肠出血性大肠杆菌O157:H7 TCCP蛋白研究进展

TCCP(內膜素受体偶联细胞骨架蛋白,Tir couple cytoskeleton protein)是近年研究新发现的EHEC(肠出血性大肠杆菌)O157∶H7致病分子,它经大肠杆菌Ⅲ型分泌系统转导入宿主细胞内,结合并活化宿主蛋白N-WASP(神经威奥综合症蛋白),引起肌动蛋白的聚集,最终诱导特征病理改变黏附、擦拭(A/E)损伤的形成。本文就近年来对它的研究情况作一简要综述。     

破菌时可自动降解宿主核酸的大肠杆菌BL21(DE3)的lpxM突变株构建

研究利用Red同源重组技术对常用大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)进行改良, 构建破菌时可自动降解宿主核酸的大肠杆菌表达宿主菌, 该菌株可望有助于解决因破菌时宿主菌染色体核酸释放给后续纯化重组蛋白工作带来的困难。将N端连有OmpA的信号肽的S. aureus nucleaseB(nucB)表达框整合至E. coli BL21(DE3)的lpxM位点, 改造后菌株(称为BLN)经诱导能表达nucB、并分泌至周质空间, 这样可使宿主核酸免受该酶“毒性”影响, 菌体裂解后, nucB释放,能自动降解宿主核酸。BLN菌体生长状态以及表达外源重组蛋白的能力与出发菌基本一致。     

提高大肠杆菌可溶性重组蛋白表达产率的研究进展

大肠杆菌表达重组蛋白相比真核细胞具有成本低廉、大规模发酵容易、条件易于自动化控制等优点,通过大肠杆菌表达重组蛋白是一种高效、经济的途径,重组蛋白表达量可达到大肠杆菌总蛋白质量的50%。具有正常生化活性的重组蛋白通常为可溶性形式,因而对于以得到活性产物(如抗体、酶等)为目的的研究,通常采用可溶性表达途径。目前已有多种以可溶性重组蛋白为活性物质的治疗性药物经批准上市,但并非所有外源基因均能实现可溶性高表达,因此重组蛋白的可溶性高表达具有重要研究价值。在总结近年提高经大肠杆菌可溶性表达重组蛋白产率研究的基础上,从启动子的选择、SD序列的引入、信号肽的优化、宿主细胞的选择、共表达其他蛋白质,高密度发酵等方面阐释在大肠杆菌中提高可溶性重组蛋白表达产率的方法。     

副粘病毒附着蛋白在病毒融合过程中的作用*

副粘病毒附着蛋白 (AP)是病毒表面的一种主要糖蛋白 ,它能够诱导机体产生中和抗体。近年来的研究表明附着蛋白在病毒融合过程中的作用不仅限于其对受体的识别和结合 ,它还促进融合蛋白 (F)介导病毒与宿主细胞的融合。由此可见 ,副粘病毒具有其特有的融合机理 ,因此研究附着蛋白在病毒融合过程中的作用是揭示副粘病毒融合机理的前提 ,同时也会为新型抑制药物的研究提供思路。     

大肠杆菌中生物药物的生产现状及展望

大肠杆菌是表达药用异源蛋白的首选微生物,此宿主目前已生产约30%被批准的药用蛋白。大肠杆菌具有生长迅速、产率高、效益大及易扩大培养的优势,促使它成为生物技术行业中蛋白大规模生产常选择的表达宿主。但大肠杆菌中密码子偏好性的存在及糖基化、磷酸化和蛋白水解加工等翻译后修饰的缺乏会限制其生产较复杂的重组生物药物。综述了大肠杆菌表达系统中几项满足生物技术产业需求的相关创新技术,介绍如何利用相关技术进步使大肠杆菌糖基化异源蛋白和表达包括全长糖基化抗体在内的复杂蛋白的过程,并对存在的问题及其研究前景进行展望,旨在为帮助大肠杆菌顺利生产更复杂的药用糖基化蛋白。     

丝状真菌外源基因表达系统研究的现状及展望

利用大肠杆菌和酵母作为宿主菌生产外源蛋白有不少已发展到工业规模,但其存在的缺陷表明它们并不总是生产外源蛋白的理想宿主.     

