应用鸟枪法LC-MS/MS鉴定烟粉虱唾液蛋白

烟粉虱是一种刺吸式口器小型昆虫,每年对我国农业生产造成巨大危害。烟粉虱在取食植物时分泌多种唾液蛋白帮助其取食,同时唾液中的效应因子在调控植物防御反应过程中发挥重要作用。由于烟粉虱个体微小,唾液收集十分困难,有关其唾液蛋白的研究难以开展。本研究收集了3万头烟粉虱唾液,利用高精度Q-Exactive质谱,采用shotgun的方法首次鉴定了烟粉虱唾液中蛋白组分。应用双层膜收集装置收集到的烟粉虱唾液经浓缩等处理后其蛋白浓度约为1.698 g/L。唾液蛋白样品经胶内酶解、LC-MS/MS检测、序列分析,最终鉴定出42个烟粉虱唾液蛋白。功能分析表明烟粉虱唾液蛋白组分与蚜虫唾液蛋白组分具有一定的相似性,但多数蛋白为功能未知蛋白。通过质谱鉴定烟粉虱唾液蛋白组分为深入研究烟粉虱唾液蛋白的功能奠定了基础,有利于明确烟粉虱危害寄主植物的分子机制,为开发害虫防治新方法提供新思路。     

唾液成分在刺吸式昆虫与植物关系中的作用

近年来,人们对刺吸式昆虫唾液成分的研究,揭示出其在刺吸式昆虫与植物关系中的重要作用。对多数刺吸式昆虫而言,他们取食时会分泌胶状和水状两种唾液,其中胶状唾液会在取食早期分泌形成唾液鞘来围绕并保护口针,通过直接和间接的作用来帮助取食;而水状唾液中则包含了果胶酶、纤维素酶、多酚氧化酶、过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、蔗糖酶等组分,来帮助刺吸式昆虫对植物穿刺、消化食物、解毒次生物质并破坏植物的防御反应。有趣的是,唾液成分同时还可以诱导植物的防御反应,包括诱导植物的伤信号引起直接防御反应和诱导植物产生挥发物吸引植食者的天敌引起间接防御反应。并且,许多刺吸式昆虫取 食能够特异性地引发植物的病理反应,有研究推测刺吸式昆虫唾液中多聚半乳糖醛酸酶、碱性磷酸酯酶、蔗糖酶、多酚氧化酶等成分可能是某些植物特定病理反应的激发子,但是目前还没有定论,同时许多刺吸式昆虫唾液中的氨基酸和蛋白酶还是引起植物虫瘿的原因之一。 迄今的研究表明,刺吸式昆虫会根据不同的寄主植物和不同的生理需要,通过唾液组分的改变,来达到取食和发育的目的。对刺吸式昆虫唾液成分和作用机理的研究,可以为揭示刺吸式昆虫致害机理特别是传毒机理、指导害虫有效治理、阐明其与植物的协同进化等提供一定的思路。     

喷施吲哚-3-乙酸 (IAA) 对番茄及其上B型烟粉虱的影响

【目的】不同植物生长调节物质对植食性昆虫产卵、发育、取食等常有促进或抑制作用,进而影响植物与昆虫的互作关系。本研究旨在阐明常用的植物生长调节剂吲哚-3-乙酸对B型烟粉虱Bemisia tabaci (Gennadius)的影响,进而探索防治烟粉虱环境友好的方法,同时期望获得更加优质的烟粉虱用作替代寄主饲养寄生蜂。【方法】对番茄 Solanum lycopersicum L.植株外源喷施吲哚-3-乙酸(IAA),检测其生理生化的响应;记录B型烟粉虱存活率、产卵量并测量解毒酶等指标。【结果】喷施IAA后番茄叶片含水量略有上升,叶面积增大,叶绿素含量增加,过氧化物酶(POD)活性降低,多酚氧化酶(PPO)活性升高,超氧化物歧化酶(SOD)活性变化不显著(P＞0.05)。喷施IAA后番茄上B型烟粉虱成虫存活率高于对照组,其中50 mg/L IAA番茄上B型烟粉虱成虫存活率和总产卵量最高,250 mg/L IAA存活率最低;喷施IAA 120 h后烟粉虱总产卵量升高;碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)活性较对照升高。【结论】喷施不同浓度的IAA溶液后,番茄植株的生理生化水平发生不同程度的改变,烟粉虱成虫的存活状况、产卵量以及体内解毒活性也会产生不同程度的改变。适宜剂量的IAA处理能够使烟粉虱的生存表现更加优异,从而为饲养寄生蜂提供优质的替代寄主。     

