CKS1B参与拟穴青蟹性腺发育的研究

CDC28蛋白激酶调节亚基1B(CDC28 protein kinase regulatory subunit 1B,CKS1B)是高度保守的CKS1家族成员之一,在细胞周期中作为细胞周期蛋白激酶的调节亚基参与调控真核生物的细胞分裂。因此,研究CKS1家族基因参与甲壳动物性腺发育调节的分子机制具有重要的意义。从已构建的拟穴青蟹性腺EST数据库中筛选到CKS1B基因片段,继而克隆出其全长c DNA序列(Sp-CKS1B),并利用q RT-PCR技术检测其在不同组织和性腺不同发育阶段中的差异表达。结果显示,获得Sp-CKS1B的全长c DNA序列722 bp,其中5'UTR为82 bp,3'UTR为379 bp,开放阅读框261 bp,编码86个氨基酸,包含一段典型的CKS保守序列,属于CKS家族蛋白。在不同组织q RT-PCR结果显示,Sp-CKS1B基因在O5期雌蟹卵巢中的表达水平最高,并与其他组织具有极显著差异(P0.01);同时,在性腺不同发育阶段的表达结果显示,Sp-CKS1B基因在精巢T1期的表达量最高,其次为O5期,二者显著高于卵巢O1-O4期的表达水平(P0.05);而在精巢T3期的表达量最低,并显著低于T1、T2以及卵巢O4、O5期的表达水平(P0.05)。结果说明了Sp-CKS1B在拟穴青蟹的性腺发育过程中可能具有十分重要的作用。     

三疣梭子蟹UHRF1基因在胚胎、幼体和性腺发育过程中的表达分析

为探讨泛素样含PHD和环指域蛋白1(UHRF1)基因在三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)发育过程中的作用, 实验采用SMART RACE方法, 克隆了三疣梭子蟹UHRF1(PtUHRF1)基因。该基因cDNA全长为2849 bp, 开放阅读框(ORF)为2298 bp, 预测其编码1个含有765个氨基酸的蛋白质。结构域分析显示, 该蛋白质包含UBL、PHD、TTD、SRA、RING finger 5个功能结构域。同源分析表明, 三疣梭子蟹PtUHRF1的氨基酸序列与其他物种有较高的同源性。qRT-PCR结果显示, PtUHRF1基因在三疣梭子蟹所有组织中均有表达, 但在精巢中表达量显著高于其他组织。该基因在胚胎和幼体发育不同时期表达差异显著, 在受精卵中的表达量最高, 并显著高于胚胎发育其他时期, 是多细胞时期表达量的2.5倍。PtUHRF1基因在性腺发育不同时期表达存在显著差异, 在卵巢II期表达量达到峰值, 之后逐渐下降; 在精巢Ⅰ期的表达量最高, 随着精巢发育逐渐下降。实验结果表明, PtUHRF1参与了三疣梭子蟹胚胎、幼体和性腺发育调控, 为进一步深入研究该基因在三疣梭子蟹及甲壳动物生长发育中的作用提供参考。     

青虾咽侧体抑制激素基因全长cDNA序列的克隆及表达分析

咽侧体抑制激素(Allatostatin, AST)是一类由几至几十个氨基酸构成的神经肽类激素, 在甲壳动物中刺激下颌器官合成甲基法尼酯, 影响甲壳动物的蜕皮和生殖。然而AST基因在甲壳动物中的克隆和表达却罕见报道。研究克隆了青虾的AST基因全长cDNA序列, 在甲壳动物中使用荧光定量PCR技术检测了AST基因在不同组织中的表达。青虾AST基因cDNA全长2995 bp, 包括242 bp的5′非编码区(UTR), 647 bp的3′UTR, 2106 bp的开放阅读框(ORF)。开放阅读框编码701个氨基酸, 可转录翻译出35个AST多肽, 在C末端都具有相同的Y/FXFGL-amide结构, 属于A型-AST。氨基酸序列比对显示保守氨基酸为Tyr、Ala、Phe、Gly、Leu。蛋白相似度比对显示, AST多肽在无脊椎动物的进化中是相对保守的。系统进化树分析表明, 青虾AST多肽与罗氏沼虾聚在一起, 具有最近的亲缘关系。荧光定量PCR检测显示, AST基因在所有被检测组织中均有表达, 由高到低依次为: 肝胰脏>肠道>精巢>脑>心脏>卵巢。对青虾AST基因全长cDNA序列克隆和表达的研究为更进一步的了解AST多肽在青虾中的重要功能奠定了基础。     

