用生物素—亲和素酶染色法检测流行性出血热病人血清抗体

目前,生物素—亲和素系统在微生物方面的应用主要局限于ELISA法。我们用生物素一亲和素酶染色法(BAPS)检测流行性出血热(EHF)患者血清抗体,获得满意结果。 用BAPS法检测10份EHF患者的抗体及滴度,用兔抗76-118血清作为已知阳性对照,同时以20份非EHF患者血清为阴性对照。首先分别将感染了流行性出血热病毒陈株、A9株、R22株的Verc-E6细胞固定于含12个憎水漆圈的载玻片上,于此三种抗原片上分别滴加上述待检血清,37℃湿盒30分钟,PBS-     

汉坦病毒H8205株G1P基因片段重组杆状病毒表达载体的构建及表达

将汉坦病毒H8205株G1P基因的保守序列(约1000bp)作为目的基因插入到BactoBac杆状病毒表达系统的pFastBacHTb供体质粒中,利用Tn7转座子同BacmidDNA同源重组,获得了含目的基因片段的重组杆状病毒DNA,并利用其转染Sf9昆虫细胞,72h后收集细胞悬液,再用该悬液侵染Sf9昆虫细胞,48h后收获病毒.采用IFA分析收获的产物,观察到了特异性的荧光,并且采用SDSPAGE和Western印迹也获得了与预期一致的结果.证明感染后的Sf9昆虫细胞所表达的蛋白中含有能与抗汉坦病毒H8205株多克隆抗体特异性结合目的蛋白.研究表明,采用杆状病毒表达系统可以成功表达出汉坦病毒H8205株包膜糖蛋白G1基因片段,为开发适合的以G1P为抗原的汉坦病毒诊断试剂进行了前期的探索.     

用Vero E—6细胞从病人血清中直接分离肾综合症出血热病毒

用从美国引进的 Vero E—6细胞株接种肾综合症出血热(HFRS)病人的早期血清标本19份,全血4份,从中分离出21株与 HFRS 相关的病原体。分离阳性率达91.3%。用感染细胞制成的滴片标本经免疫荧光染色检查,在21份阳性的材料中有颗粒状(15份)及片状(6份)两种形态的特异性荧光,从这些分离出的病毒株中选2种不同形态的“H8205”及“H8278”病毒株进行了系统鉴定。结果排除了呼肠、疱疹、新疆出血热、森林脑炎等病毒。证明这两种形态的荧光都是分离出 HFRS 病毒引起的特异性荧光。肾综合症出血热病原分离自1978年 Lee 等用黑线姬鼠分离传代成功以后,我国学者宋干、严玉辰等人最近也从黑线姬鼠、褐家鼠中分离到 HFRS 病原相关因子,并适应于 A549及 Vero E—6细胞中,但从目前的文献报告中尚未见到用 VeroE—6细胞从患者血清中直接分离出 HFRS 病毒的报告。本文介绍1982年4—12月我们用 Vero E—6细胞直接从病人血清中分离 HFRS 病毒及对所分离出的病毒株的鉴定结果。     

汉坦病毒H8205部分核壳蛋白基因在E.coli中的表达

根据汉坦病毒H8205株NP基因的序列,设计一对引物,扩增NP前292个氨基酸多肽基因片段,克隆于表达载体pGEX-3X,与载体中26kD的谷胱苷肽巯基转移酶(GST)融合表达.SDS-PAGE显示表达产物(GST-NP)主要以包涵体形式存在.Western-blotting表明此融合蛋白有抗原性.包涵体经分离、洗涤、溶解后,Sepharose 6B层析纯化,用此融合蛋白作抗原,进行ELISA法检测临床HFRS病人标本的IgG和IgM,有很好的特异性和敏感性.有生物活性的汉坦病毒H8205 NP的体外表达成功,为汉坦病毒基因工程抗原的大量制备奠定了基础,也为汉坦病毒的临床检测和流行病学调查提供了一种廉价、安全、可靠的抗原.     

