斑马鱼miR-196a-1基因敲除品系的构建

microRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为19～23个核苷酸的非编码RNA,通过影响mRNA的稳定性和翻译,来参与基因表达的转录后调控。生物信息学分析表明该基因在各个物种中高度保守。为了阐明该基因在肠道发育中的作用,本文利用Cloning free CRISPR/Cas9基因编辑技术构建miR-196a-1基因敲除的斑马鱼品系。首先通过分析软件筛选出斑马鱼miR-196a-1基因的两个敲除位点,两个敲除位点相隔132 bp,利用PCR技术扩增miR-196a-1的向导DNA,再以向导DNA为模板转录得到miR-196a-1的sgRNA,将miR-196a-1基因的sgRNA和Cas9蛋白共同注射到斑马鱼胚胎1细胞期胚胎中。斑马鱼胚胎发育到36 hpf后进行基因编辑的有效性检测,研究结果显示,miR-196a-1基因出现102 bp碱基的缺失,表明CRISPR/Cas9系统对miR-196a-1基因的敲除有效。对其F0代、F1代、F2代进行筛选,成功获得斑马鱼miR-196a-1基因敲除品系,为研究miR-196a-1在肠道发育中的作用奠定了基础。     

miR-199a-3p/Nme2在TGF-β1信号通路中的作用分析

通过microRNA芯片技术在小鼠GC-1 spg细胞中筛选发现microRNA-199a-3p(miR-199a-3p)受转化生长因子TGF-β1调节。为了进一步探讨二者的关系,通过基因克隆与载体构建技术、双荧光素酶报告基因检测及定量PCR实验,发现miR-199a-3p靶向识别肿瘤转移抑制基因2(Nme2)的3'非编码区(UTR)序列,且正向调控Nme2的表达。利用TGF-β1处理GC-1 spg细胞后,结果显示Nme2和miR-199a-3p在mRNA水平的表达均显著上调;进一步将miR-199a-3p和TGF-β1双重作用于GC-1 spg细胞后,结果表明Nme2的表达会明显增强,而且在TGF-β1通路中,miR-199a-3p被抑制的部分功能可能会被Nme2补偿。综上,miR-199a-3p对Nme2基因具有直接靶向识别和调控作用,且在参与TGF-β1信号通路的生物学效应中,二者在功能上相互关联。     

p21WAF1／CIP1基因上游主要转录调控序列区及其相关功能

p21蛋白作为周期依赖性蛋白激酶抑制因子,调节细胞周期的进程,参与细胞生长、增殖、分化、衰老等多种活动,p21/WAF1/CIP1基因上游启动子中含有多个转录调控序列,包括p53,Sp1,Ap2,VDR及RAR,STAT,C/EBPα,β,E2A,MyoD和E2F等转录因子的顺式结合元件,在细胞的生长、分化、凋亡,衰老及疾病的发生发展中,这些转录因子通过与p21上游相应调控区相互作用,调节p21基因的表达。     

斑马鱼fem-1c cDNA克隆与表达分析

为进一步探究鱼类性别决定的相关机理, 增加对鱼类性控基因表达和功能的认识, 克隆斑马鱼fem-1c 基因并对其进行表达分析。研究采用RACE-PCR方法从斑马鱼卵巢组织cDNA中克隆了fem-1c的cDNA全长序列, 其大小为2701 bp, 编码618个氨基酸。生物信息学分析显示, 斑马鱼FEM-1C蛋白包含9个ANK结构域、2个TPR结构域和2个低复杂性区域, 与其他脊椎动物的FEM-1C蛋白序列保守性较高。脊椎动物的fem-1c与tmed7、trim36等邻近的45个基因具有保守的同线性关系。半定量RT-PCR实验结果显示斑马鱼fem-1c在受精后17d开始表达, 并特异地表达于成体卵巢组织中。RNA原位杂交结果显示, fem-1c基因mRNA定位于卵巢组织的Ⅰ期和Ⅱ期卵母细胞胞质中。fem-1c的时空表达特征暗示其在斑马鱼卵巢分化中具有重要作用。       

miR-24通过靶基因Sp1调控β-类珠蛋白表达

为了研究miR-24对于珠蛋白表达的调控作用,并明确其作用机制.首先采用定量PCR的方法确定miR-24在红系分化过程中的表达变化情况,以及miR-24过表达后珠蛋白的表达变化情况.进而通过报告基因实验以及Western blotting的方法确定miR-24的靶基因.通过表型回复实验证明miR-24是否通过靶基因调控珠蛋白的表达.结果发现在hemin诱导的K562细胞以及EPO诱导的造血干/祖细胞向红系分化过程中,miR-24表达上调,在K562细胞中过表达miR-24可以促进红系分化过程中ε-和γ-珠蛋白的表达上调,进一步的研究表明miR-24是通过靶基因Sp1来行使对珠蛋白的调控作用的.以上结果表明miR-24通过负调节其靶基因Sp1促进红系分化过程中珠蛋白的表达上调.     

