长江刀鲚亲鱼强化培育及自然产卵规律研究

试验研究了人工饲养条件下长江刀鲚亲鱼培育的水温及主要水化学指标、饵料投喂策略及经强化培育后刀鲚自然产卵的规律。结果表明,刀鲚亲鱼培育池周年水温变化范围为5-34℃,刀鲚常年摄食,采用“鲮鱼苗+细足米虾”的系列活饵进行饲育期、越冬期、促熟期分阶段的投喂策略,雌性亲鱼强化培育后成熟系数可达16.5%,发育较佳,总体成活率为97.6%。5-6月是刀鲚产卵的高峰期,产卵时间集中在20:00-20:30,受精率为80%-92%,试验期间收集刀鲚受精卵56.9万粒。刀鲚的产卵与水温关系密切,最适产卵水温为20-28℃。     

饥饿胁迫对刀鲚形体、体成分及血液生化指标的影响

以室内养殖刀鲚为试验对象,研究20天的短期饥饿对其形体、体成分和血液生化指标的影响,实验组分别在第0、2、5、10、15和20天取样。结果表明,脏体比和肝体比在饥饿的第2天即显著下降(P<0.05),肥满度和体质量在20天的饥饿期内呈下降趋势,但变化不显著(P＞0.05)。刀鲚肌肉粗脂肪在第5天显著下降(P<0.05),下降5.99%,而粗蛋白含量在第15天时才显著降低(P<0.05),水分在整个饥饿期间总体呈上升趋势,第10天显著上升(P<0.05),粗灰分含量在饥饿期间变化不显著(P>0.05)。血清总蛋白、球蛋白、胆固醇和皮质醇随着饥饿时间的延长呈现先升高后降低的趋势,而血清甘油三酯和血糖总体呈先急速下降并维持一定水平,其中甘油三酯在饥饿至第2天显著下降(P<0.05),血糖浓度在第5天显著下降(P<0.05)。表明短期饥饿胁迫使刀鲚形体发生一定的变化,随着饥饿时间的延长,刀鲚首先先动用体内储存的脂肪来满足能量供应,再动用蛋白质来维持体内的正常代谢,血液生化指标也发生与饥饿相适应的变化。     

抗草鱼出血病病毒转基因稀有(鮈)鲫的初步研究

研究采用草鱼H1基因启动子,以草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)外衣壳蛋白VP7基因为靶基因,以增强型绿色荧光蛋白(eGFP)为报告基因,构建了3个小发卡RNA(shRNA)表达载体pHlsiGCRV(x)-CMVeGFP.CIK细胞感染实验表明,pHIsiGCRV2-CMVeGFP具有较高的病毒抑制作用.通过显微注射将pH1siGCRV2-CMVeGFP导入稀有(鮈)鲫(Gobiocypris rarus)受精卵,获得转基因稀有(鮈)鲫P0代群体.转基因稀有(鮈)鲫攻毒实验显示,转基因稀有(鮈)鲫死亡率为30%,抗草鱼出血病能力显著提高.进一步的实时荧光定量PCR检测证实,转基因稀有(鮈)鲫脾脏、后肠和肝脏中GCRV的含量显著低于对照鱼,并随着时间的延续逐渐减少,转基因稀有(鮈)鲫体内GCRV的复制受到有效抑制.研究为抗草鱼出血病转基因鱼育种奠定重要基础.     

草鱼CD81基因的克隆及功能分析

为研究白细胞表面分化抗原81(CD81)的功能,对草鱼CD81进行了克隆,CD81全长共1376 bp,其中5′非翻译区87 bp,3′非翻译区581 bp,开放阅读框为708 bp,包括8个外显子,7个内含子,编码235个氨基酸。实验采用实时荧光定量PCR的方法检测了CD81在健康草鱼不同组织中的表达情况及草鱼出血病病毒(GCRV)攻毒前后的表达变化情况。结果显示草鱼CD81在所有被检测组织中均有表达,在头肾中表达量最高。在GCRV攻毒前后草鱼鳃、脾、肝、肠及头肾5个组织中的CD81表达量均有明显变化。同时,采用绿色荧光蛋白(GFP)来示踪CD81的亚细胞表达部位,激光共聚焦显微镜显示,同人类一样,草鱼CD81定位于细胞膜上。     

