肠道病毒A71型亚单位蛋白对RD细胞自噬活化的影响

肠道病毒A71型（Enterovirus-A71, EV-A71）能够活化宿主细胞的自噬并依赖自噬促进其复制,然而EV-A71的亚单位蛋白对自噬的活化目前仍不清楚。为探讨EV-A71亚单位蛋白对人横纹肌肉瘤（Human rhabdomyosarcoma, RD）细胞自噬活化的影响,将EV-A71的亚单位蛋白重组真核质粒转染至RD细胞,采用抑制剂MK-2206阻断PI3K/Akt途径,共聚焦显微镜和免疫印迹检测自噬活化。过表达EV-A71亚单位蛋白的RD细胞中PI3K/Akt途径、p38、JNK和ERK途径均呈现不同程度活化,同时RD细胞呈现出绿色荧光表明自噬发生活化,特别是EV-A71的VP2和2A。EV-A71亚单位蛋白使LC3-II/LC3-I的转化水平提升,EV-A71亚单位蛋白（VP2、VP3、VP4、2A、2B和2C）显著提升p62的表达水平,EV-A71 VP1显著下调p62的表达水平但显著上调LAMP-1和LAMP-2的表达水平。阻断PI3K/Akt途径后,过表达EV-A71亚单位蛋白的RD细胞绿色荧光强度显著减弱、自噬被阻断,同时LC3-II/LC3-I的转化水平显著降...     

基于反向遗传学技术获取具有精确末端的EV-A71

目的基于反向遗传学技术,设计可获取具有精确末端的肠道病毒A71(enterovirus A71, EV-A71)的方法,并在病毒感染能力研究和抗病毒药物筛选中进行应用。方法利用同源重组方法,在病毒基因组5′末端,引入具有顺式酶切活性的锤头状核酶(cis-active hammerhead ribozyme)序列;在病毒3′末端的poly(A)尾后,引入限制性核酸内切酶NsiⅠ酶切位点(ATGCA↓T),构建含有EV-A71全长感染性克隆的质粒(pBR322-EV-A71)。pBR322-EV-A71经体外转录获得EV-A71感染性RNA,用该RNA转染横纹肌肉瘤细胞(rhabdomyo-sarcoma cells, RD),以获取具有精确末端的EV-A71颗粒。通过检测病毒RNA拷贝数、病毒蛋白的表达量等指标,验证拯救病毒的感染能力和抗病毒药物的抑制作用。结果 pBR322-EV-A71经体外转录所得RNA,在转染进入RD细胞后,观察到细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)并检测到病毒负链RNA,表明成功合成了EV-A71颗粒;拯救病毒颗粒在连续传代过程中,病毒增殖能力得以逐步提升,第4代病毒(R4 EV-A71)的感染能力强于第1、2、3代病毒(R1、R2、R3 EV-A71)(P<0.001),且已趋近于野毒株(wild-type EV-A71, wt EV-A71)水平(P>0.05);U0126和sorafenib两种ERK通路抑制剂可以有效抑制R4 EV-A71的增殖(P<0.001),且R4 EV-A71与wt EV-A71表现出同等程度的抑制作用。结论 pBR322-EV-A71可拯救出具有精确末端的EV-A71病毒颗粒,且其子代病毒可代替wt EV-A71进行病毒感染能力的评价和抗病毒药物的筛选。     

肠道病毒A71型致人扁桃体上皮细胞系UT-SCC-60B凋亡和S期阻滞的研究

肠道病毒A71型(Enterovirus A71,EV-A71)是手足口病的重要病原体,为研究EV-A71感染人扁桃体上皮细胞后对细胞凋亡和细胞周期的影响,确定ERK1/2、JNK1/2、PI3K/Akt和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)的作用,本文以人扁桃体上皮细胞系UT-SCC-60B为细胞模型,CCK-8试剂盒检测EV-A71对UT-SCC-60B的抑制率、流式细胞仪检测EV-A71感染组和抑制剂处理组的凋亡和细胞周期、Caspase活力检测试剂盒测定Caspase-3,Caspase-8,Caspase-9活力。EV-A71以感染剂量和感染时间依赖方式抑制UT-SCC-60B增殖;EV-A71感染致UT-SCC-60B发生细胞凋亡,抑制ERK1/2、JNK1/2和PI3K/Akt能够降低UT-SCC-60B细胞凋亡比例;EV-A71感染UT-SCC-60B后发生S期阻滞,抑制ERK1/2、JNK1/2、PI3K/Akt和Caspase阻止UT-SCC-60B发生S期阻滞;EV-A71感染UT-SCC-60B能够活化Caspase-3,Caspase-8,Caspase-9且ERK1/2、JNK1/2和PI3K/Akt调控Caspase-3,Caspase-8,Caspase-9活力。因此,EV-A71能够导致人扁桃体上皮细胞UT-SCC-60B发生凋亡和S期阻滞,并且ERK1/2、JNK1/2、PI3K/Akt和Caspase参与凋亡和S期阻滞的调控。     

