鱼类远缘杂交正反交杂种胚胎发育差异的细胞遗传学分析

本文报道了鲤(Cyprinus carpio)×鲢(Hypophthalmichthys molitrix)、鲫(Carassiusauratus)×鲢、白鲫(Carassius auratus cuvieri)×鲢和鲢×鲤、鲢×鲫、鲢×白鲫的正反交试验。在鲤×鲢、鲫×鲢和白鲫×鲢3个正交组中,胚胎发育基本正常,尽管孵出的鱼苗绝大多数生命力弱,但孵化率都在50％左右;而在鲢×鲤、鲢×鲫和鲢×白鲫3个反交组中,胚胎发育均为畸形,不能孵化出苗。 胚胎发育细胞遗传学分析表明,鲤×鲢、鲫×鲢和白鲫×鲢的杂种胚胎几乎都是整倍体,而鲢×鲤、鲢×鲫×鲢×白鲫的杂种胚胎基本上是非整倍体,染色体数变化较大。这些正反交杂种胚胎发育的显著差异可能与其亲本物种间的基因组大小有关。文中还分析讨论了这些正反交差异与天然多倍体物种以及胚胎发育速度的相关性,认为天然多倍体物种可能具有一些不同于普通二倍体物种协调外源基因组的能力。     

二倍体鲫鲤F2产生不同倍性卵子的证据

在检测到鲫鲤F2产生3种不同大小(直径分别为0.13 cm,0.17cm和0.2 cm)类型的卵子基础上,进行了F2(♀)×红鲫(♂)及F2(♀)×四倍体鲫鲤(♂)的交配实验.通过染色体计数和流式细胞仪分析,在F2(♀)×红鲫(♂)后代中获得了四倍体、三倍体、二倍体鱼;在F2(♀)×四倍体鲫鲤(♂)后代中获得了四倍体和三倍体鱼.这两个交配组合后代中出现的不同倍性的鱼类为证明鲫鲤F2能产生三倍体、二倍体和单倍体卵子提供了进一步证据.F2(♀)×红鲫(♂)中雄性四倍体鱼的存在说明在四倍体后代中存在基因型为XXXY的个体.对上述两个交配组合后代的四倍体鱼和三倍体鱼的性腺结构观察表明四倍体鱼是可育的,而三倍体鱼是不育的.作者认为鲫鲤F2能够产生二倍体和三倍体卵子与核内复制机制和生殖细胞的融合有关.     

异源四倍体鲫鲤雌核发育后代及其亲本RAPD分析

异源四倍体鲫鲤是湖南师范大学鱼类发育生物学实验室和湖南湘阴县东湖渔场在红鲫(♀)和湘江野鲤(♂)的杂交后代中选育出来的四倍体鱼,目前已连续繁殖14代(F3-F16),已形成一个四倍体性能代代相传、遗传性状稳定的四倍体鱼群体,这是世界上唯一人工培育的两性可育的异源四倍体鱼[1—2]。利用四倍体鱼与二倍体白鲫、二倍体鲤鱼杂交,可获得生长快、肉质鲜美、抗病力强等优良性状的不育三倍体湘云鲫、三倍体湘云鲤[3],并已在全国28个省市推广养殖,取得了显著的经济和社会效益。异源四倍体鲫鲤雌性个体产生的二倍体卵子具有两套染色体,在没有染色…     

异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫和它们父母本线粒体DNA 12S rRNA基因遗传变异的分析

