禽白血病病毒J亚群内蒙株的分离与鉴定

本研究从曾见典型禽骨髓性白血病(Myeloid Leukosis,ML)病例的内蒙古某肉种鸡场随机选取的淘汰肉种鸡中,分离出一株J亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus Subgroup J.ALV-J)。利用PCR和间接免疫荧光反应进行鉴定,J亚群禽白血病病毒内蒙株可以被两对ALV—J特异性引物扩增(特异条带约2．2kb和545bp);且在特异性单抗的间接免疫荧光检测中呈现强阳性荧光反应。此外,对山东一例肉种鸡骨髓性白血病病例亦进行了J亚群禽白血病病毒的分离与鉴定。2．2kb PCR扩增物的测序结果表明,两株分离病毒的同源性为96．9％,与已分离的SD9901和YZ9901株ALV-J同源性达94．2％～95.4％。     

蛋鸡J亚群禽白血病的分子生物学诊断

根据J亚群白血病病毒(ALV-J)原型株HPRS-103的序列设计了一对针对外源性ALV-J引物H5和H7,从发生ML病死鸡的肿瘤、骨髓、肝脏、脾脏和输卵管组织中提取DNA作为模板,经PCR扩增得到长度为545bp的片段,对其序列进行测定后,与ALV-J原型株HPRS-103的序列进行了比较,发现其核苷酸同源性为97．4％,所编码氨基酸的同源性为96．1％。该片段含有ALV-J gp85编码基因的部分序列和ALV-J pol基因的部分序列,从分子水平上证实了蛋鸡发生J亚群禽白血病,进一步证明了此前根据病理学观察、免疫组化及免疫荧光诊断的结果。这是首次从分子水平上证明蛋用型鸡发生J亚群禽白血病。     

J亚群禽白血病病毒蛋鸡分离株SD07LK1全基因组核苷酸序列的比较

[目的]分析我国ALV-J蛋鸡分离株的来源和进一步演变趋势.[方法]以J亚群禽白血病病毒(ALV-J)蛋鸡分离株SD07LK1感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)基因组:DNA作为其前病毒基因组模板,根据已发表序列设计合成9对引物,经PCR扩增出9段连续的、相互部分重叠的DNA片段和闭合环形前病毒两末端LTR的连接区段,并分别连入T载体进行克隆、测序.[结果]用:DNAstar软件对测序结果进行剪辑和拼接,首次完成了ALV-J蛋鸡分离株SD07LK1的前病毒全基因组核苷酸序列.[结论]将该序列与另外已完成的全基因组序列的比较表明,ALV-J的整个基因组gag和pol基因相对保守,各毒株间对应基因的同源性分别在95.O%以上,env基因的同源性仅为88.6%～94.0%.     

J亚群禽白血病病毒蛋鸡分离株SD07LK1全基因组核苷酸序列的比较分析

[目的]分析我国ALV-J蛋鸡分离株的来源和进一步演变趋势.[方法]以J亚群禽白血病病毒(ALV-J)蛋鸡分离株SD07LK1感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)基因组:DNA作为其前病毒基因组模板,根据已发表序列设计合成9对引物,经PCR扩增出9段连续的、相互部分重叠的DNA片段和闭合环形前病毒两末端LTR的连接区段,并分别连入T载体进行克隆、测序.[结果]用:DNAstar软件对测序结果进行剪辑和拼接,首次完成了ALV-J蛋鸡分离株SD07LK1的前病毒全基因组核苷酸序列.[结论]将该序列与另外已完成的全基因组序列的比较表明,ALV-J的整个基因组gag和pol基因相对保守,各毒株间对应基因的同源性分别在95.O%以上,env基因的同源性仅为88.6%～94.0%.     

禽白血病A亚群病毒gp85的单因子血清制备及其特异性鉴定

【目的】为了研究出一种能够针对A亚群禽白血病的快速特异性诊断试剂。【方法】将A亚群禽白血病病毒(ALV-A)SDAU09E1株接种于DF1细胞上,以感染细胞DNA为模板,通过PCR方法扩增出1023bp的ALV-A-gp85基因。将其正确阅读框架插入表达载体PET-32a(+)中,实现在BL21(Rosetta)宿主菌中表达。将纯化的融合蛋白常规免疫小鼠,制备得抗血清。【结果】实验成功获得52.8kDa的重组融合蛋白,且具有良好的免疫原性。间接免疫荧光试验(IFA)表明该血清可与ALV-A和ALV-B反应,但不与ALV-J反应。【结论】该实验首次在国内外研制出能用于鉴别性检测经典的A/B亚群ALV的单因子血清,可与ALV-J特异性单抗互补作用于外源性ALV感染的鉴别性诊断。我国鸡群同时受经典的ALV-A/B和新出现的ALV-J困扰,鉴别诊断非常必要,研究这种试剂具有较高的实用价值。     

诱发血管瘤型J亚群禽白血病病毒gp85基因的克隆与表达

2007年7月至11月,中国开产前后的商品海兰褐蛋鸡群大面积暴发血管瘤,造成巨大经济损失。将病料接种DF1细胞,通过PCR和间接免疫荧光(IFA)确定此次暴发的血管瘤为J亚群白血病病毒(ALV-J)感染引起。从患病鸡群中分离到5株ALV-J(前4株已经报道),将第5株病毒命名为WS0705。为研究该毒株抗原性的特点,用PCR方法扩增出gp85基因,并克隆进pMD18-T载体进行测序。氨基酸系统进化树分析显示WS0705与英国ALV-J原型毒株HPRS-103同源性最高。从已构建的质粒pMD18-T-WS0705gp85中酶切回收gp85基因,构建重组转移载体pFastBacH Tb-WS0705gp85。利用Bac-to-Bac表达系统获得了重组杆状病毒rBac-WS0705gp85。间接免疫荧光和Western blot检测WS0705gp85基因的表达产物。间接免疫荧光显示,构建的重组杆状病毒感染的Sf9细胞呈现明显的强阳性反应;Western blot分析,重组病毒感染的Sf9细胞蛋白显示出约35kD的阳性条带。结果表明,WS0705gp85基因在Sf9细胞中得到良好的表达,并且其编码产物完全可以被外源性ALV-J的特异性单抗JE9识别,进一步证明本次暴发血管瘤的病原为ALV-J,并为进一步开发ALV-J相关诊断产品奠定了基础。     

