藏酋猴精液深低温冻存的研究──不同的冷冻程序、冷冻稀释保存液冻存效果的比较

以存活率（ＳＲ）、复苏运动度（ＲＭ）、ＳＰＡ为精子活力检测指标，对四种冷冻程序ＰＳＦ、Ｈ３Ｐ、ＬＰ、ＭＤＰ和卵黄的、无卵黄的冷冻稀释保存液进行了藏酋猴（Ｍａｃａｃａ ｔｈｉｂｅｔａｎａ）精液冻存比较研究。 ＰＳＦ的ＳＲ为９０．１±１．９％，ＲＭ为６３．８±２．８％，显著高于其他三种冷冻程序（Ｐ＜０．０１）。卵黄冷冻稀释保存液（ＭＤＭ）的ＳＲ（９５． ４±１．３％）和ＲＭ（８８．０±１０．２％）显著高于无卵黄防冻液（ＦＣＳ－Ｇ／ＴＨ）的ＳＲ（９０．１±１．９％）和ＲＭ（６３．６±２．８％），但前者在复苏一小时后，ＲＭ（１２．５±１．６％）明显低于后者的ＲＭ（５４． ７±２． ２％）。用 ＦＣＳ～Ｇ／ＴＨ冻存的精液经 ＳＰＡ检测，其穿透率为新鲜精子的 ５１． ９％。结果提示：１）慢速降温冷冻程序适于藏酋猴精液冻存；２）卵黄冷冻稀释保存液能较好地保存藏酋猴精液的活动度；而无卵黄防冻液则有利于延长其冷冻精子的运动寿命。这可能与两者的稀释液及所含的脂蛋白不同有关。     

两种不同冻存保护剂对细胞冻存效果的比较

为比较甘油和二甲基亚砜这两种细胞冷冻保护剂对同一种细胞冷冻保存的效果,通过甘油和二甲基亚砜分别与血清、基础培养基的不同配比,进而比较二者对肿瘤细胞的冻存效果,并且分别探索出二者哪种用于细胞冻存效果更好和各自最佳冻存效果的比例。本文研究成果将为细胞冻存提供更明确的冻存方法。     

冻存密度对外周血单个核细胞冻存效果的影响

探讨冻存密度对外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)冻存效果的影响。设定新鲜PBMC组(F组)及3个PBMC冻存密度组即2.0×10~7/mL(A组),4.0×10~7/mL(B组),6.0×10~7/mL(C组)。通过对冻存前后的PBMC活率及复苏后多种细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-induced killer,CIK)的扩增倍数、淋巴细胞亚群、体外杀伤效率进行比较,验证其冻存效果。结果显示,冻存前F组与冻存后A组、B组、C组的细胞活率分别为(96.0±0.3)%、(95.6±0.4)%、(94.7±0.2)%和(94.9±0.4)%,B组与C组显著低于A组,P0.05;细胞扩增14 d后,F组与A组、B组、C组细胞扩增倍数分别为(156.4±18.2)倍、(160.2±28.4)倍、(126.1±19.8)倍和(110.4±11.3)倍,B组与C组显著低于F组(P0.05);PBMC冻存前复苏后淋巴细胞亚群结果无显著差异。与F组相比,A组、B组、C组细胞扩增14 d后,CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD56+、CD3+CD56+淋巴细胞亚群无显著差异(P0.05),体外杀伤效率无显著差异(P0.05)。过高的冻存密度会影响PBMC冻存效果而间接影响细胞的复苏应用,而过低的冻存密度则增加冻存体积而大大提高冻存成本,因此,选择合适的细胞冻存密度是细胞库或细胞银行必须要考虑的问题。     

细胞的冻存与复苏

1986年11月美国标准培养物保藏中心(ATCC)在上海举办了细胞系质量控制方法学习班,现将有关内容整理介绍如下,供大家参考。 冷冻时,细胞受损伤的程度因冷却速度的不同而异。快速冷冻,细胞内外液一起冻,细胞不失水;慢冻则细胞失水。 冷冻保护剂能保护细胞存活。加10％保护剂,细胞几乎100％存活;不加保护剂细胞几乎都不能存活。     