烟粉虱MEAM1隐种漆酶-1基因全长cDNA克隆、序列分析与组织表达

多酚氧化酶是多种刺吸式昆虫唾液中的关键酶类,可以通过干扰寄主植物正常的氧化还原反应来调控食物来源使其更有利于昆虫本身。昆虫体内的漆酶-1属于多酚氧化酶家族,被认为参与昆虫取食过程中的金属离子代谢、降解植物次生有毒物质以及免疫防御等生理活动。为研究漆酶-1基因在烟粉虱MEAM1隐种Bemisia tabaci Middle East-Asia Minor 1组织中的功能,利用RACE技术首次获得了烟粉虱MEAMI隐种漆酶-1（laccase-1,lac-1）基因的cDNA全长序列,命名为Btlac-1 ( GenBank 登录号： JQ966215）。结果表明,该基因含有一个2 733 bp的开放阅读框,编码910个氨基酸,其编码产物含有3个Cu-oxidase功能域, 属于蓝多铜氧化酶家族成员。同源性比较分析表明,Btlac-1与黑尾叶蝉Nephotettix cincticeps和豌豆蚜Acyrthosiphon pisum的lac-1编码的氨基酸序列一致性达58%。Btlac-1在不同组织和发育时期的转录表达分析表明, Btlac-1在烟粉虱MEAM1隐种中肠中的转录水平最高,显著高于头胸部和腹部组织中,且在各个发育时期均有表达,在成虫期的表达水平较高。该结果为进一步明确lac-1在烟粉虱取食过程的生理作用奠定基础,也为探讨刺吸式昆虫与植物相互作用机制提供理论依据。     

广东首次发现Q型烟粉虱种群分布

烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)是全世界分布的刺吸式传毒昆虫,其中Q型烟粉虱自2003年首次在昆明一品红上发现以来,该种群已在全国10多个省份广泛传播,并有逐步取代B型烟粉虱的趋势。然而,作为较早对外开放的沿海省份,广东省一直未有Q型烟粉虱在田间分布危害的报道。本文利用常规PCR、特异B/Q型烟粉虱引物扩增及DNA测序技术,对近期在广州长湴公园扶桑寄主上采集的烟粉虱种群进行了分子鉴定,并对该种群与国内外其它Q型种群的系统发育关系进行了研究。结果表明,在广州长湴公园扶桑寄主上采集的烟粉虱种群为Q型烟粉虱,在660 bp的mtCOI序列中,该Q型烟粉虱与来自江苏、云南及浙江的Q型烟粉虱种群分别有1²个碱基差异;系统进化关系表明该Q型烟粉虱与江苏、云南的Q型烟粉虱最近,其种群的最初起源应为地中海西岸地区。相比B型烟粉虱,Q烟粉虱被认为具有更强的抗药性和传播植物病毒的能力,Q型烟粉虱在广东的首次发现,表明该烟粉虱种群已在广东野外定殖,其扩散动态、寄主范围及危害程度亟待实时监测。     

