为了了解共生菌Cardinium对朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus (Boisduval)的生殖调控作用,从检测到感染Cardinium的种群中选取山西运城和甘肃兰州2个感染率较高的种群作为实验材料,对Cardinium在寄主生殖调控方面的作用进行研究。通过人工培养100%感染Cardinium的种群和100%不感染的种群,并从中挑取不同感染类型的雌雄螨单独进行杂交实验,设立感染Cardinium(♀)×感染Cardinium(♂),感染Cardinium(♀)×不感染(♂),不感染(♀)×感染Cardinium(♂),不感染(♀)×不感染(♂) 4种杂交组合。结果发现,抗生素处理后不感染的雌螨和受感染雄螨的交配表现出了单向的胞质不亲和,而且2个种群表现出了2种类型：在山西种群不亲和的组合中,CI表现为卵孵化率显著降低,多数雌螨都产生出F₁雌螨后代,但是F₁代雌螨数量相对于其他3种组合明显减少; 而在甘肃种群不亲和的组合中则表现为卵全部孵化且幼螨100%存活,但全部为雄螨后代。2个种群中Cardinium的亲缘关系非常相近,而它们却能够在不同的地理种群中表现出不同的CI表型,这提示亲缘关系非常接近的品系也可以产生不同的表型。研究结果为深入揭示Cardinium的感染机制和生殖调控作用提供重要基础。     

Wolbachia感染对拟澳洲赤眼蜂寿命、生殖力和嗅觉反应的影响

研究了通过共享同一寄主卵,短管赤眼蜂Trichogramma pretiosum体内共生的Wolbachia被水平传递到拟澳洲赤眼蜂T. confusum体内后,Wolbachia对新宿主拟澳洲赤眼蜂的影响。结果表明： Wolbachia的侵染能使拟澳洲赤眼蜂进行不完全的产雌孤雌生殖,增加拟澳洲赤眼蜂子代雌性比例,但却导致了雌蜂寿命缩短和繁殖力降低的生理损失。Wolbachia感染的当代处女蜂及其建立的种群连续5代(F₁～F₅),其子代雌蜂百分率分别为79.17%、76.60%、68.66%、72.58%、68.15%和64.06%,基本上呈现出逐代降低的趋势,并越来越接近对照的63.85%。处女蜂及F₁～F₅代雌蜂的平均寿命分别为4.33、5.50、5.60、6.68、7.32和7.50天,而未感染交配雌蜂寿命为7.59 天;处女蜂及F₁～F₅代雌蜂平均产卵量分别为11.33、70.00、86.41、93.90、102.92和124.38粒/雌,除F₅代外,均显著低于未感染交配雌蜂的产卵量134.81粒/雌。用四臂嗅觉仪测定了Wolbachia新宿主拟澳洲赤眼蜂对寄主小菜蛾的嗅觉反应,结果表明Wolbachia的侵染具轻微干扰拟澳洲赤眼蜂嗅觉反应的负面影响。未感染Wolbachia的拟澳洲赤眼蜂及Wolbachia供体短管赤眼蜂对寄主小菜蛾具较强的嗅觉反应,其雌蜂在小菜蛾腹部鳞片正己烷提取液和小菜蛾卵表正己烷提取液处理区内滞留时间显著或极显著长于对照区。而感染Wolbachia的拟澳洲赤眼蜂F₂代和F₃代雌蜂,尽管在小菜蛾腹部鳞片正己烷提取液处理区内滞留时间比对照区长,但没有达到显著水平;其F₂代雌蜂在小菜蛾卵表正己烷提取液处理区内滞留时间与对照区相比,也没有达到显著水平。随Wolbachia在拟澳洲赤眼蜂种群中垂直感染代数的增加,拟澳洲赤眼蜂对寄主小菜蛾的嗅觉反应恢复正常,在Wolbachia感染后的 F₄～F₆代,雌蜂在两种提取液处理区内的滞留时间均显著或极显著长于对照区。     