脑心肌炎病毒VP1蛋白100位氨基酸的突变导致其对小鼠致病性的改变

作为脑心肌炎病毒(EMCV)的天然宿主,感染小鼠能引发多种疾病,其中包括脑炎、心肌炎及糖尿病.本研究利用之前构建完成的EMCV分离毒株BJC3的野生型感染性克隆,采用定点突变方法构建了4个VP1第100位氨基酸突变的突变株感染性克隆(VP1第100位氨基酸分别突变为丝氨酸、丙氨酸、异亮氨酸和脯氨酸)并获得了拯救病毒.虽然各突变病毒及野生型亲本拯救病毒在BHK-21细胞上形成的噬斑大小有所不同,但各病毒在BHK-21细胞上的复制水平未见差异.通过对突变病毒致病性进行系统分析,探究了VP1第100位氨基酸在病毒致病性及感染后疾病表型中所起的重要作用.结果表明,异亮氨酸和脯氨酸突变病毒对小鼠的致死率降低,脑中病毒载量减少且脑组织损伤轻微,而丝氨酸和丙氨酸突变病毒表现了与野生型亲本病毒相似的高致病性.结果证实,EMCVVP1第100位苏氨酸在病毒的体内复制中起重要作用,其突变会导致病毒对小鼠致病性的改变.     

人肠道病毒A71型分离株全基因组序列及毒力相关位点分析

为了解人肠道病毒A71型(Enterovirus A71,EV-A71)的基因重组和遗传进化特征,探索其毒力相关位点。本研究通过对郴州市3株EV-A71分离株进行全基因组序列测定和分析,应用RDP软件(版本4.1.6)将其与231条EV-A71全基因组序列进行比较分析,检测可能的重组事件及重组位点;采用SimPlot软件(版本号3.5.1)对重组序列、2条亲本序列和其他A组肠道病毒(EV-A)代表株序列进行相似性分析;采用MEGA软件(版本5.2)构建系统发生树;结果发现郴州市3株EV-A71毒株均检测到重组信号,其共同的亲本主序列为广东省2009年毒株,亲本亚序列为中国台湾地区2008年毒株;我国C4b进化分支EV-A71代表株(分离于1998年的SHZH98株)和C4a进化分支EV-A71代表株(分离于2008年的安徽阜阳株)均与CVA4、CVA14及CVA16原型株在3D区域检测到型间重组信号。采用SPSS软件(版本19.0)对不同病例类型的变异位点作卡方检验以筛选出可能的毒力相关位点。发现死亡病例组与重症病例组间未找到具有统计学意义的突变位点;而死亡与重症病例合并组与一般病例组进行比较,共发现18个突变位点具有统计学意义,这些突变位点仅分布于P2区和P3区,而P1区未见。我国大陆的EV-A71流行株与EV-A其他毒株的型间重组早在1998年前即已经发生,并且在2008~2012年的手足口病暴发疫情中,EV-A71的型内重组频繁发生。此外,EV-A71毒力的改变可能与非衣壳蛋白区的变异相关,因此应该关注非衣壳蛋白基因改变对病毒毒力的影响。     