烟粉虱体内几种抗性酶对寄主转换的响应

将烟粉虱分别从嗜性较强的番茄植株上转移到嗜性相对较弱的国抗22(GK22)棉花、泗棉3号(S3)棉花和辣椒植株上,以及从嗜性较弱的辣椒植株上转移到嗜性相对较强的番茄、GK22棉花和S3棉花植株上,观察寄主转移后F1代、F2代和F3代烟粉虱体内α-NA羧酸酯酶、谷胱甘肽-s-转移酶和多功能氧化酶活性的变化,再将F4代烟粉虱转移到原寄主,同样观察这3种抗性酶的变化。结果表明,不同嗜性的寄主上烟粉虱体内3种酶活性的强弱与烟粉虱对这种寄主的嗜性相关,在嗜性较强的寄主上,3种酶的活性相对较低。烟粉虱从嗜性较强的寄主转移到嗜性相对较弱的寄主后,成虫体内α-NA羧酸酯酶、谷胱甘肽-s-转移酶和多功能氧化酶的活性显著上升,从嗜性较弱的寄主转移到嗜性较强的寄主后,羧酸酯酶和谷胱甘肽-s-转移酶的活性下降。在寄主转移过程中,烟粉虱体内的α-NA羧酸酯酶和谷胱甘肽-s-转移酶活性一般在F2代基本稳定,而多功能氧化酶在F1代就能迅速稳定。烟粉虱从过渡寄主再转移到原寄主的过程中,其3种酶的变化规律与上述寄主基本一致。结果提示,在烟粉虱寄主转换过程中,多功能氧化酶具有快速响应特性和较强的稳定性,而α-NA羧酸酯酶和谷胱甘肽-s-转移酶活性的变化与烟粉虱对寄主的适应度变化基本一致。     

刺吸电波图实验中金丝与烟粉虱的粘连技术

刺吸电波图(EPG)是用于研究刺吸式口器昆虫取食的电生理技术。实验中,昆虫粘连技术是一项非常关键的技术,直接影响实验结果。该文以烟粉虱Bemisiatabaci(Gennadius) ,为例,介绍了粉虱成虫和若虫粘连的具体步骤和注意细节,比较了不同粘连方法的优缺点。结果表明,冷冻法是粘连粉虱最好的一种方法。     

豇豆轻斑驳病毒CPMMV感染菜豆对B型烟粉虱寄主选择和生物学特性的影响

豇豆轻斑驳病毒（Cowpea mild mottle virus,CPMMV）的流行与其媒介昆虫烟粉虱Bemisia tabaci密切相关,但CPMMV感染寄主植物对B型烟粉虱寄主选择行为和生物学特性的影响尚不清楚。本研究探究了1）CPMMV感染菜豆Phaseolus vulgaris不同时间对B型烟粉虱寄主选择和产卵偏好性的影响;2）CPMMV感染菜豆对B型烟粉虱生物学特性的影响。结果发现：1）相较于健康菜豆,摩擦接种CPMMV后1周,B型烟粉虱却偏好在CPMMV感染的植株上停留和产卵;而摩擦接种后4周,B型烟粉虱却偏好在健康的植株上停留和产卵;2）无论是在摩擦接种后1周和4周的CPMMV感染植株上,B型烟粉虱在健康和CPMMV感染植株上的产卵量和存活率差异不明显。可见,CPMMV感染菜豆对于B型烟粉虱的寄主选择偏好性具有时间效应,而CPMMV感染菜豆对于B型烟粉虱的生物学特性没有显著影响。     

B型烟粉虱对23种寄主植物适应度的评估和聚类分析

本文利用前期开发的两个寄主植物适应度评估模型对B型烟粉虱能够完成发育的23种寄主进行了寄主适应度评估,并对评估结果进行了聚类分析,分析结果显示供试烟粉虱种群存在明显的寄主偏好性,黄瓜与甘蓝为嗜好寄主,繁殖力大,若虫成活率高,非常有利于烟粉虱的种群发育;而其它寄主在营养状况、物理性状及次生化合物的综合作用下,烟粉虱的寄主植物适应度变化较大且整体低于嗜好寄主,结果暗示烟粉虱的寄主生态位可能存在从核心到周缘的分层现象。比较了两个评估模型的分析结果,虽然在低层聚类中存在差异,但高层聚类的结果趋于一致。     