opn1lw2基因在红光诱导斑马鱼皮肤 色素细胞形成中的作用

为了探究感红光视蛋白2基因opn1lw2在红光诱导斑马鱼(Danio rerio)皮肤色素细胞形成中的作用,针对AB品系野生型斑马鱼利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除感红光视蛋白2基因opn1lw2,构建opn1lw2缺失的纯合opn1lw2~(-/-)品系。使用光强(800±100)lx的红光LED灯(每天光照24 h)对15日龄野生型斑马鱼和opn1lw2~(-/-)品系斑马鱼进行60 d水面照射,发现野生型斑马鱼背部皮肤黑色素细胞数量显著多于opn1lw2~(-/-)品系斑马鱼。实时荧光定量PCR分析发现,黑色素细胞标记基因kit在野生型斑马鱼背部皮肤表达量显著高于opn1lw2~(-/-)品系,黄色素细胞标记基因csf1ra和虹彩细胞标记基因pnp4a在opn1lw2~(-/-)品系及野生斑马鱼背部皮肤表达无显著差异。表明红光能通过opn1lw2基因调控斑马鱼背部皮肤黑色素细胞的形成,但不影响皮肤黄色素细胞和虹彩细胞的形成;而且,调控黑色素细胞分化的α-MSH促黑激素的前体基因pomca在红光持续照射60d的opn1lw2~(-/-)品系斑马鱼背部皮肤中的表达显著低于野生型,表明红光通过opn1lw2基因调控pomca基因的表达从而诱导黑色素细胞的形成。实时荧光定量PCR检测发现,野生型斑马鱼皮肤中视黄醛脱氢酶基因raldh3表达量显著高于opn1lw2~(-/-)品系,而视黄醛脱氢酶基因raldh2的表达,在两种类型斑马鱼中没有差异,表明opn1lw2基因可介导红光诱导视黄醛脱氢酶基因raldh3表达,进而调控黑色素细胞的形成。这些结果对于深入理解红光诱导鱼类皮肤色素细胞形成有重要帮助。     

大口黑鲈MyoD cDNA的克隆和序列分析

MyoD基因是生肌调节因子MRFs家族的主要成员之一,是脊椎动物胚胎期肌肉发育的主导调控基因之一,对骨骼肌的形成和分化起主要作用。采用RT-PCR和RACE方法获得大口黑鲈MyoD基因的cDNA序列长为1 157bp,其中3'非编码区为314bp,开放阅读框长843bp,编码280个氨基酸。结构分析表明该肽链无信号肽,第1～110个氨基酸为MyoD基因的Basic区(碱性氨基酸区),第124～167个氨基酸为MyoD基因的HLH结构(螺旋环螺旋结构)。通过对比分析已知GenBank中其它脊椎动物MyoD基因发现,该基因编码的氨基酸肽链随动物由低等向高等进化有加长的趋势,且核苷酸以及推测的氨基酸同源性和动物之间的亲缘关系相一致;大口黑鲈MyoD基因的克隆为研究该基因打靶和鱼类肌肉发育调控机理奠定基础。     

构建ECE1 3''UTR荧光素酶报告基因载体验证其与miR-199a-5p靶向关系

目的:通过构建双荧光素酶报告基因重组质粒验证miRNA-199a-5p(miR-199a-5p)与ECE1基因的靶向调控关系。方法:通过microRNA靶基因预测软件Targetscan获取miR-199a-5p与ECE1基因3'UTR潜在的互补结合位点,PCR技术扩增ECE1基因3'端非翻译区,将此序列与miR-199a-5p mimics或空质粒(NC)共转染到pmirGLO-ECE1-野生型(WT)的293细胞里;将此序列突变序列与miR-199a-5p mimics或NC共转染到pmirGLO-ECE1-突变型(MUT)的293细胞里,共四组,检测四组细胞中荧光素酶活性。结果:成功构建双荧光素酶报告基因重组质粒pmirGLO-ECE1-WT和pmirGLO-ECE1-MUT。与野生型NC(4.30±0.53)组及突变型miR-199a-5p mimics组(4.465±0.3968)比较,野生型miR-199a-5p mimics组(1.686±0.4098)荧光素酶活性明显降低,P0.05,有显著差异;突变型miR-199a-5p mimics组(4.465±0.3968)与突变型miR-199a-5p NC(4.18±0.498)组及野生型NC(4.30±0.53)组两两比较,P0.05,无明显差异。结论:miR-199a-5p与野生型ECE1存在结合位点,miR-199a-5p对野生型ECE1重组质粒荧光活性有明显的抑制作用,证实miR-199a-5p能够靶向调控ECE1基因。     