采用质粒克隆测序方法,获得了异源四倍体鲫鲤5个个体、异源四倍体鲫鲤雌核发育二倍体后代2个个体、三倍体湘云鲫2个个体及红鲫、湘江野鲤和日本白鲫各1个个体的线粒体DNA 12S rRNA基因的全序列。经对比发现,异源四倍体5个个体共享2种单元型,异源四倍体鲫鲤雌核发育二倍体后代2个个体、三倍体湘云鲫2个个体以及红鲫、湘江野鲤和日本白鲫各1个个体分别共享1种单元型。用MEGA 1.0 软件分析了它们的碱基组成和核苷酸序列差异,用邻接法构建系统进化树。它们间的序列同源性在95%~99%之间,异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫和它们母本（分别为红鲫和日本白鲫）之间的序列同源性大于异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫和它们父本（分别为湘江野鲤和异源四倍体鲫鲤）之间的序列同源性,结果表明：异源四倍体鲫鲤和三倍体湘云鲫在线粒体DNA 12S rRNA基因上具有母性遗传特征。本研究另一值得注意地方的是异源四倍体鲫鲤经过9代(F3-F11)繁殖后,在5个个体中发现了2种单元型,说明在四倍体基因库中存在遗传多样性,为四倍体基因库的繁殖、保护和种群复壮提供了一些有价值的信息。     

异源四倍体鲫鲤雌雄差异的RAPD标记

异源四倍体鲫鲤是从红鲫和湘江野鲤的杂交后代选育出来的,已经形成了一个遗传性状稳定的四倍体鱼新种群。用异源四倍体鲫鲤(雄性)和二倍体白鲫(雌性)生产的三倍体湘云鲫已经在全国推广应用。因此,如果能够了解异源四倍体鲫鲤的性别分化机制,人为地控制异源四倍体鲫鲤的性别分化,生产出大量的超雄鱼,这对于三倍体湘云鲫的产业化生产有重要的意义。刘少军等对异源四倍体鲫鲤的染色体组型进行了分析,并没有发现异源四倍体鲫鲤有明显的特化的性染色体,这说明通过细胞遗传学研究异源四倍体鲫鲤的性别遗传机制是有困难的。       

从ATPase8-6基因研究杂交多倍体鱼线粒体母性遗传

异源四倍体鲫鲤是世界上首例人工培育的两性可育并形成群体的且能自然繁殖的四倍体鱼。本文采用质粒克隆测序法测定了红鲫、异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫和三倍体湘云鲤的ATPase8和ATPase6基因全序列 ,结合鲤鱼、日本白鲫和斑马鱼的同源序列 ,对不同倍性水平鲤科鱼类的ATPase8和ATPase6基因进行了比较 ,分析了碱基组成、变异情况以及核苷酸和氨基酸序列差异。红鲫、鲤鱼、异源四倍体鲫鲤、日本白鲫、三倍体湘云鲫和三倍体湘云鲤之间的序列差异为 0 0 % - 1 3 4 % ,它们与外群斑马鱼之间的序列差异为 2 7 9% -31 0 %。用MEGA软件中的MP法、ME法、NJ法和UPGMA法构建分子系统树 ,得到了相似的拓扑结构。结果分析表明 ,人工杂交多倍体异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫和三倍体湘云鲤在线粒体ATPase8和ATPase6基因上具有严格的母性遗传特征。值得注意的是 ,异源四倍体鲫鲤经过 1 1代的繁育后 ,与其原始母本红鲫仍然保持了非常高的同源性 ,说明了新的异源四倍体基因库在线粒体ATPase8和ATPase6基因上拥有稳定的遗传特性。对不同倍性鲤科鱼类线粒体ATPase8和ATPase6基因的研究表明 ,ATPase8和ATPase6基因是杂交鱼后代遗传变异研究的一个很好的分子标记     

由鲤(Cyprinus carpio)和鲫(Carassius auratus)染色体组叠加构建的 两个单性人工多倍体克隆

具有天然雌核发育的多倍体杂种鱼可防止杂种优势的分离并保持其后代的杂种优势. 由于假设诱发的多倍体鱼类的生殖模式是天然雌核发育的, 我们进行了鲤鲫杂种的多倍体诱发, 目的是描述经染色体组叠加由有性鲤鲫二倍体转化为异源三倍体及异源四倍体克隆谱系. 鲤鲫杂种产生未减数而具有两亲本染色体组杂种卵子, 未减数的雌核可与入卵的雄核融合叠加形成三倍体合子. 鲤鲫异源三倍体胚胎发育正常, 部分异源三倍体雌性个体可产生未减数的、仍保留母本的三套染色体的成熟卵子. 绝大部分鲤鲫异源人工三倍体个体的成熟卵子的雌核不与入卵的雄核融合, 具有天然雌核发育特性. 异源三倍体卵子在入卵精子的激动下由雌核发育产生全雌后代, 并形成一个单性克隆系, 后代保留异源三倍体母本的形态特征, 并靠雌核发育的生殖方式形成异源三倍体克隆系. 极少数异源三倍体个体的成熟卵子的雌核可与入卵的雄核融合, 再通过染色体组叠加形成鲤鲫异源四倍体. 所有异源四倍体的雌性产生未减数的、含有4个染色体组的成熟卵子. 异源四倍体的成熟卵子保持雌核发育特性, 在近类的精子诱发下产生单性后代, 形成一个异源四倍体单性克隆.     