大黄鱼Lc-UBE2D4基因的克隆及其表达分析

泛素缀合酶E2是蛋白质泛素化系统中的关键酶,对降解的靶蛋白的特异性选择起决定性作用,参与了细胞内80%以上的蛋白降解,对于细胞周期调控、细胞凋亡、基因转录及表达等生理活动具有重要的调控作用。本研究从已构建的大黄鱼(Larimichthys crocea)性腺线性化c DNA文库中筛选出泛素缀合酶(Ubiquitin-conjugating enzymes E2 D4,Lc-UBE2D4)同源基因片段,利用SMART-RACE方法克隆出其全长c DNA序列,并利用荧光定量PCR技术检测其在大黄鱼不同组织和性腺不同发育阶段的差异表达情况。结果显示,Lc-UBE2D4基因全长798 bp,其中ORF为441 bp,可编码147个氨基酸,含有一段典型的泛素缀合酶UBC结构域及其半胱氨酸激活位点。定量PCR结果分析发现,Lc-UBE2D4在脾脏和性腺中表达量较高,在脾脏和精巢的表达水平极显著高于其他各组织(P0.01),同时在卵巢中的表达亦显著高于除脾脏和精巢外的其他各组织(P0.05);通过对Lc-UBE2D4基因在性腺不同发育阶段表达模式的研究发现,该基因在精巢3个时期中的表达水平显著高于各发育阶段的卵巢(P0.05),推测Lc-UBE2D4基因在大黄鱼性腺发育过程中起着重要的调节作用,脾脏中的高表达也暗示其可能参与免疫机能。     

双须骨舌鱼卵黄蛋白原基因vtg的克隆、组织表达和原核表达分析

为探究双须骨舌鱼(Osteoglossum bicirrhosum)卵黄蛋白原vtg基因的结构和表达特征,本研究运用RACE技术克隆双须骨舌鱼vtg全长c DNA序列。序列分析发现,双须骨舌鱼vtg的c DNA全长为5 325 bp,开放阅读框(ORF)为5 121 bp,其5′和3′非编码区(UTR)分别为46 bp和159 bp,共编码1 706个氨基酸,预测蛋白质分子量约为186.79 ku。同源性分析发现,双须骨舌鱼与同科的美丽仆骨舌鱼(Scleropages formosus)相似度达到84.78%,与鲤形目、鲈形目、鲱形目、鲽形目鱼类的相似度均高于50%。系统进化树分析结果显示,本文获得的双须骨舌鱼vtg基因与骨舌鱼目聚为一类,与鳗鲡目硬骨鱼类亲缘关系较近,与双须骨舌鱼进化地位相符。荧光定量PCR检测结果表明,在雌雄鱼性腺和肝中vtg均有表达,且在雌鱼肝中的相对表达量显著高雄鱼(P0.05),卵巢和精巢表达量无显著差异(P0.05);在雌雄鱼鳃、脾、肾、肌肉、心、头肾、脑等7个组织中均极微量表达,且无显著差异(P0.05)。在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期卵巢中vtg相对表达量依次增加,Ⅳ期显著高于Ⅱ和Ⅲ期(P0.05),也显著高于精巢Ⅳ期(P0.05);在雌鱼肝组织中呈先增后减趋势,且Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期之间无显著差异(P0.05),但每个时期都显著高于雄性(P0.05)。成功构建了原核表达载体p EASY-Blunt E2-vtg,并转入Transetta(DE3)表达感受态细胞中成功诱导出融合蛋白。Western-blotting检测显示,融合蛋白可被抗His标签特异性识别。综上表明,vtg表达水平高低与性别相关,并与性腺发育程度有关。此外,本研究结果也为后续深入研究卵黄蛋白原的生理功能打下基础。     

大口黑鲈amh基因全长cDNA克隆、表达及多克隆抗体制备

为研究大口黑鲈(Micropterus salmoides)抗缪勒氏管激素(amh)基因的表达及其在性腺发育中的潜在作用,研究利用RACE技术克隆得到了大口黑鲈amh基因,并制备Amh多克隆抗体,通过qRT-PCR、Western Blot分析Amh在大口黑鲈不同组织和不同发育阶段性腺中的表达模式,最后利用HE染色法和免疫组化观察不同发育阶段性腺的形态组织学变化及其与Amh表达的潜在关系。结果显示:大口黑鲈amh基因cDNA序列全长2050 bp,由24 bp5′非编码区、394 bp3′非编码区和1632 bp的开放阅读框组成,共编码543个氨基酸。amh基因mRNA在大口黑鲈11个组织中均有表达,其中雄鱼精巢中表达量最高,肌肉次之,雌鱼卵巢中表达量最高,肌肉次之。amh基因在雌雄鱼不同发育阶段的性腺中表达存在显著差异,精巢中表达量均显著高于卵巢(P<0.05)。同时, Western Blot结果显示Amh蛋白在精巢中表达丰度较高。amh基因在精巢中的表达量呈先上升后下降的趋势,且在孵化后65d鱼精巢中其表达量达到最高(P<0.05),免疫组化结果显示Amh表达于早期精...     

