草鱼感染GCRV后血液中淋巴细胞变化及BCL10表达分析

为了研究草鱼BCL10基因在草鱼出血病中的应答机制, 文章克隆了BCL10基因, 并利用生物信息学、荧光定量和血涂片等技术对其进行了分析。生物信息学结果显示, BCL10基因开放阅读框为738 bp, 编码245个氨基酸。实时荧光定量PCR结果显示, 感染病毒后草鱼体内BCL10表达量持续上调, 在肝胰腺和中肾中第4天达到峰值, 第7天表达量开始下调。血涂片显微镜观察发现了血液中淋巴细胞在感染病毒后第1到第4天下降, 第7天时上升。肾脏的组织病理学观察也发现中肾中肾小管上皮细胞第1到第7天逐渐空泡化, 脱落坏死。以上结果表明, BCL10基因参与了草鱼应对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)入侵的免疫应答。     

赤眼鳟Toll样受体3基因cDNA全长克隆及表达分析

为探究赤眼鳟（Squaliobarbus curriculus）Toll样受体3（Toll-like receptor 3,ScTLR3）基因是否参与抗病毒免疫反应,实验运用RACE技术,克隆得到ScTLR3基因cDNA全长序列,并进行了生物信息学分析;通过Real-Time qPCR技术,检测了ScTLR3 mRNA在健康赤眼鳟10个组织中的分布以及感染草鱼呼肠孤病毒（GCRV）后肝脏、脾脏、体肾和头肾中的表达特征。结果表明:ScTLR3基因cDNA序列全长4043 bp,包括5-非编码区（UTR）216 bp,开放阅读框（ORF）2715 bp和3-UTR 1112 bp;ScTLR3共编码904个氨基酸残基,推导的蛋白分子量102.67 kD,理论等电点8.76;SMART结构域预测显示,ScTLR3由N端的信号肽（SP）、富亮氨酸结构域（LRRs）、跨膜结构域（TM）和C端的Toll/白介素-1受体结构域（TIR）组成。实时荧光定量结果显示,ScTLR3mRNA在检测的各组织中均有表达,肝脏中的相对表达量极显著高于其他组织（P0.01）;感染GCRV后,肝脏、脾脏、体肾和头肾组织中ScTLR3 mRNA均上调表达,肝脏、脾脏和体肾组织中的相对表达量在24h达到峰值,分别为对照组的5倍、7倍和6倍。研究表明,ScTLR3具有TLRs家族基因的典型结构特征,并能被GCRV诱导表达,推测其在赤眼鳟抗GCRV入侵免疫反应中发挥了重要作用。     

赤眼鳟MyD88基因cDNA克隆与表达特性研究

实验使用RACE-PCR技术获得了赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)髓样分化因子88 (Myeloid differentiationfactor 88, MyD88)的cDNA全长, 命名为ScMyD88。ScMyD88的cDNA全长为1779 bp, 其中开放阅读框855 bp, 共编码284个氨基酸残基, 推导的蛋白质分子量为33.053 kD, 理论等电点为5.66。赤眼鳟MyD88具有典型的MyD88结构特征, 包括死亡结构域和TIR结构域(Toll-IL-1 receptor domain, TIR), 其氨基酸序列和鲤科鱼类具有高度保守性, 相似性达到了90%以上, 特别是和武昌鱼相比, 相似性达到了98%。在检测的9个赤眼鳟组织和器官中均有MyD88表达, 其中肝脏、头肾和体肾中表达水平最高, 在脑中表达量最低。在草鱼呼肠弧病毒(Grass carp reovirus, GCRV)感染初期(12h内), MyD88在赤眼鳟免疫组织中表达水平急剧上升, 特别是在脾脏和体肾中尤为明显, 随后恢复正常水平。研究表明, MyD88在赤眼鳟抵抗GCRV入侵的免疫应答反应初期发挥了重要作用。     

斑马鱼TANK基因的克隆及功能初探

哺乳动物中, TRAF家族相关的NF-κB激活因子(TRAF family member-associated NF-κB activator, TANK)参与调控核因子κB (nuclear factor-κB, NF-κB)信号通路,在硬骨鱼中,最新研究表明TANK在青鱼抗病毒天然免疫反应中具有重要的功能,但在模式动物斑马鱼(Danio rerio)中还没有有关TANK的报道。本研究率先在斑马鱼开展TANK功能研究,克隆并获得了斑马鱼TANK基因(Danio rerio TANK, DrTANK),其编码区(coding sequence, CDS)包括1 047个核苷酸,编码349个氨基酸。免疫印迹实验显示Dr TANK蛋白大小约50 kD;免疫荧光实验证明Dr TANK主要定位于细胞质中,表明其为一种胞质蛋白;双荧光素酶报告基因研究结果显示,在EPC细胞中,过表达Dr TANK并不能显著上调干扰素启动子的表达,但聚肌胞苷酸[poly (I:C)]和草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus, GCRV)的刺激能显著增强其诱导干扰素启动子的表达活性。本研究结果表明Dr TANK在斑马鱼抗病毒天然免疫反应中可能具有重要作用,为后续Dr TANK功能研究奠定了基础。     

