油茶FAD2基因的植物表达载体和RNA干扰载体构建及其功能分析

茶油是从油茶种子中提取的食用植物油,富含油酸、亚油酸以及亚麻酸等多种人体必需的不饱和脂肪酸。在植物的不饱和脂肪酸生物合成途径中,脂肪酸脱饱和酶(Fatty Acid Desaturase,FAD)有多个家族成员,可以将单不饱和脂肪酸转化成多不饱和脂肪酸,其中FAD2可以将油酸(18∶1Δ9)和棕榈油酸(16∶1Δ9)转化成亚麻酸(18∶2Δ9,11)和十六碳二烯酸(16∶2Δ9,11)。为了揭示油茶FAD2基因的功能,本研究在原有的基础上构建了这个基因的植物表达载体p BI121-Co FAD2以及RNA干扰载体p BI121-Co FAD2 RNAi,并分别对相应的拟南芥突变体和野生型植株进行了转基因研究。结果表明,同野生型相比,fad突变体中,18∶1和16∶1含量较高,18∶2和16∶2含量较低;突变体植株经过植物表达载体的转化后,脂肪酸组分得到了恢复;而野生型植株经过RNA干扰载体的转化后,18∶1和16∶1含量升高,18∶2和16∶2含量降低。由此说明,油茶FAD2基因在植物体内具有调控18∶1和16∶1转变成18∶2和16∶2的功能,对于茶油脂肪酸组分的构成起着关键的调控作用。     

琉璃苣BoD6D载体的构建及转化

运用植物基因工程手段构建琉璃苣BoD6D转化载体,为提高油料作物油份中γ-亚麻酸含量奠定基础。以琉璃苣基因组DNA为模板克隆BoD6D,构建酵母表达载体并转化酿酒酵母,对酵母进行诱导表达,提取脂肪酸后进行甲酯化反应,利用气相色谱分析脂肪酸含量;同时构建植物双元表达载体,经农杆菌介导通过蘸花法转化拟南芥,最后对转基因拟南芥通过抗性筛选及PCR进行鉴定。结果表明,BoD6D编码区不含有内含子,可以直接用于后续的功能研究;成功构建了酿酒酵母表达载体pYES2-BoD6D,气相色谱检测结果表明BoD6D在酵母中能够成功的将亚油酸催化生成γ-亚麻酸;成功构建了植物双元表达载体pBI121-BoD6D,卡那霉素抗性筛选和PCR鉴定结果表明已经成功获得BoD6D的拟南芥转化植株。通过以琉璃苣基因组DNA为模板比较方便的获得有功能的BoD6D用于转基因植物研究。     

同步抑制FAD2与FatB基因提高烟草种子油酸组分含量的研究

该研究以烟草品系NC89的无菌苗叶片为受体材料,采用前期构建的能同步抑制种子中FAD2(Δ12-油酸去饱和酶基因)与FatB(酰基转移酶基因)表达的RNAi载体,通过农杆菌介导转化获得了转基因烟草植株,分析转基因植株种子中的脂肪酸组分。结果显示:与对照相比,转基因植株种子中FAD2和FatB基因的表达水平分别降低了23%和11%;转基因植株种子的脂肪酸组分中,饱和脂肪酸棕榈酸和硬脂酸平均含量分别为8.02%和4.45%,多不饱和脂肪酸亚油酸平均含量为76.82%,较对照分别降低了2.91%、9.92%和3.47%;而转基因植株种子中单不饱和脂肪酸油酸含量高达7.48%,比对照提高46.38%。研究表明,同步抑制FAD2和FatB基因的表达能够显著提高烟草种子中油酸组分的含量,为进一步改良油料作物品质奠定了基础。     

酿酒酵母脂酰-?9脱氢酶亚细胞定位表达及其对烟草脂肪酸合成的影响

以烟草Nicotiana tabacum L.为宿主植物,分别在细胞质内质网和质体内定位表达酿酒酵母Saccharomyees cerevisiae脂酰-CoA-Δ9脱氢酶(ScΔ9D),以期提高植物组织中棕榈油酸(16∶1Δ9)的积累量和分析该酶不同亚细胞定位表达对油脂代谢的影响。与野生型和空载体(对照)植物相比,转基因烟草植株叶片中单不饱和的棕榈油酸及顺式十八碳烯酸(18∶1Δ11)含量明显提高,而饱和的棕榈酸(16∶0)含量相应减少,多不饱和的亚油酸(18∶2Δ9,12)和亚麻酸(18∶3Δ9,12,15)含量亦降低。ScΔ9D质体定位表达烟叶中棕榈油酸及顺式十八碳烯酸含量分别是ScΔ9D细胞质内质网定位表达烟叶的2.7和1.9倍。这表明酵母脂酰-Δ9脱氢酶能在高等植物细胞中正确催化棕榈酸(16∶0)转化为棕榈油酸(16∶1Δ9),而且在质体内表达的效应显著高于在细胞质内质网上的效应。新建立了一种应用脂酰-CoA-Δ9脱氢酶代谢工程培育植物组织高水平合成积累棕榈油酸等ω-7脂肪酸的策略,有助于在生物量大的烟叶等营养器官中组装ω-7脂肪酸合成途径以生产优质生物燃油。     