豌豆蚜翅分化相关miRNA及其预测靶基因对蜕皮激素的应答及miR-92a-1-p5靶基因的验证

【目的】蜕皮激素对孤雌蚜翅两型性分化具有重要调控作用。在前期研究中我们发现5个微小RNA(microRNA, miRNA)在豌豆蚜Acyrthosiphon pisum翅两型性分化中也发挥关键作用,但蜕皮激素是否与miRNA互作参与蚜虫翅型分化未知。本研究旨在探索蜕皮激素对5个miRNA及其预测靶基因表达的影响,揭示蜕皮激素与miRNA协同调控蚜虫翅型分化的机理。【方法】选择5个与豌豆蚜翅两型性分化相关的miRNA (Let-7, miR-92a, miR-92b, miR-92a-1-p5和miR-277),使用0.1 mol/L蜕皮激素类似物20-羟基蜕皮酮(20E)分别处理孤雌生殖豌豆蚜2龄若蚜10 min和30 min,48 h后取样;qPCR检测这些miRNA及其预测靶基因在20E处理后的表达量;利用双荧光素酶活性检测法对miR-92a-1-p5的预测靶基因flightin进行验证;利用纳米载体/变性剂在孤雌生殖豌豆蚜4龄若蚜中敲低miR-92a-1-p5表达,验证miR-92a-1-p5与其预测靶基因flightin的互作关系。【结果】0.1 mol/L 20E处理30 min可极显著诱导孤雌生殖豌豆蚜2龄若蚜5个miRNA的表达;处理10 min则miR-92a-1-p5和miR-92b表达量较对照极显著下降,而Let-7和miR-277较对照极显著上升。Let-7与预测靶基因abrupt在0.1 mol/L 20E处理后孤雌生殖豌豆蚜豌2龄若蚜中表达趋势相反,miR-92a和miR-277的预测靶基因wingless和Uba1在0.1 mol/L 20E处理10 min时表达量极显著下降,与两个对应的miRNA表达趋势相反;miR-92a-1-p5的预测靶基因flightin在0.1 mol/L 20E处理30 min后表达量极显著下降,与miRNA表达趋势相反。双荧光素酶活性检测结果显示,共转染miR-92a-1-p5模拟物和flightin CDS过表达载体pmirGlO ［flightin］后与转染对照NC mimics相比,荧光素酶活性下降40%,达极显著水平;敲低孤雌生殖豌豆蚜4龄若蚜中miR 92a 1 p5后其表达量下调83%,其预测靶基因flightin表达量上升48%,均达极显著水平,表明flightin是miR-92a-1-p5的真实靶基因。【结论】蜕皮激素能够诱导豌豆蚜体内miRNA的表达;miR-92a-1-p5可能通过调控flightin参与孤雌蚜翅型分化;纳米载体/变性剂可以在蚜虫个体中实现miRNA的有效干涉。该研究为进一步探索蜕皮激素和miRNA互作参与孤雌蚜翅两型性分化机制奠定了基础。     

