卵白蛋白介导白毛黑眼兔变应性鼻炎模型树突状细胞功能的改变

目的比较观察卵白蛋白(OVA)诱导的白毛黑眼兔(WHBE兔)和日本大耳白兔(JW兔)变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)模型外周血来源树突状细胞(dendritic cells,DC)的功能,揭示WHBE兔对AR敏感的可能机制。方法以OVA诱导建立WHBE兔和JW兔AR模型,每次激发后观察动物一般体征,进行鼻黏膜HE染色,观察组织病理学改变。分离外周血DC,流式细胞仪检测外周血DC表面分子CD86的表达以及DC摄取抗原的能力,同时,采用荧光定量PCR检测外周血DC甘露糖受体(mannose receptor,MR)的mRNA表达水平。进一步以CFSE标记T细胞,流式细胞仪检测外周血DC诱导T细胞增殖能力。结果一般体征和HE染色观察显示,WHBE兔和JW兔模型组动物均表现为典型的变应性鼻炎症状和组织病理学改变,提示模型构建成功。WHBE兔AR模型组外周血DC CD86的表达不仅极显著高于正常对照组,亦极显著高于JW兔AR模型组(P0.01,P0.01)。正常稳态下,WHBE兔外周血DC MR的mRNA相对表达量极显著高于JW兔(P0.01),经OVA诱发建立AR模型,WHBE兔外周血DC MR的mRNA表达水平显著升高(P0.05),且显著高于JW兔模型组(P0.05)。并且,WHBE兔模型组外周血DC摄取OVA647的能力极显著高于正常对照组(P0.01),亦极显著高于JW兔模型组(P0.01)。结论 WHBE兔DC对变应原更敏感,可能与其高表达抗原识别受体MR,具备更强的分化成熟、摄取抗原能力有关。     

WHBE 兔、日本大耳白兔和新西兰兔遗传多样性的 RAPD 分析

目的：应用随机引物扩增多态性DNA技术（ random amplified polymorphic DNA , RAPD）对大耳白黑眼兔（ white hair black eyes rabbit , WHBE rabbit ）、日本大耳白兔（ Japanese white rabbit , JW rabbit ）和新西兰兔（New Zealand white rabbit, NZW rabbit）3个实验兔品系进行遗传分析。方法选用90只实验兔的皮肤组织样品提取基因组DNA,用60个随机引物对实验兔基因组DNA进行PCR扩增,根据电泳结果筛选出多态性较高的引物进行RAPD-PCR分析,再利用Popgene 3．2统计软件对3个品系的扩增条带进行遗传分析,获得实验数据。结果分析结果表明：（1）60个随机引物中筛选出25个多态性较高的引物,3个品系实验兔共检测到493个扩增片段,长度在100～1800 bp之间,筛选的25个引物中,其中16个引物既可扩增出3个品系共同的DNA条带,也可扩增出WHBE兔特有的特征条带;（2） WHBE兔位点数为234个,其中多态位点数166个,多态位点比为70．94％,JW兔位点数为228个,其中多态位点数122个,多态位点比为53．51％,NZW兔位点数为231个,其中多态位点数94个,多态位点比为40．69％;（3）三个群体的Shannon多样性指数分别为0．3385,0．2222和0．1905;（4） JW兔和NZW兔的遗传相似系数最高,为0．8443,其次为WHBE兔和JW兔的遗传相似系数,为0．8204,WHBE兔和NZW兔的遗传相似系数最低,为0．7862。结论结果表明WHBE兔与JW兔和NZW兔之间有遗传的相似性,也存在着遗传差异,应用RAPD技术可以很好地检测实验兔不同品系之间以及同一品系不同个体之间的亲缘关系。     