感染稻水象甲的Wolbachia基因组中插入序列的鉴定与分析

共生细菌Wolbachia对宿主的生殖起多种调控作用。以往研究表明, Wolbachia基因组中广泛存在插入序列(insertion sequence, IS), 它们对宿主基因组的可塑性、 多样性和进化起重要作用。稻水象甲Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel在东亚是一种外来水稻害虫, 在原产地北美营两性生殖, 而在所有入侵地均营孤雌生殖。本研究采用PCR法从河北唐海孤雌生殖型稻水象甲体内克隆获得了Wolbachia的2条IS序列, 即ISWosp4和ISWosp6; 从美国德克萨斯州两性生殖型稻水象甲成虫体内克隆获得了Wolbachia的2条IS序列, 即ISWosp3和ISWosp5。碱基序列比对显示: ISWosp3和ISWosp4属于IS3家族IS3组成员, ISWosp5为IS4家族IS231组成员, ISWosp6为IS5家族IS1031组成员。对这些IS的ORF结构、 所编码氨基酸序列的结构等进行了分析, 推测ISWosp5具有潜在转座活性。所得结果增进了我们对Wolbachia IS3, IS4和IS5家族插入序列的认识, 同时为今后从IS的角度探讨Wolbachia与稻水象甲生殖的关系奠定了基础。     

棉铃虫性染色体两种分子标记的克隆及序列分析

为了建立棉铃虫Helicoverpa armigera性染色体的特异性分子标记,利用RAPD-PCR技术对雌雄棉铃虫基因组DNA进行筛选,从500种随机引物中筛选到1 条引物（Operon编号为AF-18）,可扩增出1条约450 bp 的雌性特异片段。经克隆测序并合成特异引物进行验证,表明该片段为棉铃虫雌性特异分子标记,位于W染色体上。利用家蚕、果蝇等昆虫Kettin基因序列,克隆了棉铃虫的同源基因HaKettin片段,并采用荧光定量PCR技术,以棉铃虫的DH-PBAN基因为参照基因,检测棉铃虫雌雄不同个体间HaKettin基因与DH-PBAN基因的拷贝数之比,结果表明：雄体HaKettin∶DH-PBAN=1.0,雌体HaKettin∶DH-PBAN=0.5,据此推断HaKettin基因位于棉铃虫Z染色体上。     

棉铃虫P450基因CYP6AE12和CYP9A18的克隆与mRNA表达水平

采用RT-PCR和RACE技术克隆到2个新的棉铃虫细胞色素P450基因：CYP6AE12和CYP9A18。CYP6AE12的cDNA编码区长1 569 bp,编码523个氨基酸;CYP9A18的cDNA编码区长1 590 bp,编码530个氨基酸。用实时定量PCR技术分析了这2个基因在棉铃虫YS敏感品系和YS-FP抗性品系(由氰戊菊酯加辛硫磷混剂筛选YS品系而得) 6龄幼虫脂肪体和中肠中mRNA的表达水平。结果表明：CYP6AE12和CYP9A18的mRNA表达具有组织特异性,CYP6AE12在脂肪体中表达量较高,而CYP9A18在中肠中的表达量较高。与相对敏感品系YS相比,CYP6AE12在YS-FP抗性品系中肠和脂肪体中的mRNA表达量分别为YS品系的3.6倍和1.3倍;CYP9A18在YS-FP品系中肠和脂肪体的mRNA表达量分别为YS品系的0.3倍和1.0倍。CYP6AE12的过量表达与YS-FP品系棉铃虫的抗药性可能有一定关系。     

棉铃虫细胞色素P450 CYP6B7基因的克隆与融合表达

细胞色素P450 CYP6B7被推测与棉铃虫Helicoverpa armigera对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性有关,但至今尚无CYP6B7参与杀虫剂代谢方面的直接证据。为揭示CYP6B7的代谢功能,作者以棉铃虫幼虫基因组DNA 为模板,以CYP6B7基因设计特异性引物,扩增出包含321 bp内含子的CYP6B7基因。用反向PCR的方法消除内含子,获得包含完整的CYP6B7基因的开放阅读框。将CYP6B7基因与pMAL-c2X载体连接,并转化E.coli TB1细胞,在IPTG诱导下,CYP6B7能与载体基因编码的麦芽糖结合蛋白（MBP）在大肠杆菌中融合表达,表达产物经直链淀粉（amylose） 柱亲和层析分离洗脱后,得到SDS-PAGE电泳纯的融合蛋白。     