miR-196a-5p对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响效应

目的:探究miR-196a-5p对小鼠前体脂肪细胞增殖、分化的影响及其潜在的分子机制。方法:(1)构建小鼠肥胖模型,RT-PCR检测脂肪组织中miR-196a-5p表达量;(2)鸡尾酒法诱导3T3-L1前脂肪细胞分化,RT-PCR检测分化过程中miR-196a-5p的表达变化;(3)合成miR-196a-5p mimics和inhibitors转染3T3-L1细胞,以CCK8、EdU试剂盒检测miR-196a-5p对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响作用;(4)运用油红O染色、甘油三酯测定评估miR-196a-5p对3T3-L1细胞分化的影响;(5) RT-PCR检测miR-196a-5p对前脂肪细胞增殖、分化相关基因的影响;(6)结合前人文献,运用生物信息软件、萤光素酶报告系统对miR-196a-5p调控脂肪细胞分化的靶基因进行筛选和验证。结果:(1) miR-196a-5p在肥胖小鼠脂肪组织中高表达,在3T3-L1前脂肪细胞分化过程中先升高后下降;(2)与阴性对照组相比,mimics转染抑制了3T3-L1细胞增殖,inhibitors转染促进了3T3-L1细胞增殖;(3)与阴性对照组相比,mimics组积累了大量油红着色的脂滴,甘油三酯含量增多,而inhibitors组的脂滴少而小,甘油三酯含量相对降低;(4)与阴性对照组相比,mimics转染抑制了增殖标志基因Cyclin D1、Cyclin E、CDK2和CDK4表达,促进了分化标志基因PPARγ、C/EBPα、LPL、aP2等的表达,inhibitors转染则表现出与mimics转染相反的作用;(5) miR-196a-5p可显著抑制野生型MAP4K3和MAPK1 3'UTR萤光素酶活性,而突变绑定位点可废除该抑制效应。结论:miR-196a-5p不仅可抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖,还可促进其诱导分化、沉积脂滴;miR-196a-5p可能通过靶向调节MAP4K3和MAPK1来介导3T3-L1前脂肪细胞分化。     

Uncoupling protein 2 from carp and zebrafish, ectothermic vertebrates.

Uncoupling protein 1 (UCP1) is of demonstrated importance in mammalian thermogenesis, and early hypotheses regarding the functions of the newly discovered UCP homologues, UCP2, UCP3 and others, have focused largely on their potential roles in thermogenesis. Here we report the amino acid sequences of two new UCPs from ectothermic vertebrates. UCPs from two fish species, the zebrafish (Danio rerio) and carp (Cyprinus carpio), were identified in expressed sequence tag databases at the European Molecular Biology Laboratory. cDNAs from a C. carpio 'peritoneal exudate cell' cDNA library and from a D. rerio 'day 0 fin regeneration' cDNA library were obtained and fully sequenced. Each cDNA encodes a 310 amino acid protein with an average 82% sequence identity to mammalian UCP2s. The fish UCP2s are about 70% identical to mammalian UCP3s, and 60% identical to mammalian UCP1s. Carp and zebrafish are ectotherms--they do not raise their body temperatures above ambient by producing excess heat. The presence of UCP2 in these fish thus suggests the protein may have function(s) not related to thermogenesis.     

Specific requirements of MRFs for the expression of muscle specific microRNAs, miR-1, miR-206 and miR-133

The expression of three microRNAs, miR-1, miR-206 and miR-133 is restricted to skeletal myoblasts and cardiac tissue during embryo development and muscle cell differentiation, which suggests a regulation by muscle regulatory factors (MRFs). Here we show that inhibition of C2C12 muscle cell differentiation by FGFs, which interferes with the activity of MRFs, suppressed the expression of miR-1, miR-206 and miR-133. To further investigate the role of myogenic regulators (MRFs), Myf5, MyoD, Myogenin and MRF4 in the regulation of muscle specific microRNAs we performed gain and loss-of-function experiments in vivo, in chicken and mouse embryos. We found that directed expression of MRFs in the neural tube of chicken embryos induced ectopic expression of miR-1 and miR-206. Conversely, the lack of Myf5 but not of MyoD resulted in a loss of miR-1 and miR-206 expression. Taken together our results demonstrate differential requirements of distinct MRFs for the induction of microRNA gene expression during skeletal myogenesis.     

Novel recombinant monoclonal antibodies for vitellogenin assays in cyprinid fish species

Various polyclonal and monoclonal antibodies have been developed for vitellogenin (Vtg) bioassays in different aquatic species. Preparation of these reagents is time-consuming and expensive. In the present study, a phage-displayed, recombinant, single-chain variable fragment (scFv) format antibody library was constructed using splenic mRNA from non-immunized mice. After 3 rounds of panning, 3 scFv antibodies with specificity for the highly conserved N-terminal region of cyprinid fish Vtg were isolated. One of these, antibody H4, bound purified Vtg from common carp Cyprinus carpio, zebrafish Danio rerio and Chinese rare minnow Gobiocypris rarus with similar affinities and detected Vtg in zebrafish plasma samples. This study provides a simple, low cost Vtg bioassay for plasma samples from a variety of cyprinid fish.     

