Transgeni根癌农杆菌介导的小麦转基因植株再生(英文)

根癌农杆菌菌株Ａｇｌ Ⅰ的Ｔｉ 质粒ｐＵＮＮ－２ 带有Ｕｂｉ１ 启动子驱动的ｎｐｔ Ⅱ基因。７ 种基因型小麦幼胚或胚性愈伤组织用于农杆菌介导的转化实验。经过不同浓度巴龙霉素的筛选,３ 种基因型小麦产生抗性愈伤组织并再生植株。再生植株经ＰＣＲ 和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交鉴定为转基因植株,转化频率（ 再生转基因植株的小麦愈伤组织数／ 用于转化实验的愈伤组织数） 为３．７％ ～５ ．９％ 。小麦基因型及转化材料的起始生理状态是影响ＴＤＮＡ转移的重要因素。     

根癌农杆菌介导的水稻转化及转基因R1代植株表型特征

用根癌农杆菌介导的方法对２个粳稻品种和４个籼稻品种进行了转化。粳稻成熟胚和籼稻幼胚来源的愈伤组织用携带质粒ｐＧＩＨ的农杆菌ＥＨＡ１０１感染,对所有品种均获得较高的愈伤转化频率（２０．８３％～６２．３２％）。粳稻“申香粳４号”植株转化频率为１７．３９％,“秋丰”为９．２１％。４个品种籼稻中仅“超丰早１号”获得１株转化植株。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析、ＧＵＳ染色、Ｔ－ＤＮＡ整合边界序列分析等结果表明外源     

小麦组织培养再生系统及农杆菌介导的转基因技术研究

通过对晋麦47、鲁麦14、晋阳345、晋麦31等4个小麦品种的组织培养再生系统研究,结果表明,在MS基本培养基中加入Kao＇s有机化合物和T维生素后,小麦幼胚胚性愈伤组织诱导率提高31.4％～42.4％,植株再生能力提高50％～80％。对幼胚愈伤组织进行低温预处理和在农杆菌转化时添加AS处理后,经PPT筛选获得大量正常再生植物,PCR及Southern杂交检测证明其中28株再生植株呈阳性,这些植株明显提高了对basta的抗性。     

建立低能离子束介导小麦转基因方法并获得转GUS基因植株

研究了注入离子种类、能量、剂量等参数对于低能离子束介导的遗传转化的影响,建立了适于小麦成熟胚转化的组培条件和筛选程序。以携带ＧＵＳ基因的质粒为供体,进行了报告基因转化研究。分子生物学证据表明ＧＵＳ基因已整合到小麦基因组中。３个小麦品种的抗性愈伤转化率分别为９．５％、１０．８％、１１．２％,再生植株转化率分别为１．４％、３．４％、１．７％,首次证明了离子束介导小麦遗传转化是可行的,为离子束介导小麦遗     

农杆菌介导的玉米自交系愈伤组织转化条件的优化

采用农杆菌介导法,将外源基因导入玉米骨干自交系掖515和掖502胚性愈伤组织并再生玉米植株。在农杆菌浸染玉米胚性愈伤组织过程中,采取真空渗入、部分酶解和超声波处理,可以显著提高转化率。农杆菌浸染玉米胚性愈伤组织时,在50kPa下真空渗入5min,掖515和掖502胚性愈伤组织的转化率分别从6.3％和4.5％提高到8．7％和7．8％。愈伤组织在农杆菌浸染前,以0．2％离析酶酶解10min,掖515和掖502胚性愈伤组织的转化率分别提高到8.3％和8．9％。在农杆菌浸染时,以功率100W超声波处理90-120s,掖515和掖502胚性愈伤组织的转化率最高可达9．1％和9．4％。     

根癌农杆菌介导的苜蓿悬浮胚性愈伤遗传转化体系的建立与优化

苜蓿基因型是限制遗传转化的关键因素之一。本实验通过对7种苜蓿胚性愈伤组织诱导,筛选出一份具有高频再生潜力的基因型公农-1号,并以该基因型为转化平台探索和建立了一套高效的苜蓿遗传转化系统。分析了影响农杆菌共培养转化苜蓿悬浮胚性愈伤的因素,优化了悬浮培养条件,建立的超声波辅助农杆菌介导苜蓿胚性愈伤的遗传转化系统为：以下胚轴诱导的愈伤组织经悬浮培养得到的胚性愈伤为转化材料,乙酰丁香酮为100 μmol·L^-1、超声波处理时间8 s、卡那霉素筛选浓度30 mg·L^-1、共培养4 d,接种于选择培养基上进行筛选和再生。最终,获得了大量的转基因植株,分子检测证实目的基因-角碱蓬液泡膜型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因已经整合到苜蓿基因组中。     