EV-A71感染小鼠巨噬细胞诱导促炎细胞因子和趋化因子反应

为初步探索EV-A71在小鼠巨噬细胞中的复制情况和抗病毒的固有免疫应答,本文以小鼠巨噬细胞系RAW264.7为细胞模型,通过建立EV-A71绝对定量qPCR方法检测EV-A71病毒载量;EV-A71和紫外灭活的EV-A71感染RAW264.7,不同时间点提取总RNA,RT-qPCR检测促炎细胞因子、趋化因子和模式识别受体的mRNA表达变化水平。本研究成功建立了EV-A71的绝对定量qPCR检测方法,并发现EV-A71感染RAW264.7后随着感染时间的延长,EV-A71病毒载量呈递减趋势;EV-A71和紫外灭活的EV-A71可以引起IL-1β、IL-6、TNF-α促炎细胞因子和IP-10、MCP-1、MIP-1α趋化因子反应,上调TLR2、TLR1、TLR6、MDA5和RIG-I mRNA表达。研究结果显示,EV-A71在小鼠巨噬细胞中具有较低水平的复制,同时产生促炎细胞因子和趋化因子反应。     

2013年至2018年辽宁省柯萨奇病毒A10型分离株VP1区基因特征分析

为了解辽宁省地区手足口病患者中分离到的柯萨奇病毒(Coxsackievirus)A10型VP1区基因特征,收集了2013年至2018年辽宁省14个市送检的手足口病患者非EV-A71和非CV-A16肠道病毒的阳性标本,通过细胞培养法分离肠道病毒,提取病毒RNA;通过RT-PCR法进行肠道病毒VP1区基因扩增和序列测定;利用BLAST对测序结果比对后确定病毒基因型;对鉴定为CV-A10的分离株进行VP1区同源性分析,并构建系统进化树。2013年至2018年辽宁省共收到非EV-A71和非CV-A16其他肠道病毒的阳性标本9 431份,用人横纹肌瘤细胞(rhabdomyosarcoma cells, RD)分离出CV-A10 165株。CV-A10分离株间的VP1区基因核苷酸同源性为91.3%～100%,氨基酸同源性为93.9%～100%,和A、B、C、D各基因型之间的VP1区同源性比较,与C基因型代表株的同源性最高,核苷酸同源性为92%～100%,氨基酸同源性为93.9%～100%。系统进化树分析表明,辽宁省CV-A10分离株为C基因型。CV-A10是引起辽宁省手足口病的重要病原体,CV-A10分离株与C基因型代表株处于同一分支上均属C基因型,有C1和C2两个进化分支共同流行,其中C2分支是优势流行株。     

EV71小鼠适应株制备及体内外感染特点

目的用1日龄ICR小鼠传代制备EV71小鼠适应株,研究EV71亲代株与小鼠适应株的体内外感染特点,建立EV71感染ICR小鼠动物模型,为病毒疫苗和抗病毒药物的研究提供实用的动物评价工具。方法用1日龄ICR小鼠进行EV71病毒(Fuyang-0805)的传代,得到小鼠传代株。以一定浓度亲代株和传代株病毒分别接种RD、Vero、SY5Y、Caco-2四种细胞,定量方法检测各时间点不同毒株在四种细胞上的复制数量,CCK8方法测定各时间点细胞的存活率;同时,两毒株分别腹腔注射感染1日龄小鼠,定期安乐死动物,采集肺、小肠、骨骼肌、大脑四种器官组织,进行动物体内病毒半定量和定量分析,同时进行各器官组织病理学观察、免疫组织化学鉴定。结果与亲代毒株相比较,小鼠传代株(EV71-MMP4)表现出更强的肌肉来源细胞嗜性与毒性;同时,两毒株腹腔注射感染1日龄小鼠后,EV71-MMP4感染的小鼠体重增长较正常小鼠体重增长缓慢;半定量和定量RT-PCR显示,在小鼠肌肉中的病毒载量于感染后1d和5d达到高峰。EV71-MMP4感染组感染率较高、病毒组织分布较广、感染持续性较好、病毒载量较高,高剂量病毒感染后小鼠小肠、心肌和骨骼肌可观察到细胞空泡变性、淋巴细胞浸润等病理变化。免疫组织化学显示感染后小鼠骨骼肌有EV71病毒特异分布。结论阜阳EV71小鼠适应株表现出较亲代毒株更好的小鼠易感性、细胞毒性,所建立的动物模型可用于EV71病毒致病机制、感染特点的研究和病毒疫苗及药物的评价。     