草鱼钠磷协同转运载体Slc34a2基因的克隆及组织表达分析

为了揭示草鱼对磷的吸收机制,运用RT-PCR和快速扩增cDNA末端方法,从草鱼（Ctenopharyngodon idella）肠中克隆获得钠磷协同转运载体基因Slc34a2,该基因全长为2446 bp,包含了1938 bp的开放阅读框,47 bp的5非编码区（Untranslated region,UTR）和461 bp的3UTR,编码645个氨基酸。草鱼SLC34A2蛋白的分子式为C3215H5125N801O902S30,分子量大小为70.39 kD,等电点为5.68,总平均疏水指数为0.458。对草鱼SLC34A2蛋白结构和功能预测分析,发现SLC34A2蛋白有11个跨膜域,1个半胱氨酸富集区,且N-端在胞外而C-端在胞内,也在第二个细胞外环中发现4个N-糖基化位点。用邻接法构建系统进化树,发现草鱼Slc34a2基因与硬骨鱼类聚类为一支,且草鱼SLC34A2蛋白与鲤（Cyprinus carpio）和斑马鱼（Danio rerio）SLC34A2的相似性最高,分别为90.3%和87.0%。实验采用了实时荧光定量PCR对草鱼Slc34a2 mRNA进行组织表达分析,结果表明Slc34a2 mRNA在组织中广谱表达,且在肠中表达最高,其次是肝脏、鳃、肾脏、脾脏、皮肤、肌肉、脑和头肾。实验为以后研究提高鱼对磷的利用和减少磷的排放奠定分子基础。     

Cold-induced ependymin expression in zebrafish and carp brain: implications for cold acclimation.

Cold acclimation has been suggested to be mediated by alternations in the gene expression pattern in the cold-adapted fish. To investigate the mechanism of cold acclimation in fish brain at the molecular level, relevant subsets of differentially expressed genes of interest were identified and cloned by the PCR-based subtraction suppression hybridization. Characterization of the selected cold-induced cDNA clones revealed one encoding ependymin. This gene was shown to be brain-specific. The expression of ependymin was induced by a temperature shift from 25 degrees C to 6 degrees C in Cyprinus carpio or 12 degrees C in Danio rerio. Activation of ependymin was detected 2 h after cold exposure and peaked at more than 10-fold at 12 h. This peak level remains unchanged until the temperature returns to 25 degrees C. Although the amount of soluble ependymin protein in brain was not changed by cold treatment, its level in the fibrous insoluble polymers increased 2-fold after exposure to low temperature. These findings indicate that the increase in ependymin expression is an early event that may play an important role in the cold acclimation of fish.     

鲫鱼Rag基因的克隆及表达分析

DNA重组激活基因(Recombination activating genes RAG)是脊椎动物特异性免疫反应的关键基因,也是脊椎动物进化分析的标记基因之一.鲫鱼具有很强的适应性和抗病能力,是我国广泛养殖的重要经济淡水鱼;由于具有不同的倍性和丰富的遗传多样性,又是研究鱼类基因组进化的独特材料.本研究用PCR方法扩增、克隆了鲫鱼的Rag基因.鲫鱼Rag1基因从起始密码到终止密码总长4188bp,由三个外显子和两个内含子组成,其中开放阅读框长3192bp,编码1063个氨基酸.Rag2基因从起始密码到终止密码总长1593bp,没有内含子,只有单一的编码区,编码530个氨基酸.Rag1和Rag2基因的ORF和氨基酸序列在不同鱼类中的对比结果表明其在进化过程中非常保守.不同鱼类Rag1基因的第二内含子也是高度保守的,转录因子结合位点分析表明在第二内含子的保守区域中有许多转录因子的可能结合位点.其中有一段在所有已知鱼类中都存在的保守区域是与性腺发育相关的转录因子SRY和SOX5的可能结合位点,提示Rag1基因的表达可能与性腺发育具有相关性.用RT-PCR方法进行的组织特异性表达分析表明Rag1基因在鲫鱼成体的头肾和精巢都能检测到表达,提示Rag基因不仅主导了免疫组织中的DNA重组,也可能参与了生殖细胞的DNA重组.RT-PCR检测证明Rag1基因在鲫鱼胚胎发育至第5天开始表达,在第7天鲫鱼胚胎的胸腺原基中可检测到Rag1基因mRNA的杂交信号,在第9天鲫鱼胚胎的胸腺原基中可以检测到很强的Rag1 mRNA原位杂交信号,说明该时期可能是鲫鱼免疫基因重组的活跃时期.