两近缘种烟草上棉铃虫种群适合度的比较研究

分别在室内和自然条件下,比较研究了普通烟草和黄花烟草两种不同寄主植物上棉铃虫生长发育、食物转化和利用及种群增长情况。结果表明： (1) 室内26±1℃、75%±5% RH和16L∶8D光周期条件下,与普通烟草相比,黄花烟草上幼虫的发育历期显著延长,1龄和2龄幼虫的存活率及雌蛾产卵量显著下降,种群净增殖率（R₀=30.5374）和内禀增长率（r_m=0.0951）减小;(2) 6龄幼虫对两种烟草的近似消化率及其相对生长率无显著差异,但对黄花烟草的利用率和转化率显著下降,相对取食量显著提高;(3) 第2代棉铃虫在普通烟田的种群增长（I=1.9922>1）比黄花烟田（I=1.1581>1）快,“烟草和其他”对种群起主要控制作用,特别是对低龄幼虫;第3代棉铃虫在普通烟田的种群增长有所减慢但仍呈上升趋势（I=1.5994>1）,而在黄花烟田则呈下降趋势（I=0.6434<1）,低龄幼虫受烟草抗性和雨水等的影响较大,高龄幼虫被病菌感染的数量增多。这些结果表明,与普通烟草相比,黄花烟草不适合棉铃虫种群的增长和繁殖。     

转Bt基因水稻对稻纵卷叶螟幼虫体内三种保护酶活性的影响

用转Cry1Ab/Cry1Ac基因水稻的叶片饲喂稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis (Guenée)幼虫,采用酶活力测定方法研究了转基因水稻对稻纵卷叶螟幼虫体内3种保护酶（SOD,CAT和POD）活性的影响。结果表明：取食转基因水稻叶片4 h后,幼虫体内SOD酶活性比对照提高了91.5%,与对照有显著差异;36 h后活性达到最大值,但与对照差异不显著。取食转基因水稻叶片24 h后,幼虫体内CAT酶活性达到最大值且高于对照,但与对照差异不显著;48 h后酶活性受到显著抑制,与对照差异显著。取食转基因水稻叶片12 h后,幼虫体内POD酶活性达到最大值,与对照差异不显著;48 h后酶活性逐渐下降达到最小值,比对照下降68.05%。实验同时测定了幼虫体内及其粪便中Bt毒蛋白含量的变化,结果表明取食转基因水稻叶片12 h后,随着大量取食进入体内的毒蛋白随粪便排出,幼虫体内的毒蛋白含量一直低于粪便中的含量,且在24 h时两者差异达到最大。由于Bt毒蛋白在幼虫体内的积累,扰乱了稻纵卷叶螟幼虫体内SOD,CAT和POD 3种保护酶的动态平衡,使虫体内自由基的清除遇到障碍,从而对其产生毒害作用。     

褐飞虱、白背飞虱的种内和种间效应

在室内条件下研究了褐飞虱,白背飞虱在3种类型水稻稻苗上的种内密度效应和种间互作效应,结果表明：在6－24头／盆若虫和2－6对／盆成虫的接虫密度范围内,褐飞虱,白背飞虱的种内密度效应均较弱,其中尤以褐飞虱的种内密度效应更弱,种内密度效应与水稻品种有关,在秀水11和协优9308上,白背飞虱的种内密度效应相对较强;褐飞虱在浙852和协优9308上表现一定的密度效应;褐飞虱和白背飞虱共存时种间在互利关系,其中尤以对白背飞虱有利,主要表现为两种飞虱的若虫存活率,成虫短翅率,单雌每天产卵量和后代虫孵化率在混合饲养时比一种飞虱单独饲养时均有不同程度的提高。     

转Bt cry1Ab基因水稻对稻田弹尾虫种群数量的影响

以转Bt cry1Ab基因水稻克螟稻1号(KMD1)和克螟稻2号(KMD2)及其亲本非转基因水稻秀水11(XS11)为材料,于2003年9月和翌春4月,调查了KMD1和KMD2对水稻灌浆期和收割后休田期稻田土表落叶层中弹尾虫种群数量的影响.结果表明,KMD植株表达的cry1Ab杀虫蛋白可在稻田环境中残留160 d以上;在水稻灌浆期采用吸虫器法在稻田落叶层中采集到灰橄榄长角跳虫(Entomobrya griseoolivata)和钩圆跳虫(Bourletiella christianseni)等2种弹尾虫,其中灰橄榄长角跳虫在KMD1和KMD2稻田中的种群密度显著高于XS11稻田;在水稻收割后休田期采用网袋法采集到灰橄榄长角跳虫、钩圆跳虫、球角跳虫(Hypogastrura matura)和等节跳虫(Isotoma monochaeta)等4种弹尾虫,其中转Bt基因水稻稻田中的灰橄榄长角跳虫和球角跳虫的种群密度显著高于XS11稻田,且其植株组织残体生物量损失率显著高于XS11.     