酿酒酵母脂酰-△9脱氢酶亚细胞定位表达及其对烟草脂肪酸合成的影响

以烟草Nicotiana tabacum L.为宿主植物,分别在细胞质内质网和质体内定位表达酿酒酵母Saccharom,ees cerevisiae脂酰-CoA-△9脱氢酶(Sc△9D),以期提高植物组织中棕榈油酸(16∶1△9)的积累量和分析该酶不同亚细胞定位表达对油脂代谢的影响.与野生型和空载体(对照)植物相比,转基因烟草植株叶片中单不饱和的棕榈油酸及顺式十八碳烯酸(18∶1△11)含量明显提高,而饱和的棕榈酸(16∶0)含量相应减少,多不饱和的亚油酸(18∶2△9,12)和亚麻酸(18∶3△9,12,15)含量亦降低.Sc△9D质体定位表达烟叶中棕榈油酸及顺式十八碳烯酸含量分别是Sc△9D细胞质内质网定位表达烟叶的2.7和1.9倍.这表明酵母脂酰-△9脱氢酶能在高等植物细胞中正确催化棕榈酸(16∶0)转化为棕榈油酸(16∶1△9),而且在质体内表达的效应显著高于在细胞质内质网上的效应.新建立了一种应用脂酰-CoA-△9脱氢酶代谢工程培育植物组织高水平合成积累棕榈油酸等ω-7脂肪酸的策略,有助于在生物量大的烟叶等营养器官中组装ω-7脂肪酸合成途径以生产优质生物燃油.     

拟南芥精氨酸甲基转移酶SKB1基因的分离与功能鉴定

以哥伦比亚"生态型(Columbia ecotype)拟南芥(Arabidopsis thaliana)叶片为材料,采用RT-PCR技术,获得了拟南芥精氨酸甲基转移酶(SKB1)基因,该基因全长1 929 bp,将该基因克隆到原核表达载体pET28b上,并转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达大量目的蛋白,其表达量占菌体总蛋白的50%以上.通过切胶回收抗原的方法,制备了兔源AtSKB1多克隆抗体,同时构建了SKB1基因的正义表达载体pBI121-35S∷SKB1并转化拟南芥.Western检测结果显示,转基因植株的SKB1表达量显著增加,同时SKB1表达量增加的植株开花时间也明显提前,说明植株的开花时间与SKB1的表达量呈正相关.结果表明,拟南芥SKB1基因的过量表达可引起植株的早花,SKB1参与了植物的开花发育信号通路.     

辣椒ML基因植物表达载体的构建及其转化

为分析辣椒ML基因在抗辣椒疫病方面的作用,构建了ML基因的植物表达载体pBI121-ML,采用快速冻融法将表达载体导入农杆菌EHA105,并用农杆菌介导法转化辣椒感病品种B12,对得到的转化植株经PCR和RT-PCR分子检测,结果显示,获得了4个辣椒转基因株系.     

高羊茅FaCONSTANS基因的表达及功能分析

植物由营养生长向生殖生长转变过程中光周期调控起着重要的作用。CONSTANS (CO) 是光周期途径中的特有基因,为探讨高羊茅FaCONSTANS (FaCO) 基因响应日照长短从而启动植物开花的机理,利用实时荧光定量qRT-PCR技术分析在长日照、短日照、持续光照、持续黑暗条件下FaCO基因的表达水平。构建过表达载体p1300-FaCO,利用农杆菌介导法遗传转化拟南芥,构建沉默载体p1300-FaCO-RNAi遗传转化高羊茅。结果表明,FaCO基因的表达受光周期调控,与生物钟控制的昼夜节律相关。在长日照条件下FaCO基因促进拟南芥开花,且恢复拟南芥突变体开花表型。RNAi沉默FaCO基因的高羊茅转基因植株晚花或者一直处于营养生长阶段。本研究初步探究高羊茅FaCO基因对开花过程的调控,这将有助于更进一步了解该基因的生物学功能。     