不同倍性鲫鲤鱼Dmc1基因cDNA的克隆 及其表达分析

酵母菌 Dmc1(disrupted meiotic cDNA)基因是一个在减数分裂前期Ⅰ表达的特异基因, 其产物是减数分裂同源染色体配对所必需的. 根据酵母菌、小鼠以及人的DMC1中保守氨基酸序列合成简并引物, 分别克隆了二倍体红鲫(Carassius auratus red var.)、湘江野鲤(Cyprinus carpio L.)、日本白鲫(Carassius cuvieri)、三倍体湘云鲫和异源四倍体鲫鲤Dmc1基因部分cDNA序列. 通过cDNA末端快速分离法(RACE)进一步获得了以上5种鱼Dmc1的cDNA全长, 其中红鲫Dmc1、湘江野鲤Dmc1和日本白鲫Dmc1全长均为1375 bp, 三倍体湘云鲫Dmc1全长1383 bp, 异源四倍体鲫鲤Dmc1全长1379 bp, 这5种鱼各自都编码342个氨基酸. 结果表明, 红鲫、湘江野鲤和日本白鲫的DMC1蛋白的氨基酸同源性高达97.3%, 说明DMC1蛋白在这3种鱼里具有高度保守性; 而三者与已知序列的人、小鼠和斑马鱼(Danio rerio)DMC1蛋白的氨基酸同源性分别为 86%, 86%和95%. 以分离得到的不同倍性鱼Dmc1基因编码区中完全相同的序列设计特异引物进行表达分析. RT-PCR结果表明, Dmc1只在性腺中表达, 在其他组织中不表达; 通过实时荧光定量PCR(real-time PCR), 对Dmc1基因在繁殖季节的二倍体红鲫, 三倍体湘云鲫, 四倍体鲫鲤性腺中的表达进行分析, 发现Dmc1在不同倍性鱼的性腺表达有差异, 在卵巢和精巢均表现为: 三倍体表达最高, 二倍体次之, 四倍体的表达最弱, 特别是在三倍体卵巢的表达远高于在二倍体和四倍体的表达. 同时, 对这3种鱼的性腺进行组织切片分析, 发现二倍体和四倍体鱼的性腺发育良好, 且四倍体成熟度高于二倍体, 而三倍体鱼性腺发育缓慢未达到性成熟, 特别是卵巢的发育相当不好. 由此可见, 在不同倍性鲫鲤鱼中Dmc1基因也是减数分裂特异的基因, 其表达与倍性无显著的相关性, 而与性成熟相关; 并且在三倍体卵巢中的过量表达可能与其减数分裂异常及其不育有关.     

