茶树CsCCD基因家族全基因组鉴定及乌龙茶LED补光晾青下表达分析

类胡萝卜素裂解双加氧酶(carotenoid cleavage dioxygenase, CCD)家族成员能催化类胡萝卜素裂解生成挥发性芳香物质并参与植物激素的合成。为探究茶树CsCCD基因家族成员生物学功能及基因表达模式,采用生物信息学手段进行了茶树全基因组CsCCD基因家族成员的鉴定,预测分析了其基因结构、保守基序、染色体定位、蛋白的理化性质、进化特性、互作网络、启动子顺式作用元件,并通过RT-qPCR测定了茶树不同叶位、乌龙茶加工过程中光照处理下CsCCD的相对表达量。共鉴定出11个茶树CsCCD基因家族成员,含有1–11个外显子、0–10个内含子不等;平均氨基酸个数为519 aa,平均分子质量为57 643.35 Da;聚类分析显示,CCD1、CCD4、CCD7、CCD8和NCED5个亚族各自聚成一类。茶树CsCCD基因家族主要含有胁迫响应元件、激素响应元件、光响应元件与多因素响应元件,且以光响应元件最多(142个)。进一步对茶树CsCCD基因在茶树不同叶位及乌龙茶加工过程中LED补光晾青过程的表达模式分析发现,CsCCD1、CsCCD4在成熟叶中表达量高于嫩叶及嫩茎,且随做青...     

茶树CsGGDPS7基因的克隆和表达分析

从茶树基因组鉴定得到牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因CsGGDPS7,以铁观音茶树为材料克隆获得全长cDNA(GenBank登录号MH891780)。CsGGDPS7序列全长1 185bp,包含1 098bp开放阅读框(ORF),编码365个氨基酸。预测结果显示在N端包含叶绿体转运肽,亚细胞定位于叶绿体中。氨基酸序列分析结果显示,具有类异戊二烯合成酶家族的5个保守域和2个特征功能域(DDXXXXD和DDXXD)。进化树结果表明与油橄榄(Olea europaea)OeGGDPS7亲缘关系最近。荧光定量检测显示,CsGGDPS7在叶片中的表达量显著高于其他组织,但花发育阶段CsGGDPS7表达量差异不显著。在乌龙茶做青过程中,CsGGDPS7在晒青阶段就快速上调表达并在三摇达到峰值。CsGGDPS1和CsGGDPS2表达也受做青调控,但CsGGDPS4不受做青调控。研究推测,CsGGDPS7可能与乌龙茶萜类香气物质合成密切相关。     

茶树CsIDI1和CsIDI2基因的克隆及其表达分析

该研究在茶树转录组测序基础上,以铁观音品种茶树为材料,采用RT-PCR技术,克隆了茶树异戊烯基焦磷酸异构酶(IDI)的2个编码基因(CsIDI1和CsIDI2)的cDNA全长序列。CsIDI1的全长为1 378bp,其开放阅读框(ORF)长度894bp,编码297个氨基酸,亚细胞定位预测位于叶绿体上,其氨基酸序列与葡萄IDI的相似性达95%;CsIDI2的全长为1 216bp,其ORF长度为717bp,编码238个氨基酸,亚细胞定位预测位于细胞质上,其氨基酸序列与芝麻IDI相似性达96%。CsIDI1和CsIDI2均含有典型的NUDIX水解酶域。荧光定量PCR结果表明,CsIDI1和CsIDI2基因在茶树地上部不同组织都有表达,但CsIDI2的表达量相对较高;品种间表达量分析显示,它们在父本黄旦品种及杂交后代高香型乌龙茶品种中的表达量显著高于母本铁观音品种,表现出香气上的杂种优势;在乌龙茶做青过程中,随着摇青的进行,CsIDI2的表达被显著诱导,表明CsIDIs在茶叶萜类香气物质形成中发挥重要功能。     