谷胱甘肽与富氢冻存液在鸡血细胞冻存中的保护作用

目的通过观察细胞冷冻复苏后的存活率及凋亡情况,探讨细胞冻存液中添加谷胱甘肽(GSH)和氢气(H_2)对细胞的保护作用。方法在冻存液中添加GSH和/或通入H_2后冻存鸡血细胞,1个月后复苏,采用台盼蓝拒染和MTT法分别检测细胞存活率与细胞活性,流式细胞仪检测细胞的凋亡率。结果 GSH、H_2或H_2+GSH处理使细胞活力明显提高,而早期凋亡率明显降低。结论谷胱甘肽与富氢冻存液对鸡血细胞冻存具有保护作用。     

有效冻存昆虫细胞的新方法

有效冻存昆虫细胞的新方法金立杰,薛伟钢,张士安（卫生部长春生物制品研究所,长春）近年来,昆虫细胞Ｓｆ９和Ｓｆ２１作为基因工程的宿主细胞,越来越多地应用于研究和生产中。昆虫细胞的有效保存成为应用中的一个重要问题。我们根据几年来的工作经验,摸索出简单有效...     

非人灵长类动物精子冻存技术的研究进展

随着生物医学技术的发展,应用非人灵长类动物模型进行基础科学研究日益广泛。与此同时,由于栖息地破坏、狩猎和基因隔离,许多非人灵长类动物濒临灭绝。因此,改进非人灵长类动物精子冻存技术对物种遗传资源的保藏具有重要的意义。本文概述了非人灵长类动物的精液特征,介绍了精液液化和冷冻精子质量评估的方法,分析了冷冻保护剂、冷冻稀释液及冷冻方法等因素对精子冻存效果的影响,总结了目前非人灵长类精子冷冻常用的冷冻保存液和冷冻方法,并对相关精子参数进行了比较,同时探讨了非人灵长类动物精子冻存研究面临的困境,并提出了可行的方案。总之,本文综述了近年来非人灵长类动物精子冻存的重要研究成果,对开发新的冷冻保护剂及改进冷冻技术具有一定的参考价值。     

胚脑神经元冻存和培养的研究进展

影响胚脑神经元冻存效果的关键因素有:冷冻保护剂及其浓度、降温和复温速率、储存温度等。以10％DMSO作为冷冻保护剂,以接近1—2℃/分的速率降温,37℃水浴中快速复苏,储存在液氮中,能较好的保证冻存神经元的存活率。冻存的胚脑神经元,培养后继续存活的细胞数比未经冻存的明显减少,但生长、分化情况却无显著差别,仍保持了神经元的形态学特征和特异性酶的表达及递质合成的功能,并能在宿主脑内继续生长、发育、发生整合。     

大肠杆菌感受态细胞培养与冻存条件的研究

测定大肠杆菌JM107在37℃培养条件下的生长曲线,制备其对数生长期不同阶段感受态冻存细胞,并对冻存细胞的转化率进行研究。结果显示：分离良好的单个新鲜菌落接种于50mlSOB培养基,经37℃,170～180r/min振荡培养210min左右,所得冻存细胞转化率最高,－7O℃保存时可达5．2×10⁷转化子／μgDNA且感受态保持时间长,即使存放两个月仍能保持相当高的转化率。－20℃保存时也能在三周内保持较高转化率。     

鮸鱼精子的生理特性及超低温冻存

通过测定精子的激活率、运动时间及寿命,研究了鮸鱼精子的生理特性,以0.5mL麦细管为冻存管、两步降温法超低温冻存鮸鱼精子。结果表明,鮸鱼精子激活与运动的适宜盐度为20~30、适宜pH值为5.5~9.0,适宜的KCl、NaCl、CaCl2溶液浓度分别为（500~600）mmol/L、（400~500）mmol/L、（300~400）mmol/L,适宜的葡萄糖溶液浓度为（800~900）mmol/L。无Ca2＋、Mg2＋及HCO3-的人工海水均能使鮸鱼精子激活,但运动时间及寿命有所下降。以Cortland溶液为稀释液,10%Gly、15%Gly、5%DMSO、10%DMSO、15%DMSO、10%EG、10%PG、15%PG及20%PG为抗冻剂,超低温冻存鮸鱼精子15d后,冻精的活力与鲜精相比无显著差异,其中,以10%Gly为抗冻剂冻存精子的效果最好,冻精的激活率、运动时间及寿命分别达（86.38±1.63）%、（8.24±1.37）min及（10.21±0.42）min。     