WHBE兔血液蛋白的特性

目的比较大耳白黑眼兔（WHBE兔）与日本大耳白兔（JW兔）和新西澜兔（NZW兔）血液蛋白的多态性,从分子水平了解WHBE兔特殊性状的遗传背景。方法采用聚丙烯酰胺凝胶电泳对WHBE兔、JW兔和NZW兔血液中的前白蛋白（Pr）,后白蛋白（Po）,前转铁蛋白1（Prt1）,前转铁蛋白2（Prt2）,转铁蛋白1（Tf1）,转铁蛋白2（Tf2）,后转铁蛋白（Ptf）,慢α球蛋白（Sag）、血红蛋白（Hbα、Hbβ）和白蛋白（Alb）共11个蛋白位点进行检测。结果Pr、Ptf、Hbα、Hbβ、Alb、Po、Sag和Prt2在所有实验兔个体中的表型一致,而Tf1、Tf2和Prt1的表型在各实验兔品系间存在显著差异。在Tf1位点,NZW兔以BC表型为主,无AA型;JW兔只有AA型,而WHBE兔以AB型为主。在Tf2位点,NZW兔有AA型,而JW兔和WHBE兔无AA型。在Prt1位点,NZW兔无AB、BB和BC表型而有AC表型。NZW兔蛋白位点的平均杂合度大于JW兔和WHBE兔。JW兔与WHBE兔的遗传距离最近。结论Tf1、Tf2和Prt1可作为区分NZW兔、JW兔和WHBE兔的特征标记,并且与WHBE兔特殊性状形成有关。JW兔与WHBE兔的亲缘关系最近。     

卵白蛋白诱导的WHBE兔树突状细胞甘露糖受体的表达及功能研究

该文研究了卵白蛋白诱导的WHBE(white hair black eyes)兔外周血来源树突状细胞(dendritic cells,DCs)甘露糖受体(mannose receptor,MR)的表达及功能,以阐明其对变应原易感的机制。分离WHBE兔外周血单核细胞,以20 ng/m L粒细胞–巨噬细胞集落刺激因子(granulocytemacrophage colony stimulating factor,GM-CSF)和20 ng/m L IL-4(interleukin-4)在体外联合诱导培养6 d,获得的细胞显示典型的树突状细胞形态特征。流式细胞术检测DCs表面分子CD86和人白细胞DR抗原(human leukocyte antigen-DR,HLA-DR)的表达,结果显示,WHBE兔和日本大耳白(Japanese white,JW)兔外周血DCs经卵白蛋白(ovalbumin,OVA)诱导后,CD86和HLA-DR表达水平均升高,其中,WHBE兔CD86水平高于JW兔。荧光定量PCR检测结果显示,OVA诱导后,两个品系兔外周血DCs的MR m RNA相对水平均显著升高(P0.05),且WHBE兔显著高于JW兔(P0.05)。抗原摄取实验发现,DCs经OVA刺激24 h后,抗原摄取能力低于对照组,MR抑制剂能显著降低DCs的抗原摄取率(P0.05,P0.01)。WHBE兔DCs抗原摄取率和平均荧光强度(mean flourscence indensity,MFI)均高于JW兔相同处理组,其中MFI值呈现极显著性差异(P0.01)。该研究结果表明,OVA诱发后,WHBE兔DCs可能通过其表面共刺激分子CD86、抗原识别受体MR的高表达,使抗原递呈功能增强,介导Th2型细胞过度活化,导致气道变态反应性炎症。WHBE兔MR的表达及功能特点可能是影响WHBE兔DCs对变应原敏感性的关键因素。     

肠易激综合征模型WHBE兔神经-体液-内分泌系统调节的变化

目的观察肠易激综合征（IBS）模型WHBE兔神经内分泌激素和电解质水平的变化,探讨神经-体液-内分泌系统在IBS中的作用。方法以湿热环境应激加小剂量致泻剂诱导WHBE兔建立IBS模型,在造模9d和14d时取血分离血清,检测血清中5-羟色胺（5-HT）、多巴胺（DA）、促肾上腺皮质激素（ACTH）、皮质醇（COR）、β-内啡肽（β-EP）激素和K^＋、Na^＋、cl^-含量的变化,并以JW兔作对照。结果与正常对照组比,造模9d时WHBE兔的5-HT、DA、ACTH、β-EP、COR均显著升高（P〈0．05,P〈0．01）,Na^＋、K^＋含量均显著降低（P〈0．01）,而JW兔ACTH、β-EP、COR均显著升高（P〈0．05,P〈0．01）,K^＋含量显著降低（P〈0．05）;造模14d时WHBE兔5-HT、ACTH、β-EP均显著升高（P〈0．05,P〈0．01）,JW兔ACTH显著升高（P〈0．05）;相关分析显示,IBS模型中血清中5-HT、COR与Na^＋、K^＋浓度呈显著负相关（P〈0．05,P〈0．01）,血清中DA、β-EP水平与Na^＋、K^＋、Cl^-浓度呈显著负相关（P〈0．05,P〈0．01）,ACTH水平则与K^＋浓度呈显著负相关（P〈0．01）。结论IBS的发生不仅与HPA轴兴奋性升高有关,亦与体液因素有关,故神经-体液-内分泌系统参与了WHBE兔IBS的发生过程。     