不同来源的肾综合征出血热病毒对Vero细胞的致病变作用

前文报道,肾综合征出血热病毒76-118株能使Vero细胞产生病变。本文报道76-118株和另11株不同来源的肾综合征出血热病毒(H537、A9、H5、R178、HB55、R22、Z10,沟3、L99、A16和J10)对Vero细胞的致病变作用(CPE )。其中除沟3株外,大部分毒株在感染Vero细胞后的第一代即可见明显的CPE。CPE的特点与76-118株相似,主要是感染细胞粘聚、融合,形成网状结构。CPE能被特异性抗HFRS病毒血清和型特异性单克隆抗体所中和抑制,但不能被特异性抗呼肠孤病毒Ⅲ型免疫血清所中和抑制。HFRS病毒对Vero细胞的致病变作用,对进一步研究HFRS病毒的某些生物学特性及实验方法等均有重要意义。     

乳鼠感染流行性出血热病毒的研究

用获自病人的流行性出血热(EHF)病毒H8205株感染Vero-E6细胞的培养液,感染1日龄小白鼠,自第3代起,感染鼠出现规律发病,潜伏期13～18天,个体瘦小,后肢麻痹,最后死亡。病理检查感染鼠脑有典型病毒性脑炎改变,免疫荧光及酶标抗体染色证实脏器中存在特异性抗原,血内有特异性抗体,感染鼠的血,尿及脏器悬液经Vero-E6细胞培养出病毒。电镜检查脑神经原细胞高尔基氏器内有病毒颗粒。实验结果说明1日龄小白鼠对流行性出血热病毒是敏感的,可以作为该病毒的实验动物模型。     

流行性出血热病毒在人革膜传代细胞内的生长繁殖

本文应用人羊膜传代细胞(Wish细胞)对流行性出血热病毒(EHFV)的敏感性进行了试验,用EHFV武株及76118、A9、R22、R4、陈株等5个代表株接种Wish细胞。结果Wish细胞感染EHFV后第1代第8～10天即可查见明显的特异性荧光,荧光光强度随代数和时间而增加,TCID50为10~4～/10~5ml。并用荧光阻断试验和双份血清证实在Wish细胞内繁殖的病毒为EHFV。此结果为EHF病原学研究提供了新的敏感细胞株。     

一株H5N1亚型禽流感病毒的分离与鉴定

2004年1月湖北宜昌某鸡场暴发疫病,从该鸡场濒死鸡肺组织中分离到了一株病毒,电镜切片观察到典型的禽流感病毒粒子;采用ELISA检测禽流感抗原为阳性;RT-PCR扩增HA、NA基因并测序,经BLAST分析,HA基因与A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)HA基因同源性为97%;NA基因与A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)NA基因同源性为96%,确定该分离株为禽流感病毒H5N1亚型(A/Chicken/Yichang/Lung-1/04(H5N1)).     

Asia 1型口蹄疫病毒抗原表位突变株的构建及其生物学特性分析

为了研制口蹄疫抗原表位突变标记疫苗,本研究以含有Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)c DNA全长的感染性克隆p Asia 1-FMDV作为骨架,将3D蛋白中第27位氨基酸的H和31位的氨基酸N分别突变成Y和R,从而突变3D蛋白的一个抗原表位,将构建的带有突变表位的重组质粒转染BHK-21细胞,成功拯救出一株突变FMDV。经比较后发现,重组病毒的生物学特性与亲本毒株相似。病毒中和试验结果显示,抗重组病毒的血清与亲本病毒有良好的反应性。Western blotting结果表明重组病毒诱导的抗体能与突变的表位合成肽反应而不与野生型病毒的表位合成肽发生反应,从而区分重组病毒与亲本病毒。综上所述,这株抗原表位突变FMDV有望作为口蹄疫标记疫苗候株进一步评估。     

肾综合征出血热双价纯化疫苗（Vero细胞）病毒株的筛选及其免疫原性研究

选用在Vero细胞上初步适应的LR1（Ⅰ型）、R22（Ⅱ型）株病毒,经乳鼠脑或腹腔接种,收剖感染鼠脑并在Vero细胞传代适应,此收获病毒与直接以Vero细胞传代的病毒比较表明：抗原效价、毒力滴度有明显提高。用LR1、LR22株病毒感染的Vero细胞培养物制备单价粗制疫苗和双价精制纯化疫苗免疫家兔,经空斑减少中和试验检测中和抗体,结果表明经乳鼠和Vero细胞交替传代适应后的LR1、R22株病毒具有良好的抗原性和免疫原性。