赤眼鳟Mx1基因的cDNA克隆及表达特性

为探究赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)是否存在Mx1 (Myxovirus resistance)基因及参与抗病毒免疫反应, 研究利用RACE技术获得了赤眼鳟Mx1基因(ScMx1)的cDNA全长序列, 并对其进行了生物信息学分析; 采用荧光定量PCR技术, 检测了ScMx1在赤眼鳟健康组织中的表达情况以及感染GCRV后ScMx1和ScIFN-Ⅰ的表达特征。结果表明, ScMx1的cDNA全长为3000 bp, 包含5′非编码区124 bp, 开放阅读框1893 bp, 3′非编码区983 bp, 共编码630个氨基酸。预测的ScMx1蛋白包含GTP酶结合区域、中央核心结构域和GTP酶效应结构域。ScMx1与青鱼Mx1的相似性最高(97%), 与ScMx的相似性仅为50%。ScMx1在所检测的10种组织中均有表达, 其中在脾脏中表达量最高。经GCRV感染开始至168h, ScMx1和ScIFN-Ⅰ在肝脏和体肾中的表达量持续上调; 在脾脏和头肾中于感染后72h达到峰值。相关性分析显示脾脏中ScMx1和ScIFN-Ⅰ的表达水平呈显著相关(r=0.94, P=0.018)。研究发现赤眼鳟存在Mx1基因, 且可能参与了抗GCRV免疫应答反应。     

草鱼呼肠孤病毒NS31蛋白在昆虫细胞中表达及互作多肽筛选

草鱼呼肠孤病毒(Grasscarpreovirus,GCRV)是引发病毒性草鱼出血病的主要病原.前期研究证实GCRV-S7基因片段编码NS31蛋白是GCRV的非结构蛋白,在病毒感染的中后期表达.为深入开展NS31的具体生物学功能,本研究从GCRV-JX01株病毒基因组中扩增NS31,克隆至pFastBacHTA载体;利用杆状病毒Bac-to-Bac系统成功表达携带his标签的重组蛋白his-NS31;Western-Blot和IFA实验表明重组杆状病毒能够感染昆虫细胞(Sf9)表达NS31,进一步通过his-Ni2+柱纯化NS31,SDS-PAGE鉴定蛋白约为30KD.运用噬菌体展示技术筛选噬菌体12肽库,研究NS31特异性结合多肽.挑取30个克隆进行DNA序列测定,结果表明NS31主要和2种多肽分子相互作用.进一步结合生物信息学分析表明上述多肽与草鱼基因组中6个基因具有同源性,提示其可能是NS31互作蛋白.本研究为深入探索NS31在病毒感染过程中的生物学功能奠定了重要基础.     

草鱼免疫相关基因Prkrip1的克隆和表达分析

随着草鱼养殖规模的扩大, 草鱼的病毒性疾病极大地影响着草鱼的产量。开展鱼类病毒免疫反应相关功能基因的研究意义重大。研究首先通过同源克隆的方法从草鱼中克隆到了一段Prkrip1基因的EST序列, 进一步通过RACE、长片段PCR和Genome walking的方法获得了该基因的全长cDNA序列、基因组DNA序列和启动子区序列。氨基酸序列分析显示, Prkrip1含有3个核定位信号和一个双链RNA结合区, 并具有与PKR结合的保守N端区; 荧光报告基因的表达证实我们所克隆到的启动子区是有活性的, 可用于后续该基因的转录调控分析; Real-time PCR分析发现, Prkrip1 基因在草鱼的肝和血中表达量最高, GCRV感染后在大部分免疫组织中均上调表达, 说明该基因确实与病毒感染相关。研究结果为Prkrip1基因在硬骨鱼类的功能研究提供了线索, 也为鱼类天然免疫反应中调控PKR信号通路的系统研究提供了理论依据。       

