草鱼呼肠孤病毒NS31蛋白在昆虫细胞中表达及互作多肽筛选

草鱼呼肠孤病毒(Grasscarpreovirus,GCRV)是引发病毒性草鱼出血病的主要病原.前期研究证实GCRV-S7基因片段编码NS31蛋白是GCRV的非结构蛋白,在病毒感染的中后期表达.为深入开展NS31的具体生物学功能,本研究从GCRV-JX01株病毒基因组中扩增NS31,克隆至pFastBacHTA载体;利用杆状病毒Bac-to-Bac系统成功表达携带his标签的重组蛋白his-NS31;Western-Blot和IFA实验表明重组杆状病毒能够感染昆虫细胞(Sf9)表达NS31,进一步通过his-Ni2+柱纯化NS31,SDS-PAGE鉴定蛋白约为30KD.运用噬菌体展示技术筛选噬菌体12肽库,研究NS31特异性结合多肽.挑取30个克隆进行DNA序列测定,结果表明NS31主要和2种多肽分子相互作用.进一步结合生物信息学分析表明上述多肽与草鱼基因组中6个基因具有同源性,提示其可能是NS31互作蛋白.本研究为深入探索NS31在病毒感染过程中的生物学功能奠定了重要基础.     

草鱼Fibulin-4蛋白与草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白相互作用的研究

草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)是当前引起我国草鱼出血病的主要病原,其外衣壳蛋白通常在病毒的组织嗜性和细胞嗜性上发挥重要作用。本研究利用共定位、Dot-Blot技术和His-Pull Down技术,验证了草鱼Fibulin-4蛋白与草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白的相互作用。将pDsRed1N1-VP7,pDsRed1N1-VP56分别与pEGFP-Fibulin-4共转染草鱼性腺细胞GCO。结果显示,病毒蛋白VP7,VP56和草鱼蛋白Fibulin-4均分布于细胞质中,两种蛋白都与Fibulin-4有部分重叠。应用Dot-Blot Overlay技术,将纯化获得的GST与GST-Fibulin-4蛋白倍比稀释杂交到PVDF膜上,经过His-VP7,His-VP56蛋白的孵育,结果表明随着杂交的蛋白量从低到高,蛋白信号由弱到强,His-VP7与His-VP56都能够吸附于GST-Fibulin-4蛋白上并发生相互作用,而不能吸附GST蛋白。利用Pull Down技术,裂解细胞表达的GFP蛋白与GFP-Fibulin-4蛋白,结合His-VP7,His-VP56的HisPur Cobalt Resin,在Elution中均能检测到GFP-Fibulin-4蛋白质,而检测不到对照蛋白质GFP,进一步证实了VP7,VP56与Fibulin-4蛋白之间的相互作用。     

水螅的替代食物筛选

在水螅的培养中,常出现食物缺乏。为了获得替代食物,比较水螅对一些常见肉类的捕食行为。结果表明,水螅对蚯蚓肉、虾肉、鱼肉、鸡肉、牛肉和猪肉均能捕捉,对各食物的捕捉比例无显著差异;但水螅对食物的摄食比例在食物类型间存在显著差异,对虾肉较为偏好。可选择虾肉作为培养时的替代食物。     

草鱼Ⅲ型呼肠孤病毒NS66抗体制备及应用

[背景]草鱼Ⅲ型呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV genotypeⅢ) 104株可导致典型性草鱼出血病,对其编码片段的分析有望为临床免疫学检测提供依据。[目的]研究GCRV104株s6基因节段编码蛋白NS66的可能功能,制备良好的GCRV104株NS66蛋白多克隆抗体并分析其特异性。[方法]PCR方法扩增GCRV104株s6基因片段,并克隆至表达载体pGEX-4T-3,转化到大肠杆菌BL21后用IPTG诱导表达,其产物经SDS-PAGE鉴定分析后,通过纯化获得目的蛋白。然后用纯化的pGEX-4T-3-NS66重组蛋白免疫小鼠,获得Anti pGEX-4T-3-NS66多克隆抗体,Western blot测定抗体效价,Western blotting和间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)鉴定抗体特异性。[结果]SDS-PAGE分析显示表达的重组蛋白约66 kD,大小与预期相符,主要存在于包涵体中;Western blotting测得制备的多克隆抗体效价大于1:50 000,Western blotting和IFA结果表明,制备的多克隆抗体能特异性识别GCRV104病毒。[结论]GCRV104病毒编码的非结构蛋白NS66可能参与了复制和组装过程,形成病毒包涵体,这为建立GCRV104免疫诊断方法及研究GCRV编码的NS66蛋白的功能奠定了前期基础。     

散射比浊法检测糖化血红蛋白及临床意义

目的:探讨散射比浊法检测糖化血红蛋白的临床应用价值;方法:采用散射比浊法检测糖化血红蛋白,分析其检测的精密度、线性关系、抗干扰能力及相关性分析.结果:散射比浊法批内CV分别为3.1％和4.3％,批间CV分别为3.8％和5.0％;线性关系Y=l.025X+0.024,R2=0.996;胆红素、三酰甘油、尿素抗干扰实验实测值均在可信区间;散射比浊法与色谱法相关性方程为Y=0.968X+0.364,R=0.976,(P＞0.05).结论:散射比浊检测糖化血红蛋白精密度较高,线性关系良好,抗干扰能力强,相关性良好,可适用于基础和临床实验.     

以卤虫幼体和水蚤为食物对水螅的培养比较

水蚤和卤虫幼体均是水螅培养上的常用食物,利用水蚤和卤虫幼体饲喂水螅．比较这2种食物下水螅的脱芽数和种群增长。结果表明,以卤虫幼体为食物时,水螅个体显著较大,水螅的脱芽数和种群增长明显快于以水蚤为食物时。通过卤虫卵孵化卤虫幼体喂食水螅的培养方法具有明显优势。     

以卤虫幼体和水蚤为食物对水螅的培养比较

水蚤和卤虫幼体均是水螅培养上的常用食物,利用水蚤和卤虫幼体饲喂水螅,比较这2种食物下水螅的脱芽数和种群增长。结果表明,以卤虫幼体为食物时,水螅个体显著较大,水螅的脱芽数和种群增长明显快于以水蚤为食物时。通过卤虫卵孵化卤虫幼体喂食水螅的培养方法具有明显优势。