不同倍性鲫鲤鱼Dmc1基因cDNA的克隆 及其表达分析

酵母菌 Dmc1(disrupted meiotic cDNA)基因是一个在减数分裂前期Ⅰ表达的特异基因, 其产物是减数分裂同源染色体配对所必需的. 根据酵母菌、小鼠以及人的DMC1中保守氨基酸序列合成简并引物, 分别克隆了二倍体红鲫(Carassius auratus red var.)、湘江野鲤(Cyprinus carpio L.)、日本白鲫(Carassius cuvieri)、三倍体湘云鲫和异源四倍体鲫鲤Dmc1基因部分cDNA序列. 通过cDNA末端快速分离法(RACE)进一步获得了以上5种鱼Dmc1的cDNA全长, 其中红鲫Dmc1、湘江野鲤Dmc1和日本白鲫Dmc1全长均为1375 bp, 三倍体湘云鲫Dmc1全长1383 bp, 异源四倍体鲫鲤Dmc1全长1379 bp, 这5种鱼各自都编码342个氨基酸. 结果表明, 红鲫、湘江野鲤和日本白鲫的DMC1蛋白的氨基酸同源性高达97.3%, 说明DMC1蛋白在这3种鱼里具有高度保守性; 而三者与已知序列的人、小鼠和斑马鱼(Danio rerio)DMC1蛋白的氨基酸同源性分别为 86%, 86%和95%. 以分离得到的不同倍性鱼Dmc1基因编码区中完全相同的序列设计特异引物进行表达分析. RT-PCR结果表明, Dmc1只在性腺中表达, 在其他组织中不表达; 通过实时荧光定量PCR(real-time PCR), 对Dmc1基因在繁殖季节的二倍体红鲫, 三倍体湘云鲫, 四倍体鲫鲤性腺中的表达进行分析, 发现Dmc1在不同倍性鱼的性腺表达有差异, 在卵巢和精巢均表现为: 三倍体表达最高, 二倍体次之, 四倍体的表达最弱, 特别是在三倍体卵巢的表达远高于在二倍体和四倍体的表达. 同时, 对这3种鱼的性腺进行组织切片分析, 发现二倍体和四倍体鱼的性腺发育良好, 且四倍体成熟度高于二倍体, 而三倍体鱼性腺发育缓慢未达到性成熟, 特别是卵巢的发育相当不好. 由此可见, 在不同倍性鲫鲤鱼中Dmc1基因也是减数分裂特异的基因, 其表达与倍性无显著的相关性, 而与性成熟相关; 并且在三倍体卵巢中的过量表达可能与其减数分裂异常及其不育有关.     

三倍体湘云鲫2号线粒体DNA含量与其不育的相关性研究

三倍体湘云鲫2号是通过倍间杂交产生的一种多倍体鱼(红鲫(♀)×异源四倍体鲫鲤(♂)),因其不育性状,具有重要的生产和科研价值。有研究表明线粒体在动物育性的分子调控机制中扮演了重要角色,但在鱼类中尚没有相关的研究报道。利用本实验室特有遗传背景清晰的实验鱼品系(三倍体湘云鲫2号、二倍体红鲫、异源四倍体鲫鲤和同源三倍体鲫),通过荧光定量PCR技术对比分析了它们性腺中线粒体DNA的拷贝数,发现三倍体湘云鲫2号雄性个体精巢中mt DNA含量较正常水平高,雌性个体卵巢中mt DNA含量较正常水平低。实验首次从线粒体DNA含量影响生殖细胞发育的角度探索线粒体与三倍体湘云鲫2号不育的关系,为三倍体湘云鲫2号不育分子机制的研究提供了一些新的基础数据。     

广西七种金花茶的组织培养快速繁殖

本文报道了山茶科金花茶系七种会花茶的组织培养快速繁殖育苗技术,研究了在改良的ER培养基中~[1],七种金花茶在胚状体形成,假珠芽成苗~([6,7]),愈伤组织分化芽及用成年树茎尖进行腋生株快速繁殖等再生方式中的不同效应,试验证明:金花茶系植物同其他山茶科植物一样,其体细胞能通过多种再生方式产生大量的完整植株。本试验所用的七种金花茶无论在所用分化配方,再生方式及移栽方法上都与我们做过试验的茶树,油茶,山茶花等多种山茶科植物极其相似,因此本试验进一步证明可分化配方与种属密切有关,而且在分化情况及再生方式方面都具有明显的共性,我们根据此一结果正把此方法用于金花茶杂交幼胚的早期培养上,现已得到大量的杂交小金花茶苗。     