翘嘴鳜性腺型芳香化酶基因CYP19a的克隆及表达研究

采用同源克隆与SMART RACE技术首次分离和克隆了翘嘴鳜性腺型芳香化酶基因CYP19a的c DNA全长,并通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,q PCR)技术分析了其在翘嘴鳜成体不同组织及性腺不同发育时期的表达特点。序列分析结果显示,CYP19a基因全长1 873 bp(Gen Bank登录号为KX911988),其中开放阅读框长1 581 bp,编码526个氨基酸。通过多序列比对,发现该基因编码的蛋白质具有P450arom A特定的功能保守序列,包括I-螺旋区、Ozol肽区、亚铁血红素结合区域以及芳香化酶特异性结合区域;同时,CYP19a基因序列的同源性分析结果显示,其在脊椎动物中较为保守。此外,q PCR检测结果显示,CYP19a基因在翘嘴鳜成体组织中的表达存在显著差异(P0.05),主要在性腺中表达,其次在脑和肝脏有少量表达;而且CYP19a基因在繁殖期性腺中的表达量显著低于非繁殖期性腺中的表达量(P0.05)。以上研究表明,CYP19a基因在鱼类性腺形成及发育过程中具有重要作用。     

中华鳖Dmrt1基因的克隆、表达及在性逆转中的变化分析

在大部分脊椎动物中,Dmrt1基因在雄性性别决定和性腺分化中起重要的调控作用.本文从m RNA和蛋白水平分析Dmrt1基因的组织差异性表达、在不同发育阶段性腺中的细胞定位及在性逆转中的表达变化,研究Dmrt1基因在中华鳖性别分化中的调控作用.Rapid-amplification of c DNA ends(RACE)结果显示,Dmrt1基因c DNA序列全长2409 bp,其中5′非编码区为230 bp,3′非编码区为1072 bp,开放阅读框为1107 bp,编码368个氨基酸,具有一个高度保守的DM结构域.荧光定量PCR和免疫组化结果显示,Dmrt1在性腺分化之前的第16期雄性性腺中开始表达,先于Amh和Sox9基因表达.随着性腺的发育,Dmrt1蛋白主要定位于性腺Sertoli细胞的细胞核上,在雌性性腺发育过程中并未见其表达.此外,在雌二醇诱导的雄性转雌性性逆转胚胎性腺中,Dmrt1表达显著下调;在芳香化酶抑制剂诱导的雌性转雄性性腺中,Dmrt1表达则显著上升.上述研究表明,Dmrt1基因是中华鳖雄性特异性基因,参与雄性性腺的发育过程,可能在中华鳖早期性别决定中起重要的调控作用.     

牦牛FAF1基因的分子特征及其在不同阶段卵巢、输卵管、子宫中的表达

FAF1(Fas-associated factor-1)在多种细胞中可与Fas蛋白结合,介导细胞凋亡的启动,其基因突变可导致分裂期胚胎死亡。旨在探索牦牛FAF1基因的分子特征及其在不同阶段的生物学作用。试验选取雌性牦牛3个不同时期(卵泡期、黄体期和妊娠期第3个月,以下将妊娠期第3个月简称为妊娠期)的卵巢、输卵管和子宫,克隆牦牛FAF1基因,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、免疫组织化学和Western blot(WB)方法对其基因和蛋白的表达水平进行检测和定位。成功克隆出牦牛FAF1基因的编码区(CDS),长度为1 953 bp(GenBank登录号:MK416195),编码650个氨基酸,基因特征分析显示该基因具有高度保守性,其编码的蛋白为含5个蛋白结合位点的非跨膜、可溶性蛋白,主要分布于细胞核(52.2%)、线粒体(26.1%)、细胞质(13.0%)、高尔基体(4.3%)、细胞骨架(4.3%)。qRT-PCR结果显示:卵巢中FAF1基因在卵泡期表达最高,妊娠期次之,黄体期最低;输卵管中黄体期最高,子宫中卵泡期最高,妊娠期次之,黄体期最低;蛋白水平显示:妊娠期输卵管和子宫FAF1蛋白相对表达量显著高于卵泡期和黄体期,卵巢在黄体期的表达量最高,卵泡期次之,妊娠期最低。免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)结果显示不同阶段FAF1蛋白在同一组织中表达部位并无明显的差异,在卵巢中主要表达部位为卵巢生殖上皮、颗粒细胞、卵泡膜细胞和黄体细胞(黄体期);在输卵管中主要表达部位为黏膜上皮细胞;在子宫中主要表达部位为子宫内膜细胞、子宫腺。FAF1基因和蛋白的表达存在显著差异,揭示其对牦牛的生殖生理调控具有重要意义。     