鲑生长激素的基因操作宿主由大肠菌杆转向酵母菌

为用基因操作制造鲑生长激素,所用宿主由大肠杆菌的实用化研究,已在日本协和发酵公司开始。该公司从美国菲利普(Phillips)石油公司引进了甲醇同化酵母菌巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)的基因操作技术和高浓度培养技术,并着手共同研究。 这次的引进表明,用大肠杆菌工业生产具有活性的鲑生长激素(SGH)看来是困难的。SGH是疏水性高、难溶于水的蛋白,用大肠杆菌制造的重组SGH也难于提纯。     

蒺藜苜蓿MtLEA5B的克隆和功能分析

胚胎发育晚期丰富蛋白(Late embryogenesis abundant protein,LEA protein)是一类参与植物抗逆性应答的亲水蛋白。旨在揭示异源表达LEA蛋白在非生物胁迫条件下对宿主的保护作用。从蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)幼苗中克隆到一个编码LEA_5蛋白的基因,命名为MtLEA5B,通过半定量RT-PCR分析MtLEA5B的表达模式。利用SDS-PAGE蛋白电泳检测重组蛋白的耐热性和可溶性。构建原核表达载体,转化大肠杆菌过表达,检测大肠杆菌的生长存活情况。MtLEA5B的表达模式受到低温(4℃)、脱水、150 mmol/L NaCl胁迫和ABA处理的调控。SDS-PAGE蛋白电泳出现一条相比理论预测值较大,且沸水条件下可溶性未降低的条带。在大肠杆菌中过表达MtLEA5B蛋白能明显提升宿主菌在高温(55℃)和冷冻(-20℃)条件下的生存率。MtLEA5B是诱导性表达基因;MtLEA5B蛋白具有较高的亲水性和耐热性。在大肠杆菌中过表达可以明显提升其对温度胁迫的耐受性。     

跨膜丝氨酸蛋白酶2在病毒感染中的作用及其抑制剂的研究进展

跨膜丝氨酸蛋白酶2(transmembrane serine proteinase 2,TMPRSS2)是细胞膜表面丝氨酸蛋白酶家族的一员,它具有介导冠状病毒棘突蛋白水解的作用,为冠状病毒感染宿主必需的宿主蛋白。现就近年来TMPRSS2在分子生物学功能方面的研究;TMPRSS2在呼吸系统病毒感染,尤其是在冠状病毒感染中的作用,以及以TMPRSS2为靶点的药物研究进展作一概述,旨在对冠状病毒特别是新冠病毒的预防和治疗,提供新的靶点和方向。     

线粒体内膜解偶联蛋白UCP1在大肠杆菌中的活性表达

线粒体的呼吸耗氧偶联着ATP的合成,而位于线粒体内膜上的跨膜蛋白解偶联蛋白(uncoupling protein,UCP)能够破坏这种偶联关系.在大肠杆菌中表达了有生物活性的鼠源解偶联蛋白1(rUCP1).重组rUCP1的表达导致大肠杆菌宿主细胞生长变慢;在电子显微镜下观察免疫标记的结果显示,重组rUCP1主要表达在细菌膜上;同时将rUCP1重构到脂质体中也能够测到质子转运活性.这些结果说明,真核生物UCP1能够在原核生物中表达出有生物活性的形式,且能纯化得到足量的rUCP1蛋白用于进一步的结构生物学研究.     

蓝藻抗病毒蛋白 N

蓝藻抗病毒蛋白N(cyanovirin-N)是Boyd等1997年在蓝藻中发现的一种抗病毒蛋白,其抗病毒机制是与病毒表面衣壳蛋白上的甘露寡糖结合,阻止病毒与宿主细胞表面的受体结合。由于近年不断发现它对各种严重的RNA逆转录病毒的抗病毒活性而倍受关注。     

红霉素合成蛋白基因的克隆和高表达

文献报道红霉素合成蛋白DEBS2 (6-脱氧红霉内酯B合酶)(374 kD)基因在大肠杆菌(Escherichia coli)中异源表达量比较低,难以开展后续蛋白纯化和结构等研究.为获得该大蛋白基因的异源高表达,本研究通过PCR的方法,对编码红霉素合成蛋白DEBS2的基因起始5'端设计了起始密码子之后的十一个简并密码子序列,随机筛选获得在表达宿主BL21(DE3)中高表达的简并序列质粒,质粒命名为DEBS2-17.结果 表明:mRNA的起始二级结构影响200 kD以上的蛋白质表达水平.本研究为开展红霉素合成蛋白的结构及生化研究提供理论基础,同时对表达分子量200 kD以上蛋白具有一定借鉴意义.     