番茄褪绿病毒对MED烟粉虱成虫在不同寄主植物上的寄主选择性和取食行为的影响

【目的】由粉虱传播的番茄褪绿病毒(tomato chlorosis virus, ToCV)具有较强的暴发性和流行性,目前该病毒现已蔓延至世界各地,可为害多种作物,对农林经济生产造成严重危害。病毒侵染会影响介体昆虫的寄主选择性和取食行为,从而影响病毒传播。本研究旨在明确ToCV对MED烟粉虱Bemisiatabaci在不同寄主上的寄主选择性及取食行为的影响。【方法】利用Y型嗅觉仪测定携带和未携带ToCV的MED烟粉虱雌成虫的寄主选择性,利用刺吸电位(electrical penetration graph, EPG)技术比较携带和未携带ToCV的烟粉虱雌成虫在健康的番茄、辣椒、棉花和豇豆4种寄主植株上的取食行为差异。【结果】未携带ToCV的MED型烟粉虱雌成虫对于4种寄主植物的选择偏好性排序为番茄、辣椒＞棉花＞豇豆;携带ToCV烟粉虱雌成虫对4种寄主植物的选择性偏好性降低,排序为番茄、辣椒、棉花＞豇豆。与未携带ToCV烟粉虱雌成虫相比,携带ToCV烟粉虱雌成虫取食4种植物所产生的刺探次数均显著增加,第1次到达韧皮部的时间有明显延后,取食总时间与韧皮部的取食时间明显减少。【结论】ToCV使烟粉虱对寄主的选择偏好性和取食行为发生显著改变,从而增加了病毒在寄主植物间传播的可能。     

B型烟粉虱在6个烟草品种上的取食行为

【背景】不同烟草品种会影响B型烟粉虱的取食选择性,但具体的机制尚不明确。刺吸电波图（EPG）技术是研究刺吸式昆虫对寄主植物取食选择性的重要手段,通过烟粉虱取食产生的电信号,可以分析其对不同烟草品种的取食差异。【方法】应用EPG技术对B型烟粉虱雌成虫在6个烟草品种（翠碧1号、K326、闽烟7号、云烟85、云烟87、红花大金元）上的取食行为进行比较研究。【结果】6个烟草品种上有效记录的雌成虫数均为18头,在翠碧1号、K326、闽烟7号、云烟87、云烟85和红花大金元叶片上能够到达韧皮部的个体数分别为15、15、12、13、15和15头,能够持续吸食的个体数分别为13、14、8、12、14和15头。烟粉虱雌成虫在6个烟草品种上的非刺探（np）波所占的比例差异显著,在红花大金元上所占的比例最小,显著低于其他5个品种。雌成虫在红花大金元和K326上E1波的总持续时间显著短于闽烟7号和云烟87。雌成虫在红花大金元上E2波的总持续时间显著长于其他5个品种,而在闽烟7号、云烟87和云烟85上显著短于其他3个品种。【结论与意义】在6个烟草品种中,B型烟粉虱雌成虫最喜食红花大金元,最不喜食闽烟7号和云烟87。因此,在福建省B型烟粉虱的发生区,选择烟草品种时可根据实际情况减少红花大金元的种植,增多闽烟7号和云烟87等抗B型烟粉虱品种的种植。     

植食性昆虫唾液效应子和激发子的研究进展

植食性昆虫与寄主植物通过协同进化形成了复杂的防御和反防御机制。本文系统综述了昆虫唾液效应子和激发子在植物与昆虫互作中的作用及机理。昆虫取食中释放的唾液激发子被植物识别而激活植物早期免疫反应,昆虫也能从口腔分泌效应子到植物体内抑制免疫;抗性植物则利用抗性(R)蛋白识别昆虫无毒效应子,启动效应子诱导的免疫反应,而昆虫又进化出多种方式来躲避植物R蛋白的识别。总之,在这场军备竞赛中,昆虫的唾液成分决定着昆虫能否取食成功。取食过程中,咀嚼式口器害虫分泌大量酶类到植物体内,而刺吸式害虫则分泌胶状和水样唾液到植物中,它们都利用激发子和效应子去调控植物的免疫防御反应。分析现已报道的昆虫效应子发现其作用机制各有不同,具体表现为影响植物早期防御信号,调控植物激素通路及其他通路,或靶向小分子RNA通路。本文还综述了昆虫激发子的最新进展,揭示激发子可以通过诱导释放植物次生代谢物以及调控激素水平、Ca²⁺内流和活性氧爆发增强植物抗性。最后对昆虫效应子的分泌特性、寄主特异性和多功能性作了分析,并对无毒效应子及其对应的植物R基因,以及激发子的模式识别受体的研究进行了展望。     