微卫星标记对WHBE兔封闭群、日本大耳白兔和新西兰兔的遗传分析

目的分析比较大耳白黑眼兔（WHBE兔）封闭群与日本大耳白兔（Jw兔）、新西兰兔（NZW兔）基因组存在的微卫星结构,研究WHBE兔封闭群的微卫星多态性。方法利用21个微卫星位点,通过微卫星分子标记技术对WHBE兔封闭群、Jw兔和NZW兔进行遗传多样性检测和对比。结果根据初步结果,在21对微卫星引物中筛选出扩增产物稳定并且具有多态性的11对引物。WHBE兔封闭群在每个位点上的等位基因数为3～8个不等,11个位点的平均有效等位基因数为2．0402个,平均杂合度为0．4810;Jw兔在每个位点上的等位基因数为2～8个不等,11个位点的平均有效等位基因数为3．6077个,平均杂合度为0．5039;NZW兔在每个位点上的等位基因数为3～9个不等,11个位点的平均有效等位基因数为2．6537个,平均杂合度为0．5334。WHBE兔封闭群在11个微卫星位点上的平均多态信息含量（PIC）为0．6005,多位点累积个体识别率达到100％,多位点累积非父排除概率（CPE）在双亲信息都是未知情况下的为0．9613,而在得知任一亲本信息的情况下,CPE值高达0．9973。在11个微卫星座位中,9个位点上出现了WHBE兔封闭群特有等位基因,其中在Sat2、Sat5、Sat7、Sat12、Sat13、Sat16、S0144和INRACCDDV0003八个位点上WHBE兔封闭群的特有等位基因为一个,在sat8位点上为两个。结论WHBE兔8个位点的平均杂合度、平均有效等位基因数均比JW兔及NZW兔低,说明WHBE兔群体的基因纯合度高于其他两个品系,具有更优的遗传稳定性。9个WHBE兔特有的等位基因可作为区分WHBE兔封闭群和其它两个品系实验兔的分子标记。     

白细胞介素23受体、白细胞介素17A在炎症性肠病患者中的表达及临床意义

目的：通过检测白细胞介素23受体（1L-23R）及白细胞介素17A（IL-17A）在炎症性肠病（IBD）患者肠黏膜及血清中的表达水平,探讨其在IBD发病过程中的作用及意义。方法：收集32例克罗恩病（CD）患者、29例溃疡性结肠炎（UC）患者及27例对照者的内镜肠黏膜活检标本,采用荧光定量PCR技术检测肠黏膜内IL-23R、IL-17AmRNA的表达情况,免疫组化技术分析IL-23R、IL-17A在肠黏膜中的原位表达。结果：与健康对照组相比,CD及UC患者肠黏膜组织内IL-23RmRNA表达显著增高（P〈0．05）,CD及UC组间的表达量差异无统计学意义（P〉0．05）。CD及UC患者肠黏膜组织内IL-17AmRNA表达显著增高（P〈0．05）,CD组肠黏膜组织内IL．17AmRNA表达显著高于uc组（P〈0．05）。免疫组化分析显示IL-23R阳性细胞在CD与uc肠黏膜固有层内有较多表达,较正常黏膜内的肠上皮细胞相比,CD及UC患者肠黏膜IL-23R蛋白表达量最著增高（P〈0．05）,UC及CD组间的表达量差异无统计学意义（P〉0．05）。IL-17A阳性细胞在CD与UC肠黏膜固有层内有较多表达,较正常黏膜内的肠上皮细胞相比,CD及UC患者肠黏膜IL-17A蛋白表达量最著增高（P〈0．05）。结论：IL．23R及IL-17A在IBD患者肠黏膜中表达显著增高,提示IL-23R及IL-17A表达异常与IBD的发生发展密切相关,有可能成为IBD治疗的新靶点。     