不同水稻品种上白背飞虱取食行为的EPG分析

【目的】为探明不同水稻品种（丰源优272、R9810-T、华恢1号、明恢63、麻糯谷和Rathu Heenati）对白背飞虱Sogatella furcifera的抗性差异机理,利用刺吸电位技术(electronic penetration graph, EPG)记录了该虫在这6个品种三叶期稻苗上的取食行为。【方法】结合特定的EPG波形,考察了9个非韧皮部指标和22个韧皮部指标。【结果】在总记录时间8 h内,白背飞虱在品种Rathu Heenati上非刺探波np的总时间最长,其次是麻糯谷上非刺探波np的总时间,这两者间差异显著且都显著地长于其他4个品种的np总时间(P<0.05);该虫在Rathu Heenati上路径波Nc的总时间为8 523.41 s,是感虫品种明恢63 Nc总时间的2.24倍;该虫在Rathu Heenati上吸食韧皮部汁液N4-b的总时间显著地比其他品种短(P<0.05)。华恢1号和R9810-T上所有的EPG指标和感虫品种明恢63的EPG指标都没有显著的差异(P≥0.05)。白背飞虱在丰源优272上单次分泌水溶性唾液N4-a的平均时间更长,并伴随长时间的韧皮部取食。【结论】由此推测,品种Rathu Heenati可能存在不利于白背飞虱取食的忌避成分,并且在韧皮部外组织和韧皮部组织都存在抗性因子;在麻糯谷上仅存在忌避成分;然而,品种华恢1号和R9810-T可能对白背飞虱不具有明显的抗性;丰源优272可能是比明恢63更为感虫的品种。结合介体昆虫取食行为与传播持久性病毒的关系,这些结果也为利用抗白背飞虱品种控制南方水稻黑条矮缩病提供了参考。     

转Bt基因水稻对两种弹尾虫及尖钩宽黾蝽捕食作用的影响

转Bt基因水稻KMD1、KMD2和对照水稻XS11稻田主要有两种弹尾虫：灰橄榄长角跳虫 Entomobryagriseoolivata (Packard) 和钩圆跳虫 Bourletiella christianseni Banks。两种Bt稻田中灰橄榄长角跳虫种群密度均显著高于对照XS11稻田;在以KMD1和KMD2腐烂 茎叶为食的灰橄榄长角跳虫成虫中检测到微量Cry1Ab杀虫蛋白。室内测定结果表明,不管是单 头捕食还是多头协同捕食,尖钩宽黾蝽Microvelia horvathi Lundblad 成虫对用3种供试 水稻残体饲养的灰橄榄长角跳虫的捕食量和功能反应均符合HollingⅡ型方程,其日捕食量、瞬 时攻击率（a）和处理时间（T_h）均无显著差异。     

水稻品种对白背飞虱的耐虫性反应及稻株营养成分的变化

测定了不同水稻品种对白背飞虱的耐虫性反应及稻株营养成分的变化。结果表明,中抗品种N22、绿源占1号、Mudgo、K89—B5和94D—22具有较高的耐虫性,抗虫品种Ptb33和中组74以抗生性为主,感虫品种秀水11、汕优63和感虫对照品种TN1不具有耐虫性,在白背飞虱为害后,耐虫品种稻株中全N量和可溶性总糖量增加,N／糖比变化率明显下降;而感虫品种的全N量和可溶性总糖量下降,N／糖比变化率明显增加,不同品种受害后体内大多数氨基酸含量均有不同程度的增加,但品种间氨基酸含量减少的种类不同,TN1品种只有丙氨酸含量减少,N22品种除丙氨酸外蛋氨酸和苏氨酸含量也明显减少,Ptb33品种仅精氨酸略有减少。     

几个粳稻品种抗白背飞虱的研究

本研究用苗期群体鉴定法对若干水稻品种进行了抗白背飞虱(Sogatella furcifera)比较测定,并探讨籼、粳稻品种抗性差异和粳稻抗性性质.结果指出:在供试“80079”,“中国91”、“盐粳2号”等粳稻品种上,白背飞虱生物学表现明显不同.粳稻抗性可分两类:(1)“80079”对白背飞虱取食、生存、发育没有抗生作用,对种群为害还表现有耐虫性;(2)“中国91”、“盐粳2号”对白背飞虱取食、生存、发育没有抗生作用,但却有一定的拒产卵机制,对种群为害还兼有耐虫性,从而能有效地抑制白背飞虱种群的建立.     