B型烟粉虱为害烟草后对斜纹夜蛾成虫产卵和幼虫取食行为的影响

为明确外来入侵害虫B型烟粉虱取食诱导的烟草防御反应对斜纹夜蛾的影响,探讨其与斜纹夜蛾的种间竞争机制,在室内条件下研究了B型烟粉虱取食后的烟草对斜纹夜蛾成虫产卵选择、幼虫取食选择、拒食作用和其他取食行为指标的影响.结果表明:斜纹夜蛾成虫在B型烟粉虱为害后的植株上的落卵量较对照植株降低了40.9%.B型烟粉虱为害的虫体叶对斜纹夜蛾初孵化幼虫具有明显的驱避作用,而中间叶和系统白脉叶有一定的吸引作用,心叶不影响幼虫对寄主的选择性.B型烟粉虱为害叶片对斜纹夜蛾幼虫具有显著的拒食作用,虫体叶拒食作用明显大于系统白脉叶片.与对照相比,B型烟粉虱为害的虫体叶和系统白脉叶降低了斜纹夜蛾幼虫单位时间取食次数或取食比例,虫体叶还显著延长了幼虫开始取食时间,总取食面积显著减少.表明B型烟粉虱为害烟草对斜纹夜蛾成虫产卵和幼虫取食行为均产生不利影响.研究结果对了解烟田害虫种群变动规律和指导害虫治理具有较大意义.     

灰飞虱唾液腺三大解毒酶家族的转录组分析

灰飞虱Laodelphax striatellus （Fallén）是危害多种禾本科经济作物的重要刺吸式害虫。唾液腺对刺吸式口器昆虫取食植物尤其重要, 其分泌的唾液可以帮助刺吸式口器昆虫刺穿植物、 消化食物、 解毒植物的次生物质。细胞色素P450单加氧酶（cytochrome P450 monooxygenase, P450）、 谷胱甘肽S 转移酶（glutathione S transferase, GST）和羧酸酯酶（carboxylesterase, CarE）是昆虫主要的解毒酶系。为了分析解毒酶基因在灰飞虱唾液腺中的表达谱, 本研究对灰飞虱成虫唾液腺进行转录组测序、 重头组装和注释, 并与豌豆蚜Acyrthosiphon pisum和西方蜜蜂Apis mellifera的同源蛋白进行系统发育分析。发现有9个谷胱甘肽S 转移酶（glutathione S transferase, GST）基因、 22个羧酸酯酶（carboxylesterase, CarE）基因和39个细胞色素P450单加氧酶（cytochrome P450 monooxygenase, P450）基因在灰飞虱唾液腺中表达。通过对同源蛋白进行系统发育分析, 发现灰飞虱唾液腺大部分的CarE是参与消化/解毒和激素/信息素的加工, 而参与神经/发育的CarE很少; 灰飞虱唾液腺表达的P450基因远远少于豌豆蚜和西方蜜蜂基因组的P450基因数, 且只有CYP6和CYP4家族的成员; GST家族在3种昆虫的保守性最高。研究结果为灰飞虱对寄主植物和杀虫剂的适应性研究奠定了基础。     

MOLECULAR CHARACTERIZATION OF SOLUBLE AND MEMBRANE‐BOUND TREHALASES OF THE WHITEFLY,Bemisia tabaci

Trehalases (Tres) have been demonstrated to be the key enzymes that are involved in various trehalose‐associated physiological processes in insects. However, little attention has been devoted to the Tres in the whitefly, Bemisia tabaci. In this study, a soluble Tre (BtTre‐1) and a membrane‐bound Tre (BtTre‐2) were cloned in the invasive cryptic species Middle East‐Asia Minor 1 (MEAM1) of the whitefly B. tabaci complex. Alignment of deduced amino acids sequences of both BtTres revealed that they share common consensus regions and residues with Tres of other insect species. Levels of BtTres expression in various stages and tissues of the whitefly suggested that BtTre‐2 may play a key role in trehalose catabolism during development of the whitefly, especially for oocyte development, while BtTre‐1 may prevent trehalose in salivary gland from leaking and entering into plants along with saliva. Potential roles of trehalose catabolism in response to direct and/or plant‐mediated indirect effects of Tomato Yellow Leaf Curl China Virus (TYLCCNV) were also detected. Whiteflies feeding on virus‐infected tobacco plants showed higher BtTres expressions and accordingly higher BtTres activity but lower trehalose content than those feeding on uninfected plants. The enhanced trehalose catabolism may be beneficial to oocyte development in ovary and attenuate plant defensive responses induced by trehalose in saliva. Viruliferous and nonviruliferous whiteflies feeding on cotton, a nonhost plant for TYLCCNV, differed significantly only in trehalose content. The higher trehalose content in viruliferous whiteflies may be conducive to resisting the stress inflicted by TYLCCNV.     