人白细胞介素10受体α基因真核表达及与JAK1蛋白的相互作用的检测

构建含人白介素10受体α(IL-10RA)基因的真核表达质粒p ENTER-IL-10RA-His,并在HEK293中进行真核表达,并用免疫共沉淀检测JAK1与IL10RA在细胞内的相互作用。在He La细胞中提取人总RNA,通过RT-PCR获得人IL10RA的基因全长,并将其克隆至真核表达载体p ENTER-His中。经PCR扩增、双酶切、测序鉴定后,将重组质粒p ENTER-IL-10RA-His转染至HEK293细胞中。免疫印迹法检测IL-10RA蛋白在HEK293细胞中的表达。结果显示,经PCR扩增和双酶切,测序鉴定质粒克隆正确。免疫印迹可见63 k D的目的蛋白。共同转染JAK1和IL-10RA的质粒,免疫印迹可见分别为133 k D和63 k D的目的条带,免疫共沉淀鉴定了JAK1和IL-10RA的相互作用。IL-10RA基因成功构建在p ENTER-His中,并在HEK293细胞中成功表达,并成功共转染JAK1和IL-10RA质粒,免疫共沉淀检测两者的相互作用。这为JAK1和IL-10RA相互作用的机制研究奠定基础。     

坏死细胞释放IL-1β对血管平滑肌细胞侵袭和迁移的影响及机制研究

目的研究坏死血管平滑肌细胞释放IL-1β对周围正常细胞侵袭和迁移的影响,并探讨其可能的机制。方法无血清低糖低氧条件下培养细胞,建立细胞坏死模型,收集坏死细胞培养上清液,用于干预正常血管平滑肌细胞。实验设坏死上清组（NCS）、IL-1β组、NCS＋IL-1RA组和对照组（Control）。Tran-swell小室实验和细胞划痕实验检测各组细胞侵袭和迁徙能力,RT-PCR和Western印迹检测各组MMP-2和MMP-9的表达,Western印迹检测各组NF-κB的激活情况。结果NCS组和IL-1β组细胞侵袭和迁移能力均显著高于对照组（P〈0．05）,NCS＋IL-1RA组细胞侵袭和迁移能力显著低于NCS组和IL-1组（P〈0．05）;对照组和NCS＋IL．1RA组NF-κB、MMP-2和MMP-9均显著低于NCS组和IL-1β组（P〈0．05）,IκB显著高于NCS组和IL-1β组（P〈0．05）。使用NF-κB特异性抑制剂处理后,NCS组和IL-1β组细胞侵袭和迁移能力显著性降低（P〈0．01）;MMP-2和MMP-9的表达也显著性减少（P〈0．01）。结论坏死血管平滑肌细胞能够上调MMP-2和MMP-9的表达,促进正常细胞的侵袭和迁移,且这种促进作用与IL-1β的大量释放诱导NF-κB的活化有关。     

白毛黑眼兔与日本大耳白兔胰岛素抵抗动脉粥样硬化模型的比较

目的探讨白毛黑眼(WHBE)兔和日本大耳白(JW)兔胰岛素抵抗动脉粥样硬化(insulin resistance atherosclerosis,IR-AS)模型的表型差异和病理机制。方法取WHBE兔与JW兔各12只,分为正常对照组(NC)和高脂高糖饮食(HF)组,每组6只。用HF饮食12周诱发IR-AS模型。造模结束后,取血测定血脂、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平;行糖耐量试验,计算血糖和胰岛素曲线下面积;检测肝微粒体甘油三酯转运蛋白( MTTP )、核因子E2(Nrf2)和SOD1基因的表达,并观察脂肪和主动脉血管的HE染色病理变化以及血管CD68的表达情况。结果与NC组比,HF组肥胖,血脂升高,糖耐受不良,高胰岛素血症和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)明显升高,血浆及肝SOD活性下降且MDA含量升高,肝MTTP和 Nrf2 基因表达升高且SOD1基因表达降低,血管脂质沉积和AS以及血管CD68表达显著升高;与JWHF组比,WBHF组TG、LDL-C、HOMA-IR、糖耐量曲线下面积(U_GLU)、MDA含量、脂肪直径大小、肝SOD1基因表达、AS病变程度及血管CD68表达上有明显差异。结论高脂高糖饮食能诱导兔形成IR-AS,表现出脂代谢紊乱、炎症和AS病变。但WHBE兔的病变程度明显严重于JW兔,这可能与这两种品系兔在脂质代谢和氧化应激反应存在差异有关。     