新型病毒衣壳结合剂 哌嗪新衍生物抑制肠道病毒71型的复制

目的研究哌嗪新衍生物体外对肠道病毒71型(EV71)的抑制作用。方法培养EV71感染的人横纹肌肉瘤RD细胞,建立体外病毒感染模型,将哌嗪新衍生物作用于RD细胞,通过Western blot、Real-time PCR和病毒滴度检测细胞内EV71病毒蛋白和mRNA的表达水平及培养基上清中子代病毒颗粒的数量;并且观察细胞病变效应(CPE),采用CCK-8法检测哌嗪新衍生物对细胞活性的影响。结果哌嗪新衍生物VP1-4浓度为5μg/mL能够显著抑制RD细胞中EV71 VP1蛋白的表达,EV71 mRNA水平降低了(93.8±3.1)%,IC_(50)约为0.016μg/mL,培养基上清病毒滴度降低了(51.1±0.8)%;而且VP1-4能够减缓EV71病毒感染引起的CPE。此外,化合物VP1-4 CC_(50)200μg/mL,说明细胞毒性低,安全性较高。结论本研究证实VP1-4能有效抑制EV71的复制,可以作为先导化合物开展进一步研究。     

安徽省2017-2018年手足口病柯萨奇病毒A6型基因进化特征分析

人肠道病毒A组71型(Enterovirus A71,EV-A71)和柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CV-A16)是引起手足口病(Hand,foot,and mouth disease,HFMD)的主要病原体.近年来非EV-A71和非CV-A16的其他肠道病毒(Enterovirus,EV)已成为HFMD流行或暴发疫情的优势病原体.安徽省HFMD监测数据显示,2017-2018年HFMD样本非EV-A71和非CV-A16其他EV核酸阳性率超过50％,其中大部分为柯萨奇病毒A组6型(Coxsackievirus A6,CV-A6).为了解安徽省2017-2018年HFMD其他肠道病毒构成和CV-A6基因进化特征,本研究收集2017-2018年HFMD咽拭子EV核酸阳性标本,采用人横纹肌肉瘤(RD)细胞进行病毒分离培养,对分离到的CV-A6毒株VP1全长序列基因扩增及核苷酸序列测定.从NCBI GenBank数据库下载CV-A6原型株和代表性毒株基因参考序列,运用生物软件MEGA 6.0构建VP1基因序列系统进化树,分析其基因遗传特征.结果 显示,安徽省2017-2018年HFMD实验室确诊病例其他EV占66.1％,CV-A16占23.5％,EV-A71占10.4％.52株CV-A6毒株均为D3a基因亚型,其VP1区核苷酸序列间相似度为93.7％～100％,编码的氨基酸序列相似度为98.3％～100％;与CV-A6 Gdula原型株核苷酸相似度为78％～82.3％,氨基酸相似度为94.6％～96.3％.VP1区15个氨基酸位点有变异,氨基酸位点Q98L和G160S的变异发生率为100％.其他EV已成为安徽省引起HFMD流行的重要病原体,D3基因型CV-A6为优势流行毒株.持续加强其他EV的病原学监测与分析,对安徽省HFMD防控策略制定与疫情处置具有重要意义.     

人肠道病毒A71型分离株全基因组序列及毒力相关位点分析北大核心CSCD

为了解人肠道病毒A71型（Enterovirus A71,EV-A71）的基因重组和遗传进化特征,探索其毒力相关位点。本研究通过对郴州市3株EV-A71分离株进行全基因组序列测定和分析,应用RDP软件（版本4.1.6）将其与231条EV-A71全基因组序列进行比较分析,检测可能的重组事件及重组位点;采用SimPlot软件（版本号3.5.1）对重组序列、2条亲本序列和其他A组肠道病毒（EV-A）代表株序列进行相似性分析;采用MEGA软件（版本5.2）构建系统发生树;结果发现郴州市3株EV-A71毒株均检测到重组信号,其共同的亲本主序列为广东省2009年毒株,亲本亚序列为中国台湾地区2008年毒株;我国C4b进化分支EV-A71代表株（分离于1998年的SHZH98株）和C4a进化分支EV-A71代表株（分离于2008年的安徽阜阳株）均与CVA4、CVA14及CVA16原型株在3D区域检测到型间重组信号。采用SPSS软件（版本19.0）对不同病例类型的变异位点作卡方检验以筛选出可能的毒力相关位点。发现死亡病例组与重症病例组间未找到具有统计学意义的突变位点;而死亡与重症病例合并组与一般病例组进行比较,共发现18个突变位点具有统计学意义,这些突变位点仅分布于P2区和P3区,而P1区未见。我国大陆的EV-A71流行株与EV-A其他毒株的型间重组早在1998年前即已经发生,并且在2008~2012年的手足口病暴发疫情中,EV-A71的型内重组频繁发生。此外,EV-A71毒力的改变可能与非衣壳蛋白区的变异相关,因此应该关注非衣壳蛋白基因改变对病毒毒力的影响。     