苏云金芽胞杆菌S-层蛋白基因的异源表达及分离纯化

S-层(S-layer)普遍存在于古菌、G~+、G~-菌中,由S-层蛋白所构成细菌S-层结构的生物体中,其功能引起了科学家的广泛关注,但目前S-层的功能大都处于推测阶段。究其原因,是因为外源S-层基因可以造成宿主大肠杆菌的致死效应。本研究将一株苏云金芽胞杆菌的两个S-层蛋白基因(GenBank登录号为AJ012290和AY460125)的3’端序列在大肠杆菌BL21(DE3)中成功进行异源表达,在0.8mmol/LIPTG诱导培养6h时,菌体中包涵体表达量达到最高;并对表达蛋白进行了初步分离纯化,以期为后期利用该纯化蛋白进行抗血清制备,进而对该菌的S-层蛋白在宿主菌中的定位、功能分析打下基础。     

肺炎克雷伯菌菌毛粘附素克隆表达及其对体外培养细胞的粘附活性

摘要：【目的】肺炎克雷伯菌(K.pn)与宿主细胞的粘附是致病的首要条件,粘附过程主要通过菌毛粘附素MrkD蛋白介导。为了进一步分析MrkD蛋白与宿主细胞间的粘附机制,进一步确定MrkD蛋白的粘附阻断作用。【方法】构建肺炎克雷伯菌菌毛粘附素融合蛋白原核表达质粒pGEX-4T-mrkD,转入大肠杆菌BL21,优化诱导表达条件,表达产物经亲和层析纯化、凝血酶切除融合蛋白GST标签后,进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。激光共聚焦显微镜定位MrkD蛋白在宿主细胞上的结合部位;通过粘附活性试验与粘附动力学实验研究了MrkD蛋白的生物活性。【结果】实验得到了分子量为35 kDa的MrkD蛋白,定位了MrkD蛋白在宿主细胞上的结合部位,并证明了MrkD蛋白可以显著影响肺炎克雷伯菌对宿主细胞的粘附力。【结论】本试验首次证实了MrkD蛋白的粘附阻断作用并观察到了其与宿主细胞的作用位点,为研究肺炎克雷伯菌的致病机制,寻找粘附素功能表位奠定了基础。     

嗜酸热古菌病毒STSV2密码子偏嗜性及其对dUTPase外源表达的影响

病毒和宿主之间的密码子使用频率差异是病毒在宿主中生存的重要调控机制之一。利用生物学软件Editseq和RSCU算法统计病毒STSV2及其宿主Sulfolobussolfataricus P2中的6个不同基因的遗传密码偏嗜性,并对病毒STSV2的dUTPase在大肠杆菌BL21和Rosetta中分别进行外源表达并分析其差异。结果表明,病毒STSV2密码子的偏嗜性总体与其宿主菌P2相似,STSV2基因组的不同蛋白编码基因的密码子偏嗜性有区别,病毒和宿主的相似蛋白编码序列密码子偏嗜性也有差异。分别以BL21(DE3)和Rosetta(DE3)为宿主表达STSV2的dUTPase基因显示,以BL21(DE3)为宿主时表达量大于以Rosetta(DE3)为宿主时目的蛋白表达量,进一步说明了病毒STSV2的密码子的偏嗜性对其蛋白的外源表达影响。     

改善大肠杆菌胞内氨基酰tRNA池提高外源基因表达水平

大肠杆菌是研究和高效表达异源蛋白的常用宿主细胞。由于大肠杆菌和真核生物及大部分古细菌在同义密码子上的使用有很大的差异,来源于真核或古细菌的外源基因在大肠杆菌中表达时,常常由于其带有稀有密码子而带来翻译方面的问题,如产生移码突变和表达量下降等,从而改变异源蛋白的表达质量和表达水平。在研究常见嗜热菌tRNA结构和组成的基础上,以古细菌α淀粉酶基因为例,采用增加有argU、ileY和leuWtRNA基因的大肠杆菌DE3为表达宿主,改善了胞内氨基酰tRNA池的大肠杆菌表达异源蛋白,表达量提高约9倍。     