WHBE兔脾虚型肠易激综合征模型舌象病理组织形态学观察

目的观察脾虚型肠易激综合征模型WHBE兔活体舌象和舌组织病理形态学的变化。方法采用湿热应激复合番泻叶致脾虚型肠易激综合征兔模型,观察造模及自然恢复后WHBE兔和日本大耳白兔活体舌象和舌组织病理形态学的变化。结果与正常对照组比较,脾虚型肠易激综合征模型兔舌色淡红,舌质嫩;背隆起前后固有层乳头密度明显降低（P〈0．01）,基底层核分裂相频数减少（P〈0．01）,舌下角质层和上皮层厚度均明显增厚（P〈0．01）,且角质层／上皮层比值明显增加（P〈0．01）,且WHBE兔菌状乳头密度显著降低（P〈0．05）;自然恢复10d后,自然恢复组实验兔背隆起前后固有层乳头密度仍显著低于正常对照组（P〈0．01）,舌下角质层厚度明显大于正常对照组（P〈0．05）,且WHBE兔的上皮层厚度显著高于正常对照组（P〈O．05）,日本大耳白兔角质层,上皮层比值显著高于正常对照组（P〈0．05）。结论脾虚型肠易激综合征可能与机体营养、代谢相关。     

脾虚证IBS模型WHBE兔血浆环核苷酸水平的变化

目的观察脾虚型肠易激综合征（IBS）模型WHBE兔环核苷酸水平的变化。方法取WHBE兔和日本大耳白兔各18只,分别随机分成两组,即正常对照组6只,模型对照组12只,采用湿热应激加灌服番泻叶煎剂的方法造成脾虚证肠易激综合征（tBs）免模型,其中模型对照组造模后处理6只,剩余兔自然恢复10d,观察实验兔的血浆环核苷酸水平的变化。结果与正常对照组比较,WHBE兔模型对照组血浆cAMP和cGMP水平均显著升高（P〈0．05,P〈0．01）,且自然恢复10d后血浆cAMP和cGMP水平仍高于正常对照组（P〈O．05,P〈O．01）;日本大耳白兔模型对照组造模后及自然恢复10d后血浆cAMP和cGMP水平略有所升高,但差异均不显著（P〉O．05）;且模型对照组和自然恢复组cAMP／cGMP比值均略低于正常对照组,但差异不显著（P〉O．05）。结论本实验脾虚证IBS模型兔的血浆环核苷酸水平随阴阳盛衰而变化,具有双重特点：既有阴虚特点,又有阳虚特点,且WHBE兔更适合于脾虚证IBS模型研究理想的实验动物。     

不同品种实验兔虹膜酪氨酸酶基因序列和表达量的变化

目的从酪氨酸酶基因序列和表达量两个方面探讨酪氨酸酶与家兔虹膜颜色表型的关系。方法通过PCR扩增和测序检测4个具有不同颜色性状的家兔品种的酪氨酸酶基因外显子序列多态性;通过荧光定量PCR检测酪氨酸酶基因表达水平。结果白化品种日本大耳白兔和獭兔的TYR基因序列在第1118个碱基处都由C突变为A,并导致编码蛋白在373位,即最后一个N-糖基化位点发生由Thr到Lys的突变。白毛黑眼兔和青紫兰兔在第870个碱基处全部发生由A到T的无义突变。在白毛黑眼兔种群的所有个体和獭兔种群的部分个体中都发现TYR基因序列在第91个碱基处发生G到A的突变,导致氨基酸序列第31位处Val到Met的变异。经内参基因GAPDH的校正,TYR基因在白毛黑眼兔和青紫兰兔中表达水平显著高于在日本大耳白兔和獭兔中的表达水平（P〈0.01）。而在白毛黑眼兔和青紫兰兔之间、日本大耳白兔和獭兔之间,TYR基因的表达差异没有显著性。结论家兔TYR基因突变可能大幅度降低TYR基因表达,导致酪氨酸酶功能低下,从而影响虹膜颜色表型。     