Minifish dazl和dnd基因的克隆及表达分析

Minifish(Paedocypris progenetica)是目前世界上发现的个体最小的鱼,是探索生物进化及多样性的优良脊椎动物。当前,受人类活动影响,其生存空间日渐压缩,种群数量快速减少,研究该物种的生殖发育对维持及扩大其种群数量具有重要意义。本研究首次克隆了minifish dazl(Pp-dazl)和dnd(Pp-dnd)基因,Pp-dazl c DNA长为678 bp核酸,编码218个氨基酸;Pp-dnd c DNA长为1 071 bp核酸,编码352个氨基酸。氨基酸比对分析显示,Pp-Dazl和Pp-Dnd蛋白含有保守的RNA结合结构域。系统进化树分析表明,Pp-dazl和Pp-dnd与鲤科鱼类的同源蛋白亲缘关系最近。RT-PCR表明Pp-dazl和Pp-dnd RNA具有组织表达特异性,仅在成体组织中的性腺如卵巢中表达。本研究预示了Pp-dazl和Pp-dnd RNA在minifish性腺及生殖发育中具有重要作用,为minifish的生殖发育研究提供了基础信息。     

银鲫转录调控因子lbh-b cDNA克隆与表达分析

Lbh (Limb-bud and heart)基因是脊椎动物中高度保守的转录调控因子, 在早期胚胎发育及某些人类疾病的发病过程中发挥着重要作用。我们前期在银鲫(Carassius gibelio)垂体转录组中筛选到一个在垂体中大量表达的基因lbh-b。为了进一步研究lbh基因在银鲫的表达特征, 首先采用RACE方法克隆了银鲫lbh基因家族的成员lbh-b基因(Cglbh-b)。Cglbh-b的cDNA全长1526 bp, 开放阅读框549 bp, 共编码182个氨基酸。生物信息学分析表明CgLbh-b蛋白与其他脊椎动物的Lbh蛋白同源性在68%以上, 可能也是无序蛋白质家族的成员之一。成体组织RT-PCR分析表明Cglbh-b仅在银鲫的垂体、端脑、卵巢及眼睛中表达。不同胚胎发育时期的表达分析表明, 在受精卵至原肠胚中Cglbh-b转录产物是以母源形式存在的mRNA, 其合子转录起始于尾芽期。胚胎整体原位杂交结果显示从受精后2d到受精后3d, Cglbh-b大量表达于脑和眼睛。此外, 随着卵子成熟Cglbh-b在银鲫垂体中的表达上调。这些结果暗示, Cglbh-b可能在调控银鲫脑和眼睛的发育以及卵子成熟过程中发挥着重要作用。     

A mouse homolog of the Saccharomyces cerevisiae meiotic recombination DNA transesterase Spo11p.

The Saccharomyces cerevisiae Spo11 protein is thought to catalyze formation of the DNA double-strand breaks that initiate meiotic recombination. We have cloned cDNA and genomic DNA for a mouse gene encoding a protein with significant sequence similarity to conserved domains found in proteins of the Spo11p family. This putative mouse Spo11 gene maps to the distal region of chromosome 2 (homologous to human chromosome 20q13.2-q13.3) and comprises at least 12 exons, spanning approximately 15-18 kb. Strong expression of the Spo11 message is seen in juvenile and adult testis by RNA in situ hybridization, RT-PCR, and Northern blot, with much weaker expression in thymus and brain. In situ hybridization detects expression in oocytes of embryonic ovary, but not of adult ovary. RT-PCR and in situ hybridization analyses of a time course of juvenile testis development indicate that Spo11 expression begins in early meiotic Prophase I, prior to the pachytene stage, with increasing accumulation of mRNA through the pachytene stage. Taken together, these results strongly suggest that this gene encodes the functional homolog of yeast Spo11p, which in turn suggests that the mechanism of meiotic recombination initiation is conserved between yeast and mammals.     

Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1 (Uch-L1) correlates with gonadal transformation in the rice field eel

The ubiquitin-proteasome pathway is crucial for a variety of biological processes, including spermatogenesis. Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1 (Uch-L1) is thought to associate with monoubiquitin to control ubiquitin levels. Here, we report the identification of Uch-L1 cDNA from the testis of the rice field eel, a natural sex reversal vertebrate, by using cDNA microarray analysis. Uch-L1 encodes a protein of 220 amino acids that shows high homology to Uch-L1 of vertebrates, especially fish species. Both mRNA and protein are mainly expressed in testis, ovotestis and ovary, as well as in the brain. Immunohistochemistry analysis revealed differential expression of Uch-L1 in three kinds of gonads. In the ovary, expression of Uch-L1 was observed mainly in the developing ovary and slightly in the mature ovary. In ovotestis during the intersex stage, Uch-L1 was expressed in the male gonad epithelium and degraded ovary. In testis, expression was observed in developing germ cells, including spermatogonia and spermatocytes. Furthermore, Uch-L1 was upregulated during gonadal transformation, especially from the beginning of the intersex stage onwards. Native-PAGE showed that Uch-L1 underwent dimerization and oligomerization in gonads, and that the relative level of dimerization/oligomerization decreased during gonadal transformation. Simultaneously, ubiquitin polypeptide expression was upregulated during this process. These results suggest that Uch-L1, via the ubiquitin-proteasome system, may play an important role not only in gametogenesis, but also in the gonadal transformation process in the rice field eel.     

Cloning and expression analysis of androgen receptor gene in chicken embryogenesis

We cloned a full-length androgen receptor (AR) cDNA from chicken (Gallus gallus) gonads. The cDNA sequence has an open reading frame of 2109 bp encoding 703 amino acids. The chicken AR (cAR) shares high homology with ARs from other species in its amino acid sequences, in particular DNA binding domain (DBD) and ligand binding domain (LBD). RT-PCR analysis revealed that cAR mRNA is expressed in several embryonic tissues of both sexes, and relatively higher expression was observed in left ovary compared with testis. The immunoreactive signal of AR was co-localized within the ovarian cell nucleus, while such nuclear localization was not detected in those of testis. To get insight on the possible role of androgen-AR signaling during gonadal development, non-steroidal AR antagonist, flutamide, was administrated in ovo. The treatment induced the disorganization of sex cords in ovarian cortex at day 12 of incubation. The effect was restored by testosterone co-treatment, implying the possibility that AR mediated signaling may be involved in ovarian morphogenesis. Furthermore, co-treatment of flutamide with estradiol-17beta (E2) also restored the phenotype, suggesting androgen-AR signaling might activate aromatase expression that is necessary for estrogen synthesis. These findings suggest androgen-AR signaling might contribute to chicken embryonic ovarian development.     

翘嘴鲌胰岛素样生长因子igf3基因的克隆及表达分析

为研究翘嘴鲌(Culter alburnus Basilewsky)胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factor 3, igf3)基因在性别调控过程中的作用, 基于分子克隆手段RT-PCR和RACE技术相结合方法扩增到翘嘴鲌igf3基因完整cDNA序列, 利用qRT-PCR技术检测其在不同组织中的表达水平, 最后通过甲基化检测方法比较分析了翘嘴鲌性腺组织igf3基因组水平的CpG岛修饰水平。实验结果显示igf3 cDNA序列全长901 bp, 包含92 bp的5′端非编码区和203 bp的3′端非编码区, 开放阅读框606 bp, 编码201个氨基酸。序列分析显示, 类似于其他IGF家族成员igf1和igf2, igf3同样存在保守的特征结构域, 主要划分为前体信号肽、B、C、A、D和E区。igf3基因在翘嘴鲌不同组织中的表达水平差异明显(P<0.05), 在卵巢中表达量最高, 其次是精巢组织, 而在脑、心脏、脾脏、肝脏、肌肉和肾脏中表达丰度极低。甲基化检测结果显示在卵巢中CG位点几乎不发生甲基化, 然而精巢中的甲基化程度非常高, 这与其表达水平正好呈负相关。研究结果表明igf3可能参与了性腺的形成或功能维持, igf3基因组启动子区域的DNA甲基化修饰与其在性腺组织的二态性表达特征关系密切。