斑马鱼nr1d4a和nr1d4b基因的表达及其对不同环境刺激的响应简

研究获得了斑马鱼nr1d4a和nr1d4b基因的cDNA,进行了序列比对和系统进化分析,并采用实时定量RT-PCR(qPCR)方法研究了其表达模式及对不同环境刺激的转录反应。研究发现,斑马鱼nr1d4a和nr1d4b是由基因复制产生的旁系同源基因,具有高度保守的DNA结合结构域和配体结合结构域。斑马鱼nr1d4a和nr1d4b的表达模式具有明显的差别。nr1d4a在胚胎发育早期的表达量很低,72 hpf时开始显著升高;而nr1d4b具有较高水平的母源性表达,6 hpf时的表达量明显降低,但也在72 hpf显著回升。nr1d4a在脑和肾脏中表达量最高,其次是鳃、卵巢、精巢和眼,在肝脏中的表达量最低;nr1d4b在卵巢中表达量最高,其次是精巢和脑,在肠道和心脏中表达量最低。斑马鱼nr1d4a和nr1d4b都能被多种环境刺激瞬时诱导表达。16℃低温处理0.5h就能显著诱导斑马鱼nr1d4a和nr1d4b基因的表达,但处理6h后其诱导效应开始下降并逐渐消失。除低温外,重金属(2μmol/L镉)、缺氧(5%氧气)和盐度(5‰)处理均能瞬时诱导nr1d4a和nr1d4b的表达,说明nr1d4a和nr1d4b基因可能参与斑马鱼对多种环境刺激的适应性反应。研究为深入揭示鱼类nr1d4a和nr1d4b基因的生物学功能及其表达调控机制奠定了基础。     

草鱼诱导型一氧化氮合酶cDNA和启动子的克隆及分析

应用PCR和RACE技术,以细菌脂多糖(LPS)刺激的草鱼头肾白细胞cDNA为模板,获得草鱼iNOS (Inducible nitric oxide synthase)全长cDNA序列.该序列共4286 bp,编码含1080个氨基酸残基的蛋白.氨基酸序列比对分析发现草鱼iNOS与金鱼iNOS a和b、斑马鱼iNOS 2b以及鲤鱼iNOS高度保守,序列一致性均大于80%;它们的血红素、四氢生物蝶呤、钙调蛋白、FMN、FAD和NADH等辅因子结合区域也十分保守.用NJ法对新获得的序列和其它脊椎动物NOS的编码序列进行进化分析证实它属于诱导型NOS.在此基础上,运用基因步移技术分离草鱼iNOS基因的启动子序列,共有1978 bp.生物信息学分析发现该序列含有包括GR、AP1、C/EBP、ER、YY1、IRF1和IL-6 REBP在内的多个转录因子的潜在结合位点.     

草鱼呼肠孤病毒衣壳蛋白VP7真核重组质粒的构建及免疫效果评价

为研究开发草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)基因疫苗, 以编码其主要衣壳蛋白VP7的序列为靶基因, 克隆构建了真核表达重组质粒 pEGFP-N1-VP7。用脂质体法将其转染真核细胞COS-1和CIK进行瞬时表达, 荧光显微镜观察及特异性RT-PCR检测结果表明, 成功转染并得到了高效表达。大量扩增重组菌, 提取并制备重组质粒pEGFP-N1-VP7, 肌肉注射免疫(205) g的健康草鱼, 重组质粒按0.5和5 g分为2组, 同时设5 g空载体组及对照组。免疫草鱼22d后, 检测草鱼肠、外周血、肾脏、脾脏的呼吸暴发活性及淋巴细胞的增殖反应; 免疫草鱼21d、28d、35d、42d、56d、70d、84d和98d后, 分别尾静脉采血并分离血清, 用双抗体夹心ELISA方法进行抗体水平的测定。结果表明, 构建的含VP7蛋白的核酸疫苗既可诱导草鱼的细胞免疫, 又可诱导特异性体液免疫, 具有明显的免疫应答作用。按照每尾0.5 g重组质粒的剂量免疫草鱼后35d进行攻毒, 免疫保护率达到67%, 此研究为GCRV基因疫苗的研制提供了实验资料。       