昆虫唾液成分在昆虫与植物关系中的作用

近年来,人们对于植食性昆虫唾液的深入研究,揭示出其在昆虫与植物的相互关系和协同进化中起到非常重要的作用。植食性昆虫唾液中含有的酶类和各种有机成分,能诱导植物的一系列生化反应,而且这些反应有很强的特异性,与为害的昆虫种类甚至龄期有关。鳞翅目幼虫口腔分泌物（或反吐液）中含有的β-葡糖苷酶、葡萄糖氧化酶等酶类和挥发物诱导素等有机成分,已经证明可以诱导植物的反应; 刺吸式昆虫的取食也可以刺激植物产生反应,但其唾液内的酶类,如烟粉虱的碱性磷酸酶, 蚜虫的酚氧化酶、果胶酶和多聚半乳糖醛酸酶, 蝽类的寡聚半乳糖醛酸酶等是否发挥作用,目前还没有直接的证据。寄主植物对昆虫的唾液成分也有很大的影响,可能是昆虫对不同植物营养成分和毒性成分的适应方式。对昆虫唾液蛋白的分析表明,具有同样类型口器、食物类型接近的昆虫,唾液成分有更多的相似性。研究植食性昆虫的唾液成分,对于阐明昆虫和植物的协同进化关系、昆虫生物型的形成机理、害虫的致害机理,以及指导害虫防治等,有着一定的理论和实际意义。     

豌豆蚜唾液蛋白家族的克隆及在不同发育阶段的表达

豌豆蚜Acyrthosiphon pisum是一种重要的刺吸式害虫, 其分泌的唾液对取食寄主植物和传播植物病毒有重要的作用。为了探讨蚜虫唾液蛋白的功能, 本研究克隆了在豌豆蚜唾液腺高表达的一个未知功能的蛋白家族, 该家族包括13个基因, 编码14种蛋白, 其中4个基因在唾液腺高表达。这个家族是蚜虫特有的蛋白家族, 富含半胱氨酸, 有14个半胱氨酸高度保守, 其中6个半胱氨酸形成3个保守的CXXC结构域。通过与基因组比对, 发现这个家族的基因没有内含子, 分布在基因组的9个scaffold上。用半定量逆转录PCR检测了每个成员在豌豆蚜不同发育阶段的表达, 结果显示这个家族没有发育阶段特异性。推测这个家族的表达可能具有组织特异性, 有氧化还原酶或DNA甲基化酶的功能。     

钙肥对B型烟粉虱发育、存活及取食为害的影响

以清水为对照,研究了施用钙肥后一品红植株对B型烟粉虱发育、存活和取食为害的影响.结果表明:在温度(26±1)℃、相对湿度60％～80％条件下,钙肥处理的一品红植株上的B型烟粉虱在发育历期上与对照存在显著差异,卵期明显缩短,各龄若虫期延长,从卵到成虫的发育时间为20.18 d,而对照为18.72 d;但钙肥处理对B型烟粉虱各虫态的存活率无显著影响.B型烟粉虱的取食为害诱导了一品红叶片叶绿素荧光参数的变化,显著降低了叶片的光合作用能力,其中光化学效率(Fv/Fm)、光化学淬灭系数(qp)、光能利用效率(α)、最大光合速率(rETRmax)以及对光的耐受能力(Ik)显著降低,而非光化学淬灭系数(NPQ)显著增加.钙肥处理一品红受害叶片的光抑制参数(β)、rETRmax和Ik水平与对照相当.通过指甲油印迹法观察叶片下表皮细胞的形态结构发现,钙肥能有效增强叶片对B型烟粉虱为害损失的补偿.