我国1999-2003年间ALV-J野毒株gp85基因变异趋势

通过接种鸡胚成纤维细胞(CEF)、间接免疫荧光试验(IFA)和聚合酶链式反应(PCR),连续五年从全国各地的送检病料中分离到14株J亚群白血病病毒(ALV-J).为了动态观察ALV-J囊膜表面结构蛋白(GP85)的变异情况,对这14株野毒株的囊膜糖蛋白基因(env)进行了克隆和测序,将它们与HPRS-103株的GP85的氨基酸序列进行了比较,结果表明ALV-J的囊膜表面结构蛋白发生了很大的变异,而且这些变异主要集中在高变区hr1、hr2和vr3;这些野毒株GP85的氨基酸序列的同源性在86.6%～100%之间(从同一鸡场中分离到的两株ALV-J即BJ00302与BJ0303的同源性为100%,其它毒株之间的同源性均小于100%);有义突变与沉默突变的比例显示这3个高变区极有可能是免疫选择压作用的位点.     

中国麻鸡中发现禽J亚群白血病

首次报道了中国特有鸡种——麻鸡J亚群白血病的发病情况。山东某种鸡场饲养的中国麻鸡,于开产前出现消瘦、贫血、瘫痪等症状,死亡率达10%。经大体剖检发现,病鸡的内脏器官均弥漫性肿大,色彩斑驳,质度较硬;在胸骨内侧、小肠浆膜面和气管粘膜面出现大小不等的肿瘤结节,呈灰白色。组织学检查发现,增生的肿瘤细胞为均一的髓细胞。用禽白血病病毒J亚群（ALV_J）的特异性引物进行PCR检测,阳性率为89%(15/17);PCR产物测序,其基因序列、预期氨基酸序列与ALV_J原型株HPRS_103的同源性分别为98.05%和97.4%。用ALV_J单克隆抗体,经免疫组织化学检测发现,在肿瘤组织、肝、脾、肾、骨髓、腺胃中呈现强特异性染色。上述检测表明此髓细胞肿瘤是由ALV_J感染引起的。ALV_J麻鸡病例的发现警示：应注意中国地方种鸡的白血病净化工作。     

鸡内源性类J亚群禽白血病病毒gp85基因的克隆及分析

为深入探讨J亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup J,ALV-J)的亚群特性,利用ALV-J gp85基因两侧的序列片段为引物,从正常SPF蛋鸡、商品肉鸡和DF1细胞基因组中完整地扩增了内源性类ALV-J gp85基因。肉鸡和DF1细胞内源性类ALV-J gp85基因同源性达99．9％;SPF蛋鸡内源性类ALV-J gp85基因与肉鸡和DF1细胞的内源性类ALV-J gp85基因之间同源性达95．6％、95．3％。三种不同来源的内源性类ALV-J gp85基因DNA与IMC10200株ALV-J的gp85基因的同源性分别为91．8％、94．1％、94．0％;与ALV-J原型株HPRS-103gp85基因的同源性分别为95．6％、98．3％、99．9％。内源性类ALV-J gp85序列与外源性ALV-J gp85基因具有相似或一致的ORF和Jameson-Worrlf抗原表位优势。     

J亚群鸡白血病病毒AH09/2株的gp85基因的克隆与原核表达

利用PCR方法扩增出J亚群禽白血病病毒(ALV-J)AH09/2株的gp85基因全长930 bp DNA片段。经T载体克隆测序并连接到pGEX-6p-1载体上,构建了重组表达质粒pGEX-6P-1-gp85,在IPTG的诱导下进行表达。Western-blot结果分析表明,gp85融合蛋白表达产物分子量大小约61 kDa,并能与ALV-Jenv基因单抗发生特异性反应。这些结果为深入研究GP85蛋白的生物学功能及研制ALV-J检测ELISA试剂盒奠定了基础。     

Determination of stoichiometry of radioiodination of proteins

A sensitive method for the detection of small quantities of hydrophobic antioxidant free radical scavengers such as butylatedhydroxytoluene (BHT) and butylatedhydroxyanisole (BHA) in aqueous samples is described. The procedure involves extraction of the hydrophobic free radical scavenger into an organic solvent phase, followed by the subsequent reaction of an aliquot of this extract with the stable cation radical tris(p-bromophenyl)amminium hexachloroantimonate (TBACA). In experiments with BHT and BHA, the loss of TBACA absorbance at 730 nm was found to be linearly proportional to the amount of antioxidant added, with quantities of BHT as small as 200 pmol being easily detectable. In aqueous suspensions of dimyristoylphosphatidylcholine vesicles, assays of the aqueous BHT concentration showed that BHT partitioned strongly into the membrane phase, achieving very high BHT/phospholipid ratios. For a given concentration of BHT, partitioning into the membrane phase was greater in large, multilamellar liposomes than in either small, single-walled vesicles or in purified rat brain synaptic vesicle membranes. Direct assay of BHT and BHA in phospholipid membranes, however, was complicated by a nonspecific interaction between TBACA and the phospholipid.     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.