爪蟾脊索在决定过程中和相邻细胞的关系

已经知道,对预定脊索的决定起重要作用的是位于它两侧的预定肌节。电子显微镜的观察指出,预定脊索和肌节细胞相互靠得很近,或者相隔一定距离,以突起相连形成腔隙。有被小窝和小泡在两类细胞的外缘常被观察到。最引人注意的是在肌节细胞近腔隙的部位或者附近,球状体的出现。它们大小不等,内含物主要是颗粒,有的松散分布,有的致密地充满整个球状体。这些颗粒的大小和电子染色与这时期胚胎细胞中的核糖体很相似。在预定脊索细胞中以及附近,未见上述结构,但是,观察到它们伸出突起包吞腔隙中物质的现象。讨论了这些球状体的出现与脊索决定之间可能存在的关系。     

中国水仙六倍体的诱导和染色体数目的变异(简报)

中国水仙(Narcissus tazetta L.var.chinensis Roem)属于石蒜科水仙属多年生草本花卉植物。中国水仙的品种不多,在福建漳州地区主要栽培品种为单瓣水仙,此外,还有重瓣和“金三角”两个品种。中国水仙为三倍体植物,染色体数目为2n=3x=30[1-3],其高度不孕性,只开花不结实,靠子鳞茎进行无性繁殖繁衍后代。由于长期的无性繁殖和病毒感染,现存种质退化、品质下降,花朵数明显减少、香味变淡、生长势差、鳞茎变小、抗性减弱等问题,严重影响了该花卉的进一步生产和发展。因此,采用现代生物工程技术(体细胞杂交技术、转基因技术等)改良中国水仙,培育中国水仙新品种迫在眉睫。     

松胞素对百合花粉原生质体内肌动蛋白微丝的影响

用B_5培养基酶解分离出百合花粉原生质体。原生质体经松胞素(5μg/ml)分别处理5、10、15、30、60 min,再用荧光标记的鬼笔碱染色,共焦激光扫描镜观察,跟踪了原生质体内的肌动蛋白微丝从一个组织复杂严密的网络转变为无数颗粒体的过程。松胞素处理过的原生质体移回至不含松胞素的培养基中后继续培养15 min,肌动蛋白颗粒快速地再延伸出微丝,重组成新的网络。存在于花粉原生质体中生殖细胞的微丝网络,在经松胞素处理后同样都形成为颗粒体。之后,如果原生质体再放入不含松胞素的培养基内继续培养,生殖细胞内的颗粒体同样会再延伸出微丝,重新组成网络。从原生质体胞质以及生殖细胞内所见到的微丝和颗粒相互转化的情况,可以断定,颗粒体不但具有凝聚微丝的功能,同时也具有重组微丝的功能。     

异源PDGF-A链表达对CHO细胞生长和转化的作用

用DNA磷酸钙盐沉淀方法把含人PDGF(血小板衍生生长因子)A链cDNA的表达质粒pSV_2neo-A转染CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞),然后经G 418(400-800 μg/ml)筛选分离20个转染细胞株。选出其中At_1和Aot7细胞株所进行的实验结果表明,这些细胞的形态和生长行为均发生明显的变化,PDGF-A链mRNA的表达水平比CHO细胞明显增高,胞质有强阳性的PDGF荧光反应,显示有PDGF样蛋白的合成。这些细胞不但生长速率加快,有高密度持续生长的特性,而且能在软琼脂培基上形成大集落和在裸鼠体内接种形成纤维肉瘤,提示外源PDGF-A链基因的表达有使CHO细胞生长失控和发生细胞恶性转化的作用。     

家兔早期胚胎细胞发育能力的研究

本文利用胚泡注射法制作嵌合体对家兔交配后96,120和144小时的ICM细胞的发育能力进行了研究。供体胚胎取自青紫兰灰免,受体胚胎取自新西兰白兔,结果表明96和120小时供胚的ICM细胞与96小时受胚胚泡组合后均能参与发育,形成嵌合兔,144小时者未获得嵌合体。由于120小时的ICM细胞发育的2只表型为雄性的嵌合兔,其中1只不育,其性腺和外周血核型表明不育兔为xx/xy性嵌合,性腺中有处于不同发育程度的卵巢和精细管,外周血含xx和xy两种核型。本实验结果首次证明家兔交配后120小时胚泡的ICM细胞仍具有参与嵌合体发育的能力。它不仅能参与体细胞的分化,并具有形成生殖细胞的能力。交配后144小时胚泡的ICM细胞其发育能力似乎已发生了局限。     