介绍一种少量冻存细胞复苏技术

液氮冻存后复苏细胞活力有所下降,有不少死亡细胞。特别是在冻存细胞数量较少时,如在单克隆抗体制备过程中为防止传代污染或变异而丢失杂交瘤细胞,随时冻存的少量细胞,复苏效果往往并不理想。除了加入饲养细胞有利于细胞生长等措施外,我们将常规的复苏技术加以改进。     

小鼠精原干细胞冻存后体外培养

目的:研究冷冻后精原干细胞体外培养时的生物学行为.方法:体外培养冻存后的6日龄小鼠生精上皮细胞,并利用碱性磷酸酶活性及细胞形态,检测其中的精原干细胞.结果:当有BRL饲养层时,冻存后的精原细胞在贴壁、存活及增殖等生物学行为方面与新分离的精原细胞均无明显不同.培养25～30 d,培养体系中仍保留有少量精原干细胞及其最初几代分化细胞.结论:冷冻保存后的精原干细胞能在BRL细胞饲养层上正常地贴壁、生长和分裂.     

液氮冻存丝虫微丝蚴成功的初报

液氮冻存丝虫微丝蚴的研究,国外有盘尾属丝虫、盂欧氏丝虫、斑氏丝虫、马来丝虫和犬恶丝虫等,国内尚未见有报道。本试验应用三种低温保护剂,对两种丝虫微丝蚴进行液氮低温保存的研究,获得初步成功,现简报如下:     

杂交瘤单克隆抗体研制中细胞的冻存与复苏

细胞的冻存与复苏是杂交瘤单克隆抗体(MCAb)研制中的一个重要环节.如果这个问题不解决,不但融合得不到成功,而且得到有价值的杂交瘤也会丧失掉.一、细胞的冻存在液氮中冷冻是保存杂交瘤细胞(或骨髓瘤细胞)最好的方法.在MCAb的研制中,一旦测得较有价值的阳性孔,就要一面进行克隆化,一面扩大培养,并冻存起来,以防体     

人参总皂甙应用及改善细胞冻存的研究进展

人参作为一种名贵的药材,具有多方面的作用,近年来关于人参的成分之一人参总皂甙的研究也越来越多。大量实验研究表明,人参总皂甙对改善细胞冻存方面也有很大的作用。组织细胞经深低温冷冻技术处理后其活性能获得有效的保存,在液氮(-196℃)温度下,细胞、组织内各种酶的活力及代谢很低,几乎为零,生命处于所谓的"停滞"状态,在该状态下细胞的活性能得到最大限度的保存。目前常用的冷冻剂有海藻糖、丙二醇、丙三醇以及二甲基亚砜等。但这些冷冻剂均属于化学药剂,在一定程度上会对纤维细胞造成损伤,从而影响细胞的活性。人参总皂甙是从人参中提取出来的有效成分,其具有增强人体表面细胞活性,延缓细胞衰老的作用,为此本文将对人参总皂甙用于细胞冻存的效果进行综述,旨在为细胞的冻存技术提供参考依据。     