文心兰乙烯不敏感基因EIN2的克隆及表达分析

该研究采用PCR、RACE方法,对文心兰‘南茜’的乙烯不敏感蛋白基因（ethylene insensitive 2,EIN2）进行克隆及生物信息学分析,并采用qRT PCR技术,对该基因在文心兰不同组织器官和不同花期中的表达模式进行分析。结果表明：（1）成功克隆得到文心兰_EIN2基因序列,命名为OnEIN2（MH497388）;该基因cDNA序列全长为4 177 bp,其中开放阅读框3 879 bp,编码1 292个氨基酸,3′非编码区长208 bp,5′非编码区长90 bp。（2）生物信息学分析显示OnEIN2是一个不稳定的疏水蛋白,含有跨膜结构,分子式为C₆₄₀₆H₉₉₈₈N₁₆₇₀O₁₈₉₇S₄₇;蛋白质分子量142.22 kD,理论等电点5.80。多序列比对和系统进化分析表明,文心兰EIN2与铁皮石斛EIN2的相似度最高（81.98%）,二者亲缘关系也最为接近。（3）实时荧光定量PCR分析发现,OnEIN2基因在根、茎、叶花中均有表达,在花中表达量最高,茎中表达量最低;而在不同花期中,盛开期表达量最高,其次是衰老期。研究表明,文心兰OnEIN2基因在开花和衰老过程中可能有重要的作用。     

蔗茅EfMYB1基因的克隆与表达分析

为了充分利用蔗茅(Erianthus fulvus)野生资源,挖掘其优良的抗性基因,丰富转基因甘蔗育种候选基因库,该研究结合蔗茅转录组数据,以蔗茅99 1无性系为试验材料,利用RT PCR技术克隆蔗茅MYB基因,并对其进行生物信息学分析及胁迫表达分析,以解析蔗茅的耐寒机理,为转基因甘蔗育种奠定理论基础。结果表明：(1)成功克隆得到一个蔗茅MYB基因,命名为EfMYB1基因(登录号ON586646)。(2)生物信息学分析表明,EfMYB1基因全长1 000 bp,ORF为759 bp,编码251个氨基酸;编码蛋白具有一个保守的SANT结构域,无跨膜结构和信号肽,有多个磷酸化位点;二级结构与三级结构主要以α螺旋和无规则卷曲为主;与南荻相似性最高,遗传距离最近。(3)qRT PCR分析结果发现,EfMYB1基因在蔗茅根和叶组织中的相对表达量随低温胁迫时间的持续而逐渐显著上调,并于胁迫72 h时达到最大值,而在茎中的表达则几乎没有变化;茉莉酸甲酯胁迫下,EfMYB1基因的相对表达量呈先升高后降低的趋势,且在处理6 h时达到最高值;脱落酸胁迫下EfMYB1基因的表达水平较0 h时极显著降低。研究认为,EfMYB1基因属于低温胁迫响应基因,可能参与蔗茅低温胁迫下的应答反应。     

白菜型油菜RbohC和RbohF基因克隆与表达分析

该研究以白菜型油菜（Brassica rapa L.）‘陇油6号’为实验材料,采用RT PCR方法克隆油菜RbohC和RbohF基因,并采用实时荧光定量PCR技术对RbohC、RbohF基因在不同组织及非生物胁迫下的表达进行分析,为深入研究油菜RbohC、RbohF基因的生物学功能提供依据。结果显示：(1) 成功克隆得到2个全长分别为3 050 bp和2 995 bp的油菜RbohC (GenBank登录号：XM_009134386) 和RbohF (GenBank登录号：XM_009114548) 基因序列。(2) 生物信息学分析显示,油菜RbohC和RbohF基因开放阅读框（ORF）分别为2 733 bp和2 847 bp,编码910和948个氨基酸,推测二者的蛋白质分子量分别为103 kDa和108 kDa,理论等电点分别为9.47和9.21; 油菜RbohC、RbohF编码的氨基酸序列与萝卜等多种植物相应蛋白氨基酸序列具有较高的同源性,且这些序列高度保守并含有NADPH氧化酶的典型保守结构域,包括2个可以与Ca²⁺结合的EF手性模体结构、6个跨膜结构域、黄素腺嘌呤二核苷酸结合结构域、NAD焦磷酸结合结构域和C末端区域中的NADP核糖保守结合位点。(3) 油菜RbohC和RbohF基因在根、茎、叶和下胚轴中均表达,无组织特异性,但RbohC基因在根中表达量最高, RbohF基因在下胚轴中表达量最高。(4) 低温、干旱、盐、ABA、H₂O₂处理都能够诱导油菜RbohC和RbohF基因的表达,但抗寒性强的 ‘陇油6号’的RbohC和RbohF基因对胁迫的响应更敏感,且RbohC基因的表达量均高于RbohF基因。(5) 用H₂O₂清除剂DMTU、NADPH氧化酶抑制剂DPI和IMD、MAPKK抑制剂U0126处理后,油菜RbohC和RbohF基因的表达均较对照下降,说明U0126和DMTU对油菜RbohC和RbohF基因的表达有抑制作用。研究认为,油菜RbohC和RbohF基因在油菜适应逆境胁迫中具有重要作用,两基因的表达均受MAPK激酶信号途径的调节,并受到H₂O₂的反馈调节,而且抗寒性强的‘陇油6号’品种中RbohC和RbohF基因对H2O2和MAPK激酶信号途径的响应更敏感。     