山羊卵母细胞的减数分裂进程

本实验以随机屠宰山羊的卵巢为实验材料,研究了不同直径卵泡卵母细胞的减数分裂进程。结果显示,不同直径卵泡卵母细胞在体外成熟培养条件下的减数分裂能力不同:≤0.5mm直径卵泡的卵母细胞不能恢复减数分裂;0.8-1.2mm卵泡的卵母细胞可恢复减数分裂,但只能发育到MⅠ期,培养24h发育到MⅠ期比率60%;1.5-5.0mm卵泡卵母细胞已经完全获得减数分裂能力,培养24h发育到MⅡ的比例91%。完全获得减数分裂能力的1.5-5.0mm卵泡卵母细胞处于生发泡(GV)期的比率在成熟培养2-8h期间明显下降;其中,4-6h期间GⅤ比率下降最为迅速(由61%降低到19%,p<0.0005);体外培养6-12h期间MⅠ比率由25%上升到60%,随后下降,到24h仅有2%卵母细胞处于MⅠ期;培养16h有21%卵母细胞进入MⅡ期,24h 91%卵母细胞到达MⅡ期。对卵母细胞体外核成熟进程的数据做折线图计算结果表明,1.5-5.0mm卵泡卵母细胞减数分裂进程(各细胞周期事件出现和维持的时间)为:0-3.0h为GⅤ期,3.0-7.0h为前中期Ⅰ,7.0-14.6h为MⅠ期,14.6-18.4h处于后期-Ⅰ和末期-Ⅰ,18.4-24h为MⅡ期。本实验还证明,部分获得减数分裂能力(0.8-1.2mm卵泡)与完全获得减数分裂能力(1.5-5mm卵泡)的卵母细胞,其各细胞周期事件一旦发生,所需的时间是相同的。这些结果为进一步研究山羊卵母细胞减数分裂机制及其调控提供了重要的基础数据。     

大鼠卵巢滤泡产生PA活性的比较及促性腺激素的影响

在排卵过程中,滤泡壁必须变薄作为卵母细胞得以离开滤泡的前提。Schochet最早提出水解酶的作用可能使滤泡壁降解的看法。Espey用一些蛋白水解酶在离体条件下处理滤泡组织条,见到组织条的张力减弱;此外,给兔子的成熟滤泡注射小剂量浓缩的蛋白水解酶,则引起滤泡壁排卵点(Stigma)的形成和类似于排卵时的破裂现象。Beers等看到,     

三肽囊素(bursin)的鸡、鸭免疫器官组织学定位特征分析(简报)

三肽囊素(bursin)是法氏囊组织提取物中一种非常重要的活性因子,由Audhya T.等在1986年首次报道。近十几年,有关三肽囊素的研究取得了较大的进展,涉及对三肽囊素的生物学活性、组织学定位、功能机制及其应用前景。本研究分别探索了三肽囊素在鸡、鸭免疫器官中的定位,并对其特征进行分析,以期更深入理解三肽囊素的存在及其生物学意义。鸡用近交系(CB系),由12、14及20日龄胚、新生雏、1—9周龄鸡,采集法氏囊、法氏囊T细胞区、胸腺、哈德氏腺、脾脏及骨髓。鸭用北京鸭,由新生     

东方蝾螈胚胎表皮细胞动作电位的离子依赖性

两栖类胚胎表皮细胞在其发育的一定阶段是可兴奋的,能传导兴奋,并伴有类似心肌细胞的动作电位。Sato等报道,蝾螈表皮细胞动作电位由两种成分组成:心肌型的慢电位和在这之前一个短时程的快电位。慢电位可以传递到其它细胞,而快电位是不传递的。他们认为,慢电位是由快电位诱导产生的。在我们以往的实验中,刺激和记录的不是同一个细胞,可能是由于快电位不能传递到被记录的细