抗虫双价基因表达载体的构建及微束激光转化植物研究

将苏云金芽孢杆菌伴孢晶体(Bacillus thuringiensis,Bt)蛋白的基因与反枝苋菜凝集素(Amaranthus retrojflexus agglutinin,ARA)基因构建成双价基因的表达载体,编码一种既能抗鳞翅目害虫,又能抗同翅目蚜虫的杀虫蛋白.把双价基因(Bt-BA)连接到原核表达载体pET28a和植物表达载体pBI121上,经过限制性酶切分析和PCR鉴定,结果表明:含有双价基因的原核和真核重组表达质粒均已构建成功.将该双价基因转入油菜,获得抗性小植株.     

紫苏DGAT1基因克隆及四尾栅藻表达载体构建

利用RNAiso Plus试剂盒提取紫苏总RNA,以其为模板采用RT-PCR方法扩增出紫苏DGAT1基因的cDNA编码区序列并构建克隆载体pMD-DGAT1,再将克隆载体pMD-DGAT1和pBI121空载体进行Xba I和BamH I双酶切,连接目的片段构建表达载体pBI121-DGAT1。结果显示,克隆得到目的片段长度为1 657 bp,与GenBank中紫苏DGAT1基因序列的最大同源性为97%,所构建表达载体pBI121-DGAT1双酶切得到的两条片段长度与连接前一致。结果表明,成功转化四尾栅藻并得到表达,转化后四尾栅藻的油脂含量较转化前提高近1倍。     

昆虫细胞制备AAV-ITR基因表达微载体

AAV-ITR基因表达微载体是只含有腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)倒置末端重复序列(Inverted terminal repeats,ITR)、基因表达顺式元件和目的基因,而不含有其他外源DNA序列的双链或单链DNA。本研究利用杆状病毒表达系统,制备得到两种重组杆状病毒Bac-ITR-EGFP和Bac-inrep,并将二者的P3代病毒共同感染昆虫细胞Spodoptera frugiperda(Sf9),抽提小分子量DNA,获得AAV-ITR-EGFP基因表达微载体,2×107的Sf9细胞抽提可以得到100μg AAV-ITR-EGFP基因表达微载体,核酸电泳显示AAV-ITR-EGFP基因表达微载体主要以单体和二聚体的形式存在。将AAV-ITR-EGFP基因表达微载体通过polyethylenimine(PEI)转染HEK 293T细胞,24 h后荧光显微镜观察有EGFP表达,48 h后达到高峰,转化效率达到65%。     

通用真核质粒表达载体的构建

利用真核基因表达调控的原理,以pSV2-dhfr为起始材料,构建了两个通用的真核质粒表达载体pMAML1-dhfr和pMAML2-dhfr,它们包含人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子调控元件,由两个转录方向相同或相反的表达单元组成.以荧火虫荧光素酶基因为报道基因,β-半乳苷酶基因为内对照,借助COS-7短暂表达系统,研究了它们对荧光素酶表达的影响,并比较了它们与出发载体pSV2-dhfr的相对强弱.     

麦冬OjRCA基因植物表达载体的构建

Rubisco活化酶(RCA)对光合关键酶Rubisco具有重要的调节作用.以植物表达裁体pBI121为基础,设计分别带有酶切位点Sma Ⅰ和Sac Ⅰ的一对特异引物,以麦冬叶片总RNA反转录得到的第一条cDNA链为模板,扩增得到目的基因OjRCA.用Sma Ⅰ和Sac Ⅰ双酶切目的基因及表达载体pBI121,回收后利用T4DNA连接酶连接,获得植物表达载体pBI121-OjRCA.通过冻融法将所获得的植物表达裁体导入根癌农杆茵EHA105菌株中,为该基因的功能鉴定及通过农杆菌介导法将OjRCA基因导入植物提高相关抗性提供参考.     

CMO,BADH双基因植物表达载体的构建

以pC1303质粒和pC1391质粒为基础,利用载体pBIUC和pBIB构建了分别有Ubi启动子、35S启动子调控的带有控制甜菜碱合成的CMO和BADH的植物表达载体pC1303-Ubi-CMO-35S-BADH,为进一步开展提高植物抗逆性基因工程提供了基础.     