BALB/C小鼠杂交瘤细胞冻存初探

自从Polge(1949)用甘油作为保护剂成功的冻存了Hela和L细胞以来,细胞冻存技术已日趋完善。本文对细胞株的冻存分别采用-70℃冰箱和常用的液氮深低温的方法。定期复苏,测定抗体效价,最后作染色体比较,至今已一年多,其结果令人满意。现将结果简要报告如下。方法1.细胞冻存:选择生长旺盛期,形态良好的细胞,按每ml细胞冻存液内含活细胞约1×106个,每支冻存管1ml。细胞冻存管置-20℃冰箱内15小时左右,分别放入液氮和-70℃冰箱内。经不同时期后取出作复苏及抗体效价比较。2.细胞复苏:取出冻存管,迅速浸入37℃水浴中,在1分钟内解冻后转种到已预制…     

真鲷精子的超低温冻存及DNA损伤的检测

因名贵经济鱼类育种或种质资源保存的需要,精子超低温冻存及冻精质量评价的研究已越来越引起研究者的重视。在海产鱼类中,已见对大黄鱼(Pseudosciaena       

马来丝虫微丝蚴超低温冻存技术的研究

本文应用超低温(-196℃)冻存马来丝虫微丝蚴成功。试验结果再次说明聚乙烯吡咯酮(PVP)低温保护剂的冻存效果优于二甲亚砜(DMSO)。表面作用剂吐温-80有增进两种保护护的冻存效力。低温保存中的冷平衡,在本试验中似乎没有影响。     

斑马鱼精子冻存与复苏实验方法与流程

斑马鱼是研究胚胎发育及其遗传机制的重要模式脊椎动物。目前人们已经积累了大量的突变体和转基因鱼系, 如何安全、妥善地长期保存这些品系是每一个研究斑马鱼的实验室都会面临的问题。精子冻存与复苏技术是目前最为简单有效的一种长期保存斑马鱼遗传品系的方法。应用这一技术不仅可以节省大量的鱼房空间与人力、物力, 使鱼系的使用与保存更加灵活和持久, 更重要的是能够防止珍贵鱼系的意外丢失, 为鱼系保种提供额外的保障。这类方法一般是通过体外挤出精子或研磨精巢获取新鲜的精子, 用适量的冻存液混匀后, 分装保存在液氮罐中。需要时可以随时通过体外授精的方法使精子复苏。经过30年的发展, 随着冷冻保护剂的不断改良和冻存与复苏条件的不断优化, 斑马鱼精子冻存与复苏技术已逐渐成熟。文章简单回顾了斑马鱼精子冻存与复苏技术的历史与发展, 并重点介绍本实验室自2005年以来常规使用的斑马鱼精子冻存与复苏的方法及具体流程。
补充资料 ：冻存与复苏实验指南 [视频]     

低温冻存对骨髓基质细胞生物学特性的影响

目的：探讨低温冻存对骨髓细胞和贴壁基质细胞生物学特性的影响。方法：取新鲜骨髓和经Dexter法培养14d的骨髓贴壁基质细胞(称“基质细胞”),经-196℃液氮冻存(前者称“冻存骨髓”,后者称“冻存基质细胞”)2周,复温,再用Dexter法培养这些细胞,检测细胞增殖、细胞形态、细胞化学染色、细胞表面抗原及基质细胞支持另一骨髓造血细胞形成的鹅卵石造血区(CAFC),长期培养起始细胞(LTCIC)的变化,比较冻存对骨髓细胞和基质细胞生物学特性的影响。结果：生长特性：冻存骨髓比新鲜骨髓、冻存基质细胞比新鲜基质细胞培养后融合成片的时间延迟,细胞增殖数比也有减低。细胞成分：冻存骨髓比新鲜骨髓形成的成纤维细胞、内皮细胞比率下降,而巨噬细胞和脂肪细胞比率升高,冻存基质细胞上述现象更明显：冻存后含凋亡小体的细胞在骨髓细胞和基质细胞内均有增加。细胞表面抗原：冻存骨髓、冻存基质细胞CD14、HLA-DR抗原表达百分率比新鲜骨髓、新鲜基质细胞高,CD45、CD33反之。支持造血：冻存前后骨髓和基质细胞支持形成的CAFC和LTC-IC,生长良好,无显著差异。结论：骨髓细胞和经培养生成的贴壁基质细胞,经冻存和复温,生物学特性有一定变化,但仍可以保留良好的支持造血重建功能。