草鱼CD81基因的克隆及功能分析

为研究白细胞表面分化抗原81(CD81)的功能, 对草鱼CD81进行了克隆, CD81全长共1376 bp, 其中5'非翻译区87 bp, 3'非翻译区581 bp, 开放阅读框为708 bp, 包括8个外显子, 7个内含子, 编码235个氨基酸。实验采用实时荧光定量PCR的方法检测了CD81在健康草鱼不同组织中的表达情况及草鱼出血病病毒(GCRV)攻毒前后的表达变化情况。结果显示草鱼CD81在所有被检测组织中均有表达, 在头肾中表达量最高。在GCRV攻毒前后草鱼鳃、脾、肝、肠及头肾5个组织中的CD81表达量均有明显变化。同时, 采用绿色荧光蛋白(GFP)来示踪CD81的亚细胞表达部位, 激光共聚焦显微镜显示, 同人类一样, 草鱼CD81定位于细胞膜上。       

感染GCRV的草鱼miRNA测序与比较分析

为探索基于高通量筛选抗性主效miRNA功能分子的方法应用于抗性草鱼(Ctenopharyngodon idellus)的选育,研究借助高通量测序鉴定分析感染GCRV前后的草鱼头肾组织中miRNAs.测序结果共鉴定出821个成熟miRNAs,其中118个在GCRV攻毒组特异表达,82个为未攻毒组特有;差异分析结果显示,G...     

Antigenic analysis of grass carp reovirus using single-chain variable fragment antibody against IgM from Ctenopharyngodon idella

Grass carp (Ctenopharyngodon idella) is an important species of freshwater aquaculture fish in China. However, grass carp reovirus (GCRV) can cause fatal hemorrhagic disease in yearling populations. Until now, a strategy to define the antigenic capacity of the virus’s structural proteins for preparing an effective vaccine has not been available. In this study, some single-chain variable fragment antibodies (scFv), which could specifically recognize grass carp IgM, were selected from a constructed mouse naïve antibody phage display cDNA library. The identified scFv C1B3 clone was shown to possess relatively higher specific binding activity to grass carp IgM. Furthermore, ELISA analysis indicated that the IgM level in serum from virus-infected grass carp was more than two times higher than that of the control group at 5–7 days post infection. Moreover, Western blot analysis demonstrated that the outer capsid protein VP7 has a specific immuno-binding-reaction with the serum IgM from virus-infected grass carp. Our results suggest that VP7 can induce a stronger immune response in grass carp than the other GCRV structural proteins, which implies that VP7 protein could be used as a preferred immunogen for vaccine design.     

草鱼鳃介导草鱼呼肠孤病毒免疫应答

采用草鱼呼肠孤病毒腹腔注射草鱼, 通过定量RT-PCR检测了12个抗病毒免疫相关基因在鳃中不同时间点的表达模式, 以了解鳃对内源性病毒的免疫应答。模式识别受体基因CiTLR3、CiTLR7、CiTLR22、CiRIG-I、CiMDA5、CiLGP2、CiNOD1和CiNOD2, 以及干扰素基因CiIFN-I的表达在注射病毒后12h、24h、48h及72h基本都上调。IgM基因的表达仅在72h上调。接头分子CiMyD88和CiIPS-1基因的表达在早期下调（6h）, 然后逐渐上升。为了证实病毒感染的可靠性, 通过RT-PCR检测了病毒VP4基因。结果表明草鱼鳃在抗病毒免疫方面发挥着重要作用。       

利用噬菌体展示技术筛选草鱼呼肠孤病毒VP39蛋白相互作用多肽

VP39是草鱼呼肠孤Ⅲ型病毒(GCRV GenotypeⅢ, GCRV-Ⅲ)S9基因编码的蛋白,为研究VP39蛋白在GCRV-Ⅲ感染草鱼细胞过程中行使的生物学功能,将克隆VP39基因序列并构建原核表达载体pET32a-VP39,通过原核表达得到VP39-HIS融合蛋白;利用VP39蛋白溶液免疫小鼠,制备鼠抗VP39多克隆抗体,通过Western Blot对抗体进行评估;利用制备的多克隆抗体探究GCRV-Ⅲ感染细胞过程中VP39蛋白表达动力学;利用噬菌体展示技术筛选与VP39蛋白特异性结合的多肽序列并进行分析。SDS-PAGE电泳结果显示, VP39-HIS融合蛋白可良好溶于PBS中,蛋白大小约为39 kD; Western Blot检测表明实验所制备的VP39多克隆抗体在1:10000稀释比例下,既能识别原核表达的VP39-HIS融合蛋白,也能识别GCRV-Ⅲ感染CIK细胞后表达的VP39蛋白,具有良好的效价与特异性;在病毒侵染过程中, VP39前期表达量较少,在中后期大量表达;噬菌体展示技术筛选出两条多肽与VP39蛋白有高度亲和性,经过在NCBI上比对后发现草鱼基因组中有7个基因与筛...