10‰盐度对长江刀鲚幼鱼装载和运输胁迫中应激指标的影响

采用模拟运输的方法,选取平均体长为(13.58±0.23)cm、平均体质量为(8.55±0.39)g的长江刀鲚幼鱼为实验对象,设置正常应激组和加盐抗应激组(盐度为10‰),每组3个平行,运输结束后将剩余的鱼放回原培育池,研究分析了正常应激组和加盐抗应激组在装载前(BL)、装载后(AL)及运输胁迫2h、4h、6h、8h和恢复24h、96h后,长江刀鲚血浆渗透压、皮质醇、血糖和肝糖原的变化规律及恢复情况。结果显示,正常应激组和加盐抗应激组经装载、8h运输及恢复96h后的成活率分别为20%和100%。运输胁迫导致正常应激组刀鲚血液渗透压整体呈下降趋势,10‰盐度则显著提高血浆渗透压,至运输8h后,血液渗透压达到最高值(0.348±0.002)m Osm/kg。长江刀鲚血浆皮质醇在运输2h后急剧升高达到最大值,而10‰盐度使得运输刀鲚的血浆皮质醇在运输4h后达到峰值(574.71±64.75)ng/m L。运输胁迫导致正常应激组长江刀鲚血糖的明显升高;而加盐抗应激组血糖含量的变化幅度显著低于正常应激组,运输6h后血糖值趋于稳定。肝糖原的变化规律与血糖浓度相对应,推测血糖值的变化主要源于肝脏糖原的动员。实验结果表明,10‰盐度可显著提高血浆渗透压水平,降低其能量物质消耗,避免了撞壁、擦伤掉鳞等强烈的应激反应,显著提高了成活率。     

美洲鲥hsp70的分子特征及其对运输应激的应答

运用同源克隆和c DNA末端快速扩增(RACE)技术获取了美洲鲥(Alosa sapidissima)热应激蛋白70(hsp70)的全长c DNA序列,其总长度为2 545 bp,开放阅读框(ORF)为1 914 bp,推测编码637个氨基酸,其氨基酸的二级结构含有HSP70家族的3个特征序列。氨基酸同源性分析显示,美洲鲥hsp70与墨西哥脂鲤(Astyanax mexicanus)等鱼类的相似性达84%以上,与无脊椎动物果蝇(Drosophila auraria)及大肠杆菌(Escherichia coli)的相似性分别为73%和38%。荧光定量PCR检测显示,该基因在美洲鲥鳃、肌肉、头肾中高表达,在脑和心中相对高表达,在肝、脾、肠、肾中微量表达。采用荧光定量PCR方法研究运输应激对美洲鲥未经繁殖的亲鱼hsp70 m RNA水平的影响,在运输实验中鳃、肝hsp70 m RNA水平呈先升高后降低的变化趋势,头肾hsp70 m RNA水平呈现递增趋势。该结果表明克隆到的基因符合诱导型hsp70的特点,而且美洲鲥鳃、肝、头肾组织的hsp70 m RNA对运输应激表现出明显的应答作用。     

草鱼(AG)微卫星标记克隆及特征分析

报道了一种简便高效克隆微卫星序列的方法。这一方法的实施步骤包括小片段基因组文库构建、三螺旋捕获、磁珠分离和 PCR 扫描。草鱼 AG 重复文库的冗余率为 7.2%, 富集效率为 60.25 倍, PCR 扫描的准确率达 100%, 采用这一方法克隆到的 AG 重复序列中完美型、非完美型和混合型的比例分别为 66.87%、17.17%和 15.96%, 不间断重复序列长度大于 30 bp 的微卫星座位占 51%。34 个微卫星座位中有 25 个表现出多态性,PIC 值 0.50—0.91, 进一步分析表明 AG 重复序列的多态信息含量(PIC)与不间断重复序列长度相关, 不间断重复序列长度大于 30 bp 的座位表现出丰富的多态性。较高的富集率和有效引物获得率证明此方法在分离草鱼微卫星中的成功应用, 并将为草鱼养殖品系的优化、遗传多样性的检测及遗传图谱的构建等打下基础。