PB2 E627K对A/H6N1亚型禽流感病毒致病性的影响分析

目的利用A/H6N1亚型禽流感病毒的反向遗传平台,评估PB2 E627K对A/H6N1亚型禽流感病毒的致病性,探究A/H6N1流感病毒的致病性分子基础。方法通过A/H6N1亚型禽流感病毒A/Mallard/San-Jiang/275/2007株反向遗传操作系统和点突变技术拯救病毒rA/H6N1和PB2 E627K位点发生突变的rA/H6N1-627,两株拯救病毒分别以101EID50～106EID50的攻毒剂量人工感染BALB/c小鼠,通过体重变化、死亡率、病毒滴定等方面进行致病性分析。结果成功构建A/H6N1亚型禽流感病毒的反向遗传平台,rA/H6N1的8个基因片段完全源于A/H6N1的基因组,核苷酸序列及生物学特性与A/H6N1完全一致。rA/H6N1能够人工感染BALB/c小鼠,但不致死,对BALB/c小鼠呈现低致病性(MLD50>106.5EID50),病毒在小鼠体内的分布情况及各个脏器中的病毒滴度与A/H6N1保持一致;rA/H6N1-627能感染小鼠,引起小鼠体重下降,但不能引起所有106EID50组小鼠死亡,病毒能在小鼠的肺脏和脑部进行增殖。结论实验结果表明,在H5N1禽流感中发挥重要作用的PB2-E627K位点并非A/H6N1流感病毒的毒力决定因子。A/H6N1流感病毒致病性的分子基础还有待继续研究,该反向遗传操作系统和点突变技术的建立为研究该亚型流感病毒致病机制、传播机制及病毒基因功能奠定了基础,同时也为A/H6N1亚型禽流感病毒新型疫苗的研制开辟了新途径。     

CV-A16和EV-A71感染对肠道上皮细胞间连接分子排布和表达的影响

柯萨奇病毒A组16型(Coxsakievirus A 16,CV-A16)与肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV-A71)是引发手足口病(Hand foot and mouth disease,HFMD)的两种主要病原体,然而两者的致病机理仍未完全被阐明。病毒感染对肠道上皮细胞间连接分子排布和表达直接与病毒感染造成的后果相关。本研究通过右旋糖苷穿透实验、免疫荧光以及蛋白免疫印迹等技术检测了CV-A16和EV-A71感染对肠道上皮细胞系(Intestinal epithelial celDFHC后细胞通透性的变化以及细胞间连接分子排布和表达情况。研究结果表明,CV-A16和EV-A71感染FHC可导致其通透性显著增强、连接分子Nectin1、Claudin4、Claudin5、ZO-1以及E-Cadherin的排布被破坏,且表达量显著性降低。这一结果提示了CV-A16和EV-A71感染肠道FHC细胞并在细胞中复制引起肠道上皮细胞损伤,导致肠道上皮细胞间连接分子排布的改变和表达量的减少。     

Ⅰ型脊髓灰质炎病毒壳蛋白肽图谱分析

脊髓灰质炎病毒三个血清型的野毒株与疫苗株的全基因序列业已测出,有学者比较发现,疫苗株病毒在减毒过程中有许多基因位点发生了突变。本文用单向肽图谱分析法,对Ⅰ型脊髓灰质炎病毒野毒株(Mahoney株)和减毒株(Sabin Ⅰ株)的外壳蛋白VP1,VP2,VP3分别作了比较分析。结果发现四个有差     