日本大耳白黑眼兔在不同生长阶段蛋白质营养与肝脏相关基因表达的关系

目的研究日粮粗蛋白水平和生长阶段对日本大耳白黑眼兔（WHBE兔）肝脏相关基因表达的影响。方法采用两因素实验设计,分别选取断奶和2月龄WHBE兔各20只进行为期1个月的幼兔期和育成兔期饲养实验,每个阶段实验均将兔随机分为5组,各组日粮粗蛋白水平分别为12%、14%、16%、18%和20%,实验结束,用实时荧光定量PCR技术测定肝脏胰岛素样生长因子-1（IGF-1）和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶-C（PEPCK-C）的mRNA的表达丰度。结果生长阶段和粗蛋白水平均对WHBE兔肝脏IGF-1mRNA的表达丰度有显著影响,育成兔期IGF-1 mRNA的表达丰度明显高于幼兔期;日粮粗蛋白水平为16%和18%时IGF-1mRNA表达丰度较高,显著高于其他3组。PEPCK-C mRNA的表达也以16%粗蛋白组最高,幼兔期和育成兔期之间差异无显著性。结论日粮粗蛋白水平对IGF-1和PEPCK-C基因表达有显著影响,生长阶段与IGF-1mRNA表达密切相关。     

RAPD标记技术用于WHBE兔近交系培育中的遗传分析

目的探讨用随机引物扩增多态性DNA技术对大耳白黑眼兔近交系培育中的遗传监测作用。方法选用F4、F5、F6和F7代共70只WHBE兔的皮肤组织样品提取基因组DNA,用60个随机引物对基因组DNA进行PCR扩增,根据电泳结果筛选出其中25个多态性较高的引物进行RAPD-PCR分析,再利用Popgene 3.2统计软件对共检测到的584个扩增片段进行遗传分析,获得实验数据。结果①F4代扩增得到124条片段,F5代扩增得到150条片段,F6扩增得到152条片段,F7代扩增得到158条条带;其中F4代与F5代的共有条带数为105,F5代与F6代的共有条带数为119,F6代与F7代的共有条带数为125。②F4代与F5代的遗传相似度为0.7674,F5代与F6代的遗传相似度为0.7984,F6代与F7代的遗传相似度为0.8092。结论随着WHBE兔近交培育代数的增加,遗传相似度呈上升趋势,说明RAPD技术可以用于WHBE兔近交系培育的遗传检测。     

胃癌患者血清IL-17、IL-6和TGF-β1水平及其临床意义

目的:探讨胃癌患者外周血中白介素17(IL-17)、白介素6(IL-6)和转化生长因子-β1(TGF-β1)的表达水平及其临床意义。方法:选择2009年1月~2010年1月我院收治的50例胃癌患者(观察组)及同期50例健康对照者(对照组)为研究对象,采用ELISA法检测和比较其外周血中IL-17、IL-6和TGF-β1的水平,并分析胃癌患者外周血中IL-17、IL-6和TGF-β1水平与其临床病理特征之间的相关性。结果:观察组患者外周血中IL-17、IL-6和TGF-β1的水平分别为(8.51±2.68)pg/ml、(7.81±5.41)pg/ml和(1093.42±831.21)pg/ml,均明显高于健康对照组(P0.01)。胃癌患者的血清IL-17、TGF-β1的水平与其年龄、性别、临床分期、有无淋巴结转移、分化程度、肿瘤部位及大小均无明显相关性(P0.05);而血清IL-6的水平与肿瘤的大小相关(P0.05),但与其他临床病理特征无关(P0.05);血清IL-17水平与IL-6、TGF-β1的水平均无明显相关性(P0.05)。结论:血清IL-17、IL-6和TGF-β1水平的升高与胃癌的发生有关,但IL-6和TGF-β1可能不是血清中IL-17生成的诱导因子。