缺体小麦与黑杂种幼胚愈伤组织再生植株的染色体变异

对中国春６Ａ缺体小麦与黑麦杂种幼胚愈伤组织不同无性世代再生植株体细胞染色体鉴定结果表明,随着愈伤组织培养时间的延长,再生植株染色体变异频率及变异范围明显增加。在分化的共计２２４株再生植株中,发生染色体变异的植株为８０株,占３５．７％,其中３株为染色体嵌合株,１株发生了染色体结构变异。     

农杆菌介导棉花大规模高效转化体系的研究

对农杆菌介导法转化棉花技术体系进行了综合改进,突破基因型的限制,使多品种或基因型(10个以上)的我国主栽棉花品种(系)转化成功,其中中棉所24号发展成为快速模式化转化品种(转化周期5～7个月,转化率8．1％),CCRI27、CCRI36等多个品种转化体系基本成熟。不同转化体系的愈伤组织诱导率为10％～40％,愈伤组织胚性愈伤诱导率达到10％～40％,转化率总体平均达到1．8％,并对大批量再生苗的鉴定予以程序化。实现棉花转基因规模化,达到年产转基因棉花植株2000～4000株以上的水平。     

苏云金杆菌内毒素蛋白基因转入葡萄胚性愈伤组织细胞及转基因…

以葡萄的胚性愈伤组织作为农杆菌介导,Ｔｉ质粒转化材料,利用共培养法将苏云杆菌内毒素蛋白基因转入葡萄胚性愈伤组织细胞,通过胚状体发生途径再生转基因植株。实验发现：８００μｍｏｌ／Ｌ的乙酰丁香酮诱导处理农杆菌和葡萄愈伤组织后可转将化效率提高５０倍。     

基因型和胚龄对小麦未成熟胚离体培养反应的影响

本文对34种基因型的小麦未成熟胚在离体培养中的反应进行了比较。结果表明,94％的供试基因型愈伤组织诱导率都可达到80％以上,若排除供体植株环境条件的不同和接种过程中的人为因素可能造成的影响,不同基因型的愈伤组织诱导率看来没有根本的差异。愈伤组织分化率因基因型的不同变动在0—60％之间,平均为32.7％。虽然同一基因型的盾片愈伤组织分化率在不同年份中有所不同,但是愈伤组织是否具有再生能力?看来是个稳定的遗传性状。因此小麦未成熟胚对愈伤组织诱导的反应和愈伤组织的再生能力可能具有不同的遗传基础。本文的结果还表明,虽然最适于培养的未成熟胚的大小为1毫米左右,伹小至0.3毫米的未成熱胚仍能以几乎100％的频率形成愈伤组织,60％左右的愈伤组织能分化出再生檀株,只是所需的时间比1毫米左右的胚较长。     

具有高再生性且对农杆菌敏感玉米自交系的筛选

以70个高代玉米自交系的幼胚为材料在NB培养基上进行离体培养,通过多次继代选择,从中筛选出了胚性愈伤组织诱导率高、克隆能力强的10个自交系,将这10个自交系的一部分胚性愈伤组织用作绿苗再分化,研究其再生能力;另一部分用农杆菌C58和GV3301转化,利用植物载体中携带的gus和g彦报告基因的瞬时表达为指标研究玉米基因型对农杆菌的敏感性。绿苗再分化结果表明,10个自交系都具有绿苗再分化能力,其中自交系6010、6038、6015、6051和6060的绿苗再分化力相对较高,分别为61．11％、31．94％、45％、33．33％和156．94％。gus瞬时表达率方差分析结果表明：玉米基因型对农杆菌C58的敏感性存在极显著差异,在自交系6034、6038的胚性愈伤组织上没有检测到gus瞬时表达,即这两个基因型对农杆菌C58不敏感,不能被其转化;其他7个基因型的平均gus瞬时表达率均大于70％,说明这7个基因型对农杆菌C58敏感。GFP荧光检测结果表明,在自交系6034、6038、6069和6010的胚性愈伤组织上没有检测到gyp瞬时表达,在其他6个自交系上检测到绿色荧光蛋白的表达。因此,认为自交系6015、6051和6060是对农杆菌GV3301敏感且具有高再生能力的玉米转基因受体材料;自交系6051、6010、6015、6060和6050是再生能力强且对农杆菌C58敏感的玉米转基因受体材料。     

小麦组织培养再生系统及农杆菌介导的转基因技术研究

通过对晋麦47、鲁麦14、晋阳345、晋麦31等4个小麦品种的组织培养再生系统研究,结果表明,在MS基本培养基中加入Kao′s有机化合物和T维生素后,小麦幼胚胚性愈伤组织诱导率提高31.4%～42.4%,植株再生能力提高50%～80%.对幼胚愈伤组织进行低温预处理和在农杆菌转化时添加AS处理后,经PPT筛选获得大量正常再生植物,PCR及Southern杂交检测证明其中28株再生植株呈阳性,这些植株明显提高了对basta的抗性.     