细胞膜转运分子ABCC3和SLC7A7在肠道病毒A71型感染中作用的初步研究

肠道病毒A71型(enterovirus A71, EV-A71)是导致手足口病(hand-foot-mouth disease, HFMD)的主要病原体之一,目前对其治疗尚无特异高效的抗病毒药物。研究表明,细胞膜转运相关分子参与病毒的入侵、复制以及感染性子代病毒颗粒的释放。为寻找宿主中可有效抑制EV-A71感染的细胞膜转运分子,本研究以人结肠癌细胞(Caco-2)为靶细胞,采用RNA干扰技术下调细胞中14个转运相关膜蛋白的表达。结果显示,针对这14个膜蛋白目的基因设计的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)均能有效抑制靶蛋白的表达,有效抑制率达50%以上(P＜0.05),且各siRNA转染均未对细胞产生明显毒性。其中,转染ATP结合盒转运蛋白C3(ATP-binding cassette transport subfamily C member 3,ABCC3)siRNA(SEQ ID NO: 1)和溶质载体家族7成员7 (solute carrier family 7 member 7,SLC7A7)siRNA(SEQ ID NO: 29)的干扰效率分别高达87.82%和88.44%。ABCC3和SLC7A7基因下调可明显抑制EV-A71的复制,抑制率分别达87.05%和81.66%。结果表明,ABCC3和SLC7A7在EV-A71感染Caco-2细胞中发挥着重要作用,可为临床 EV-A71 感染的预防和治疗提供潜在靶点。     

姜黄素通过p38 MAPK/NLRP3抑制肠道病毒71型诱导的细胞焦亡

肠道病毒-A71型(EV-A71)重症感染患儿多表现为过激的炎症反应，病毒感染引起的细胞焦亡可能是机体炎症发生的重要原因之一。本文旨在探究姜黄素对EV-A71病毒感染引起的细胞焦亡与细胞损伤的保护作用及可能的机制。首先，观察了姜黄素对EV-A71引起的细胞毒性的影响。CCK8检测结果显示，EV-A71感染降低细胞的增殖活力；LDH测定表明，病毒增加细胞培养上清中LDH的释放，造成了细胞的损伤；DAPI核染色及Dil细胞膜染色后观察到，EV-A71感染引起了细胞的形态变化和数量减少。姜黄素可以逆转病毒引起的上述变化，提示姜黄素对病毒感染的细胞毒性具有保护作用。细胞焦亡发生时，可促进炎症因子IL-1β的成熟、产生和释放。我们观察了EV-A71及姜黄素干预对细胞IL-1β产生的影响。Western印迹结果显示，病毒感染细胞内IL-1β的活化增加。ELISA检测结果显示，EV-A71病毒感染引起细胞上清中IL-1β的分泌水平增加；qPCR测定结果显示，EV-A71病毒感染细胞中IL-1β的转录水平上调；而姜黄素干预可抑制染毒细胞IL-1β的活化和分泌。Western印迹检测细胞内焦亡相关分子的...     

2007―2008年肠道病毒71型北京地区分离株的VP4基因序列分析

为了解2007 ― 2008 年北京地区流行的肠道病毒71 型( EV71) 是否存在基因序列变异及其与病毒毒力的关系, 我们选择2007 年分离的3 株EV71( 其中1 株分离自重症手足口病患儿的咽拭子标本, 其余2 株分离自普通手足口病患儿咽拭子标本) 和2008 年分离的5 株EV71( 其中3 株分离自重症手足口病患儿的咽拭子或鼻拭子标本, 2 株分离自普通手足口病患儿的疱疹液标本) , 提取基因组RNA, 经反转录-聚合酶链反应( RT-PCR) 扩增得到VP4 基因片段, 并进行核苷酸序列测定, 使用生物信息软件与GenBank 中的EV71 VP4 基因进行序列及病毒型别分析。结果表明, 所测得的8 株EV71 VP4 基因全长均为207 bp, 编码69 个氨基酸, 理论相对分子质量( Mr) 为7 ×10³。8 株EV71 病毒VP4 基因的核苷酸同源性在94% ～100% , 与GenBank 中其他EV71 病毒株VP4 的核苷酸同源性为82% ～100% , 与阜阳、深圳和台湾等地区流行的EV71 VP4 的核苷酸同源性比其他地区高。除了与印度报道的VP4 编码的氨基酸在第7 和54 位不同外( 印度株: 7 位蛋氨酸, 54位苏氨酸; 其余株7 位苏氨酸,54 位丙氨酸) , 这8 株EV71 VP4 编码的氨基酸序列之间以及与其他EV71 VP4编码的氨基酸同源性均为100%。8 株EV71 病毒VP4 与文献报道的3 株重症感染病毒株VP4 ( BrCr、MS 和NCKU9822) 核苷酸有较大差别, 而8 株病毒株中从重症感染( BJ97、BJ110B、BJ110Y 和BJ4243) 与轻症感染( BJ25、BJ47、BJ65 和BJ67) 分离到的毒株之间VP4 基因序列未见明显改变, 只有几个核苷酸存在差别。VP4 核苷酸序列的进化树分析表明, 这8 株EV71 均属于C4 亚型, 显示2007 ― 2008 年北京地区流行的EV71的VP4 基因相当保守, 分离自伴有神经系统感染的重症手足口病和普通手足口病患儿的EV71 的VP4 基因之间在核苷酸水平未出现同样的变异。结果提示, 近2 年来北京地区所流行的EV71 属C4 亚型。     