一种双顺反子表达载体的构建及应用的研究

将表达载体pEC34中的一段寡核苷酸序列,其中包括翻译增强子序列、SD序列、终止码、起始码及两端的限制性内切酶位点,插入GST基因后,构建成双顺反子的表达载体．利用此载体表达了非融合的人骨形成蛋白2A(hBMP2A)和人骨形成蛋白3(hBMP3)C端肽段,将第一顺反子基因（GST基因）切小到原来的1／3时,则位于下游的第二顺反子基因编码的蛋白质在大肠杆菌中的表达量增加一倍。     

鸡输卵管特异表达载体的优化及体内表达

为了实现鸡输卵管特异表达载体在相应组织特异高产表达, 并简化质粒DNA的制备过程, 本研究在已经构建的鸡输卵管特异表达载体pOV1基础上进行了优化改造, 为进一步进行重组药物蛋白的暂态表达及转基因鸡研究奠定基础。首先用限制性内切酶将克隆在pOV1载体的鸡卵清蛋白基因5￠-和3￠-调控区切出, 同时克隆到切除neo基因及CMV启动子的pcDNA3.0载体, 构建成另一输卵管特异表达载体pOV2; 将鸡卵清蛋白基因5￠-调控区单独克隆入同样载体, 获得第三个鸡输卵管特异表达载体pOV3。为了检验三个输卵管表达载体驱动外源基因在鸡体内输卵管细胞中表达的有效性和特异性, 将LacZ报告基因分别克隆入pOV1、pOV2、pOV3中5'-调控区的下游, 获得的重组载体pOV1LacZ、pOV2LacZ和pOV3LacZ经聚乙烯亚胺包裹后, 经翅静脉注射产蛋鸡。用RT-PCR和酶活性检测法对LacZ基因在载体注射鸡体内的表达进行检测, 结果显示肝、脾、肾、心等组织中无LacZ基因的表达, 而输卵管膨大部不仅有LacZ基因的表达, 而且表达的重组酶能分泌到蛋清中, 雌激素注射对报告基因的表达具有促进作用, 其中pOV3LacZ的表达水平较高。这些试验结果表明, 鸡输卵管特异表达载体pOV3具有结构相对简单、表达水平较高、组织特异性较好等优点, 能用于鸡输卵管生物反应器的研制。     

AGPase基因植物表达载体的构建及对烟草的转化

将大肠杆菌BL21的AGPase基因定向连接在受体质粒pCAMBIA2301载体上,从而构建植物表达载体,转化烟草获得了转基因植株。经GUS组织化学染色、PCR、Southern blot以及RT-PCR鉴定证实,该基因已导入烟草基因组中。淀粉含量测定结果显示,转基因植株比非转基因植株淀粉含量平均增加了13.1%,由此验证了该载体构建的成功与可用性,为下一阶段用该载体转化木薯主栽品种提高块根淀粉含量的研究奠定了基础。     

鸡输卵管特异表达载体的构建及其体内表达

用高保真PCR法分别从中国狼山鸡基因组DNA中扩增出卵清蛋白基因(ov)的5′和3′调控区,将其克隆入pGEMT载体,经序列测定证明与已发表的ov基因相应区域无差异。将上述调控序列插入黏粒载体,构建成鸡输卵管特异表达载体pOV。再将lacZ报告基因克隆在上述载体5′调控区的下游,获得的重组载体命名为pOVlacZ。用脂质体包裹的pOVlacZ注射产蛋鸡,RTPCR检测结果表明lacZ基因仅在注射鸡输卵管的膨大部表达,不能在肝、脾、肾、心等组织表达。在上述组织中,仅输卵管膨大部能检测出β半乳糖苷酶活性(1167mUml),注射雌激素对报告基因的表达具有促进作用(1533mUml),重组酶能被分泌到鸡蛋的蛋清中(1733mUml)。结果表明,克隆的鸡ov基因调控区能有效驱动报告基因在输卵管的特异表达,构建的载体能用于鸡输卵管生物反应器的研制。     

猪白细胞介素-18基因克隆、序列分析及其真核表达载体的构建

采集6月龄河南良杂猪的脾脏,分离淋巴细胞后直接提取总RNA,进行反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增,扩增产物进行T-A克隆、测序,获得了河南良杂猪IL-18全基因序列,序列测定表明,plL-18全基因核苷酸长度为579bp,编码 192个氨基酸。与GenBank上已发表序列ABO10003进行比较,核苷酸同源性为99.8%,在第550位处 (以ATG为1计)由A→G,存在有意义突变。与GenBank下载读取的ABO10003、AF176949、AY262109、NM1997序列进行比较分析,氨基酸同源性分别为99%、98.5%和99.8%、99%。将该基因片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1,构建重组质粒pcDNA-ILl8m,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确,为核酸疫苗的研究应用奠定了基础。