土人参的组织和单细胞培养及试管苗开花结实

以土人参的花梗、茎和叶片为外植体在ＭＳ培养基上诱导出愈伤组织,诱导率为７５％－９０％。愈伤组织经分化和生根培养再生了完整植株。由组织培养再生苗的幼茎诱导的愈伤组织建立悬浮系。由悬浮系分离的单细胞在２／３ＭＳ液体培养基中振荡培养或振荡培养３周后转入双层培养均再生了愈伤组织,再生率分别为０．２８％和０．４１％。愈伤组织在含有较低浓度６－ＢＡ的培养基上分化出苗。幼苗生长迅速,每３周扩增６．７倍,再生植株     

苏云金杆菌内毒素蛋白基因转入葡萄胚性愈伤组织细胞及转基因植株再生的研究

以葡萄的胚性愈伤组织作为农杆菌介导,Ti质粒转化材料,利用共培养法将苏云金杆菌内毒素蛋白基因转入葡萄胚性愈伤组织细胞,通过胚状体发生途径再生转基因植株。实验发现:80μmol/L的乙酰丁香酮诱导处理农杆菌和葡萄愈伤组织后可将转化效率提高50倍。OD值为0.8的农杆菌菌液稀释8—10信后与在G培养基预培养10天的胚性愈伤组织共培养2—3夭,Ti质粒对葡萄愈伤组织细胞的转化效率可达50%左右。筛选得到的转基因植株在含Km 30 mg/L的选择培养基上继代存活6个月,生长正常;提取叶片染色体DNA做Southern blot,杂交结果为阳性。将转基因植株各部分切段置于含Km 50 mg/L的选择培养基上,能够脱分化产生抗性愈伤组织并能增殖。     

农杆菌介导的雪花莲凝集素基因转入玉米骨干自交系

以农杆菌AGL0介导,将雪花莲凝集素基因转入玉米骨干自交系齐319和掖515胚性愈伤组织细胞,从筛选后的抗性愈伤组织获得再生植株。农杆菌浓度和共培养时间均能显著影响侵染后玉米愈伤组织的抗性频率。在农杆菌浓度OD600 0．2～0．3,共培养时间3d时,侵染后玉米愈伤组织的抗性频率最高,平均约4％。对再生植株及其子代基因组DNA的PCR及Southern杂交分析表明雪花莲凝集素基因已经整合到玉米基因组中,并遗传给后代。在蚜虫人工接种试验中,转基因植株上蚜虫的繁殖力为非转基因对照植株上的50％,这表明转基因植株抗蚜性显著增强。     

水稻悬浮细胞再生及根癌农杆菌介导转化的影响因素

已经成功报道的农杆菌介导的水稻遗传转化多以活力较高的胚性愈伤为材料,很少以水稻悬浮细胞作为受体．另外,利用农杆菌转化多数都是通过浸泡的方式进行侵染．本实验利用滴加浸染法进行农杆菌介导转化水稻悬浮细胞,探讨影响 DNA 转化效率的因素．研究显示,在转化前,将水稻悬浮细胞在愈伤诱导培养基上培养1～2周,诱导产生直径为2～3 mm的微小愈伤组织对转化非常重要.微小愈伤组织大小不应小于 2 mm;对悬浮细胞短时间培养不但会缩短植株再生时间,而且会提高转化效率．此外,侵染农杆菌的浓度、侵染时间和不同侵染方法也影响 T-DNA 插入基因组的效率．用 1 ml Ａ600值为 0.5 浓度的农杆菌悬液滴加在水稻悬浮细胞诱导的愈伤,培养3 d或直到可见农杆菌菌落,此方法可以得到较高转化效率．将再生的潮霉素抗性的转化植株在含有 50 mg/L 潮霉素的分化和生根培养基中筛选得到,并对转化植株 gus 基因的表达进行 PCR 检测.结果显示,用 Ａ600值为 0.5 浓度的农杆菌浸泡侵染 20 min和滴加浸染法,分别得到PCR阳性植株率为 70% 和92%.     