2010年山东省环境污水中脊髓灰质炎病毒的监测及其基因特征分析

本研究在山东省开展了脊髓灰质炎病毒(Poliovirus,PV)的外环境监测,从济南、临沂两地采集污水标本,浓缩处理后进行病毒分离,对分离到的PV采用中和试验进行血清定型,并对其VP1及3D区进行序列测定,分析其基因突变和重组情况。2010年,共采集污水标本32份,PV阳性10份,阳性率31.3%;分离到18株PV(PV1型3株,PV2型9株,PV3型6株),均为疫苗相关株,VP1完整编码区核苷酸变异数在0~4个之间,在3株PV2型病毒和4株PV3型病毒的基因组中发现重组;对VP1区影响神经毒力的减毒位点分析发现,PV1型病毒中有1株在nt 2 749发生突变(A→G),PV2型病毒中有1株在nt2 908发生A→G突变,3株在nt2 909发生U→C突变,6株PV3型病毒全部在nt2 493发生C→U突变。环境污水中可以分离到PV,其基因重组率和主要减毒位点的回复突变率较高,未发现脊灰野毒株和疫苗衍生株脊灰病毒(Vaccine-derived poliovirus,VDPV)。     

三株传染性法氏囊病病毒A节段全长基因组结构和编码蛋白的序列分析

用长距离RT PCR方法分别克隆了浙江地区传染性法氏囊病病毒 (IBDV)细胞致弱株HZ2、弱毒疫苗株JD1和野毒株ZJ2 0 0 0的A节段基因组全长 ,三毒株的A节段均长 32 59bp ,都包含两个相互重叠的开放阅读框架和两端的 5′ ,3′ 非编码区 (NCR)。它们在核苷酸和推导的四种病毒蛋白VP2、VP3、VP4、VP5的氨基酸水平上高度同源 ,并具有位于VP2高变区的特征性氨基酸H2 53、N2 79、T2 84、R330 ,这些氨基酸是弱毒株和几个强毒株的标志。野毒株ZJ2 0 0 0的高强毒力可能与VP2高变区和VP2 VP4剪切位点附近的几个突变有关。序列比较进一步支持VP2并非是决定IBDV毒力的唯一因素。不同毒力表型毒株的两端NCR序列高度保守提示NCR可能与IBDV毒力并不直接相关。另外 ,根据VP5在十种不同表型毒株中高度保守 ,作者提出了一种VP5与病毒毒力关系的推测     

表达猪细小病毒VP2蛋白的重组猪伪狂犬病毒在小鼠体内的免疫反应

为了研制出能够同时预防猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)和猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)的二联活疫苗,本研究将PPV VP2基因克隆到伪狂犬病毒通用转移质粒pG中,构建重组伪狂犬转移质粒pGVP2。利用脂质体转染法将重组质粒pGVP2和PRV HB98弱毒株DNA共转染至猪睾丸(ST)细胞,使其在ST细胞内发生同源重组,经5次绿色荧光空斑纯化重组病毒rPRV-VP2。分别用重组病毒rPRV-VP2、亲本PRV HB98弱毒株、商品化PPV灭活苗和DMEM细胞培养液免疫6周龄雌性昆明小鼠,2周后进行二免。一免后第7周用PRV强毒NY株对小鼠进行攻毒。结果获得表达VP2基因的重组病毒rPRV-VP2,经ELISA试验、血清中和试验(SN)、血凝抑制试验(HI)和流式细胞检测发现,重组病毒rPRV-VP2株可有效刺激小鼠机体产生抗PPV和PRV抗体,同时具有增强小鼠机体细胞免疫反应的能力,且对PRV强毒攻击具有保护作用。结果表明,重组病毒rPRV-VP2可作为同时预防PPV和PRV感染的重组疫苗候选株。