中国南瓜CmNPR1基因的克隆和表达分析

从实验室前期对中国南瓜雌花败育转录组测序结果推测,CmNPR1基因可能在南瓜花发育过程中发挥重要功能。该研究以中国南瓜自交系‘3 1’为试验材料,采用同源克隆方法获得中国南瓜CmNPR1基因CDS序列,通过生物信息学、基因表达以及亚细胞定位分析对该基因进行初步研究, 为进一步研究CmNPR1基因在南瓜花发育中的功能和作用机制奠定基础。结果表明：(1)中国南瓜CmNPR1基因CDS全长1 442 bp,编码480个氨基酸;蛋白序列包含有一个BTB/POZ和一个锚蛋白重复序列(Ank)保守结构域;该蛋白无信号肽和跨膜结构;多序列比对分析结果显示,CmNPR1氨基酸序列与美洲南瓜的亲缘关系最近,为96.05%,其次是印度南瓜,为95.63%。(2)CmNPR1基因在所取样品中花纵径0.5 cm时期表达量最高,且在花不同结构中柱头的表达量最高。(3)通过拟南芥原生质体亚细胞定位分析发现,该蛋白定位于细胞质和细胞核。     

百合LbCAT和LbGPX基因的克隆与表达分析

以切花百合(Lilium brownii var. viridulum)‘卡瓦纳’cDNA为模板,克隆了过氧化氢酶(LbCAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(LbGPX)基因。序列分析表明,这2个基因分别包含1 479 bp和519 bp的开放阅读框(ORF),编码492个和172个氨基酸。进化分析结果表明,LbCAT蛋白与岷江百合CAT蛋白的氨基酸序列相似性最高(99.19%),且亲缘关系最近;LbGPX蛋白与油棕GPX蛋白的氨基酸序列相似性最高(78.61%),亲缘关系最近。qRT PCR结果显示,LbCAT和LbGPX在百合根、鳞茎、叶和花中都有表达。LbCAT在叶中表达量最高,LbGPX在花中表达量最高。这2个基因在百合花蕾的生长发育过程中均有表达,且表达量逐渐增加;在PEG处理后2个基因的转录水平升高,但独角金内酯(SLs)处理却显著降低了这2个基因的转录水平;该结果为百合抗逆性机理研究以及抗逆育种奠定了基础。     

棉花GhZIP4基因的克隆及表达分析

根据EST拼接的序列设计引物,利用RT-PCR和PCR方法,从陆地棉‘苏棉18’-cDNA和基因组DNA中分别克隆获得了GhZIP4基因片段.结果表明:(1)GhZIP4基因cDNA序列全长1 487 bp,包含1 269 bp ORF,编码422个氨基酸残基,其氨基酸序列具有典型的ZIP蛋白特征,预测具有8个跨膜结构域,第Ⅲ和第Ⅳ跨膜结构域间存在可变区,在可变区有2个富含His的结构域“HRHSHPHG”和“HSHGHGHD”.(2)氨基酸进化树分析显示,GhZIP4同拟南芥ZIP家族AtZIP4的相似性较高.(3)GhZIP4 DNA序列编码区全长1 778 bp,包含4个外显子和3个内含子,所有外显子/内含子交接点都遵从gt/ag剪接规则.(4)半定量分析显示,GhZIP4基因在茎中表达量最高,表明该基因有可能在某些金属离子地上部和根部的动态平衡分布过程中具有重要作用.     