不同水稻品种对白背飞虱取食和产卵选择性的影响

为进一步了解抗虫品种对白背飞虱的抗性机制,运用标准苗期群体鉴定法、蜜露测定法等方法,研究了8个不同抗性水平水稻品种对白背飞虱Sogatella furcifera(Horváth)取食和产卵选择性的影响。结果表明,水稻品种IR54751-2-34-10-6-2、MR1532、Rathu Heenati表现为高抗;IR54742-1-18-12-11-2、IR71604-4-1-4-10-8-5-3-1表现中抗;IR72表现为中感;BG367-7、TN1表现为高感。白背飞虱对MR1532、IR54751-2-34-10-6-2和Rathu Heenati上的取食趋性较弱,这几个品种对白背飞虱取食量的影响最大;MR1532、Rathu Heenati和IR54751-2-34-10-6-2上的卵量显著少于产在对照品种TNI的卵量,IR54742-1-18-12-11-2、IR71604-4-1-4-10-8-5-3-1、IR72上的卵量与产在对照品种TNI上的卵量差异不显著。白背飞虱在抗虫品种上并非完全不取食,只是抗性越强取食量越少;抗性表现为抗的品种对白背飞虱成虫产卵选择性有明显影响。     

运用电子记录技术检测白背飞虱田间种群致害性

运用电子记录技术和蜜露量测定法,对浙江富阳和安徽长丰的白背飞虱田间种群进行了致害性检测.结果表明,在2、4和6h3种记录时间处理下,在感虫对照水稻品种TaichungNative1(TN1)和高抗白背飞虱水稻品种RathuHeenati(RHT)上,韧皮部取食时间的TN1/RHT比值相对稳定,将2h确定为电子记录检测白背飞虱田间种群致害性的较短记录时间.富阳的白背飞虱田间种群在N22(Wbph1)、ARC10239(ARC,Wbph2)、ADR52(Wbph3)、N'DiangMarie(ND,Wbph5)上分泌的蜜露量之间没有显著差异,且均显著低于在TN1上的;在ARC和ADR52上的韧皮部取食时间也没有显著差异,同时显著地短于在TN1上的.长丰的白背飞虱种群在N22和ARC上的蜜露量没有显著差异,在ADR52和ND上的蜜露量也不存在显著差异,但在前2个品种上的蜜露量显著高于后2个品种,在ADR52上的韧皮部取食时间(22.3min·2h^-1)也显著地短于在ARC上的(49.8min·2h^-1).浙江富阳的白背飞虱田间种群没有发生致害性的变化,而安徽长丰的白背飞虱田间种群则对N22和ARC产生了一定的适应性,有致害性变化的趋势.电子记录技术为快速、准确检测白背飞虱种群致害性及监测其变化提供了一种新的手段.     

水稻品种和施肥时间对单季稻田中白背飞虱卵被寄生率的影响

为明确水稻品种和施肥时间对白背飞虱Sogatella furcifera (Horvath)卵被稻飞虱缨小蜂Anagrus spp.寄生率的影响,采用产卵苗诱集法和田间双因子设计进行实验研究。与秀水11水稻品种相比,协优413品种上的白背飞虱卵块位置较高且卵块较大。诱集实验表明白背飞虱卵的被寄生率显著受用于诱集的产卵水稻品种的影响, 在协优413上所产卵的被寄生率（24%）显著高于秀水11上的相应值（12%）,而不受由田间品种和氮肥施用时间组合而形成的诱集苗所置放的栖境条件的影响。田间种植的水稻品种对其稻株上的白背飞虱卵被寄生率的影响大于施肥时间, 在卵高峰期,这种影响更为显著, 协优413上的被寄生率（17%）显著高于秀水11上的相应值（9%）。田间寄生率和诱集寄生率二者的反正弦平方根转换值间存在着极显著的直线相关。这些结果表明,水稻品种是加强白背飞虱自然生物防治的重要因子。