根癌农杆菌介导的水稻转化及转基因R1代植株表型特征

用根癌农杆菌介导的方法对２ 个粳稻品种和４ 个籼稻品种进行了转化。粳稻成熟胚和籼稻幼胚来源的愈伤组织用携带质粒ｐＧＩＨ 的农杆菌ＥＨＡ１０１ 感染,对所有品种均获得较高的愈伤转化频率（２０．８３ ％ ～６２ ．３２ ％ ） 。粳稻“申香粳４ 号”植株转化频率为１７ ．３９ ％ ,“秋丰”为９ ．２１％ 。４ 个品种籼稻中仅“超丰早１ 号”获得１ 株转化植株。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交分析、ＧＵＳ 染色、ＴＤＮＡ 整合边界序列分析等结果表明外源基因整合入植物基因组中。对Ｒ１ 代分析结果表明外源基因能遗传给后代,大多数株系的分离比符合３∶１ ,也有少数株系分离比异常。对转基因Ｒ１ 代水稻植株表型特征分析结果显示转化植株株高下降,每株分蘖数减少,每株籽粒数明显减少,部分植株播种至开花所需时间延迟。     

超声波辅助农杆菌介导CP基因转化番木瓜（Carioca papaya L.）的有效方法

本研究探索了通过农杆菌介导,超声波辅助处理,转化番木瓜胚性愈伤组织,获得转基因植株的有效方法。分别将含有日本PLDMV外壳蛋白基因(PTi-Epj-TL-PLDMV)和含有台湾PRSV菌株、美国夏威夷PRSV菌株、泰国PRSV菌株及日本PLDMV菌株的多元外壳蛋白基因编码序列(PT—NP—YKT)插入双元栽体质粒pGA482G,借助于农杆菌系LBA4404将双元载体上的外壳蛋白基因和新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)转移到番木瓜品种Sunset的胚性愈伤组织中,从而获得抗卡那霉素的转化再生植株。试验着重在转化方法上进行探索。结果表明,农杆菌过夜培养后,用高渗透压培养液(1／2MS 6％蔗糖 1％葡萄糖,pH5．7)调整至光密度OD600nm=15-0．20,然后用该菌液感染材料30min,其间辅以超声波处理,可以大大提高转化效率。用15ml无菌离心管装载胚性愈伤材料进行15s的超声波处理,在80块被转化的胚性愈伤中获得21个CP基因G转化系(26．3％),而在对照处理64块胚性愈伤中仅获得1个转化系(1．6％);在经过15s的超声波处理48块被转化的胚性愈伤中获得8个CP基因B转化系(16．7％),而在对照处理25块胚性愈伤中未出现转化系。上述操作方法用在两种CP基因转化上均表现出相似的效果。试验还表明：120mg／L是卡那霉素抗性筛选的最佳浓度。抗性筛选9个月后,在421块胚性愈伤组织中产生了42个抗卡那霉素的转化系。所获得的转基因植株分别用PCR和Southern印迹杂交进行了鉴定。     

根癌农杆菌介导的高羊茅遗传转化研究

采用携带卡那霉素抗性基因nptⅡ和Na^ ／H^ 反向运输AtNHX1基因的表达载体pROK2／AtNHX1(带有35S启动子)和pROK2U／AtNHX1(带有ubi1启动子)的根癌农杆菌AGL1和GV3101,对4个品种高羊茅下胚轴来源的胚性愈伤组织进行了遗传转化。胚性愈伤组织经根癌农杆菌感染和共培养后,用50～150mg／L巴龙霉素筛选抗性愈伤组织,获得1126棵再生植株,用10～20mg／L卡那霉素进一步筛选再生植株,总共得到525棵绿色抗性植株。抗性植株的总DNA用AtNHX1基因的特异引物进行PCR检测,其中21棵为PCR阳性,最高转化频率为1．77％。Southern杂交结果证实,外源基因以低拷贝整合到高羊茅的基因组中,实验发现,在不同品种之间转化效率有所差异。     

普通小麦品种Alondra＇s遗传转化体系的建立

小麦（Triticum aestivum）幼胚愈伤组织的诱导和分化再生有高度依赖基因型特征。为了建立和优化Alondra’s的高效再生及遗传转化体系,为小麦遗传转化提供更多的受体基因型,以Alondra’s的幼胚为外植体,研究了培养基种类、不同激素配比等对其幼胚愈伤组织诱导及再生的影响。结果表明,在使用N6培养基时,添加3mg·L^-1的2,4-D并附加1000mg·L^-1的CH对愈伤组织的诱导效果较好;添加4mg·L^-1的ZT、不附加IAA对愈伤组织的分化效果最好。通过构建植物表达载体pCAMBIA1301-220.6,利用基因枪法将HYG基因导入Alondra’s幼胚愈伤组织中,以建立Alondra’s的高效遗传转化体系。结果在含100mg·L^-1潮霉素的选择培养基上进行筛选、分化,获得了30棵抗性植株。经PCR检测,其中5株为阳性转基因植株,转化率为0.5%。Alondra＇s遗传转化体系的建立丰富了小麦遗传转化的基因型,为小麦品种的转基因改良和在不同背景下研究基因的功能奠定了良好的基础。