大肠杆菌副产物合成途径删除提高外源蛋白表达水平

大肠杆菌是应用最广泛的外源基因表达宿主。为探索阻断副产物产生途径对提高大肠杆菌表达外源蛋白的能力,本实验以野生型大肠杆菌菌株为基础,删除其乳酸脱氢酶基因(ldhA),磷酸烯醇式丙酮酸合成酶基因(pps)和丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB)。在此基础上,以甘露聚糖酶基因man为报告基因,考察阻断以上代谢途径对大肠杆菌产酶能力的影响。结果显示,以上述三个基因叠加删除的三重突变株为宿主时,重组茵产酶水平最高,比酶活达到158.3 U/mg,相比野生出发菌株提高82.3%。     

大肠杆菌Ⅲ型分泌系统2毒力岛研究进展

许多革兰氏阴性菌借助Ⅲ型分泌系统黏附在宿主细胞表面,然后跨越胞膜将特异性蛋白注入宿主细胞内,破坏宿主细胞内的多种信号通路,从而有利于细菌的感染及定殖。在肠致病性大肠杆菌(Enteropathogenic Escherichia coli,EPEC)中,除了肠细胞脱落位点(Locus of entericyte effacement,LEE)毒力岛编码的Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)外,在分析肠出血性大肠杆菌O157:H7的基因组序列时发现一个新的Ⅲ型分泌系统,大肠杆菌Ⅲ型分泌系统2(Escherichia coli type Ⅲ secretion system 2,ETT2)毒力岛。研究显示,ETT2可能在大多数菌株中不具有完整的分泌系统功能,但是其对于细菌毒力的发挥具有重要作用。因此,本文简要综述了大肠杆菌ETT2的基因特征、ETT2的分布与流行、ETT2的功能与机制等方面的主要研究进展。     

人肿瘤坏死因子在鱼腥藻7120中的表达

肿瘤坏死因子(TNF)是一种应用广泛及疗效肯定的抗肿瘤细胞因子。目前基因重组TNF主要以大肠杆菌为宿主进行发酵生产,由于大肠杆菌自身含有毒蛋白,表达的重组TNF如不经严格的分离纯化,其临床应用毒副反应明显。此外,大肠杆菌的生长需要较贵重的有机物和生化制剂,从而使在大肠杆菌表达的重组TNF的纯化工艺复杂、成本较高。蓝藻是光合自养生物,结合简单、生长迅速、适应性强、易于进行遗传操作,且多数不含毒蛋白。利用蓝藻为宿主,进行重组TNF的生产,具有减低生产成     

两种主流载体蛋白在大肠杆菌表面展示抗体应用中的系统分析

抗体表面展示技术对于新抗体的筛选和抗体亲和力的成熟是非常重要的工具．目前,较为广泛应用的表面展示技术是噬菌体的表面展示和酵母的表面展示．大肠杆菌,以其培养简单和基因改造便捷,有望成为非常好的一种表面展示的宿主．但是,目前为止,大肠杆菌还没有被广泛地应用于抗体的表面展示技术中．主要的原因之一是在大肠杆菌外膜展示抗体的效率还不够高．作为外膜展示的载体,许多蛋白都被研究过,其中自转运蛋白(autotransporter,AT)和冰核蛋白(ice nucleation protein,INP)是人们研究最多的两种载体蛋白．还有一个原因是大肠杆菌作为宿主,在表达异源基因和展示异源蛋白过程中的存活率问题．在本研究中,系统地研究了Ag43β(一种自转运蛋白Antigen43的β结构域)和INPNC(去掉中间冗余序列的冰核蛋白的N端和C端)两种载体蛋白在强弱不同的三种启动子(T7、araBAD和lac)诱导表达的情况下,表达量、展示率、抗原亲和力以及宿主菌存活率的差异．我们发现,Ag43β展示的抗体在抗原亲和力上优于INPNC展示的抗体．在存活率方面,T7启动子诱导表达的存活率很低：用INPNC作为载体蛋白时只有0.0033%,用Ag43β作为载体蛋白时只有0.02%存活率．lac启动子诱导表达的存活率：用INPNC作为载体蛋白时为2.04%,用Ag43β作为载体蛋白时为13.27%．araBAD启动子诱导表达的存活率很高：用INPNC作为载体蛋白时为37.80%,用Ag43β作为载体蛋白时高达90.23%．但是araBAD诱导表达量和展示率都很低,所以其表现出的宿主高存活率意义有限．综合看来,由lac启动子驱动的、以Ag43?茁为载体蛋白的抗体表面展示系统是最好的选择．