茶树CsASMT基因的克隆和表达分析

该研究在茶树转录组测序的基础上,以茶树品种‘舒茶早’为试验材料,采用SMART^TM RACE技术,克隆了茶树褪黑素合成途径中关键限速酶N 乙酰基 5 羟色胺甲基转移酶基因（^CsASMT）的cDNA全长序列。^CsASMT基因序列全长1 282 bp,其中包含1 065 bp完整开放阅读框（ORF）,编码354个氨基酸,预测等电点5.37,蛋白分子量38.98 kD。系统进化分析表明,CsASMT与珠美海棠（Malus zumi）ASMT9的亲缘关系最近。将目的基因分别与pET 32a(+)和pMal c2X载体重组,然后再转化入原核表达菌株BL21(DE3)中,pET 32a（+）/CsASMT在28 ℃用0.5 mg/mL IPTG诱导6 h后,以包涵体蛋白的形式表达,而pMal c2X/CsASMT经诱导后在上清中可获得分子量为79 kD大量可溶性融合蛋白。实时定量 PCR 分析表明,茶尺蠖取食抑制CsASMT基因表达;褪黑素、ABA、MeJA和SA均能够诱导CsASMT基因显著上调表达。该研究结果为N 乙酰基 5 羟色胺甲基转移酶功能研究奠定了一定的基础。     

茶树CsNCED2基因的克隆和表达分析

该研究以铁观音茶树品种叶片为材料,通过RT-PCR技术,克隆了茶树脱落酸(ABA)合成途径关键限速酶——9-顺式环氧类胡萝卜素裂解双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase,NCED)基因的全长cDNA序列。该基因cDNA全长1 931bp,包含1 821bp完整开放阅读框,共编码606个氨基酸残基。NCBI同源分析结果表明,与葡萄VvNCED2相似性最高(78%),命名为CsNCED2(NCBI登录号:MF765770)。氨基酸序列分析显示,其具有NCED家族的FLNO2258保守结构域,以及MIAHPKxDP和HDFAITE保守结构域序列;在保守区存在4个Fe2+活性组氨酸结合位点,N-端含有叶绿体转运肽。实时荧光定量PCR分析表明,CsNCED2基因在铁观音叶、茎和花中表达量较高;白茶萎凋和乌龙茶做青均可以诱导CsNCED2基因显著上调表达;除干旱胁迫抑制CsNCED2表达外,ABA和低温胁迫均能够诱导CsNCED2基因显著上调表达。表明CsNCED2基因在茶树ABA合成代谢以及胁迫响应中发挥重要作用。     

茶树CsPLK基因的鉴定与表达分析

茶树中富含茶氨酸、儿茶素和咖啡碱等重要功能成分,具有较高的价值功效,茶树在生命周期中经常遭受逆境胁迫,维生素B6(VB6)在植物体内参与逆境应答,吡哆醛激酶(pyridoxal kinase,PLK)是VB6补救途径中的关键酶。为进一步了解PLK在茶树生物合成中的功能和作用机理,该研究基于茶树基因组数据库,以龙井43为材料,采用逆转录PCR(RT-PCR)的方法从茶树中克隆出CsPLK的基因。结果表明:该基因序列长为1 179 bp,编码393个氨基酸; CsPLK蛋白和已知物种中PLK蛋白具有较高的同源性,都是核糖激酶超家族成员;通过构建pET-CsPLK载体进行原核表达,并鉴定出重组蛋白有很强的催化活性;组织表达特异性分析表明,叶中的表达量比茎、根的高,在根中最低;荧光定量PCR表示,低温诱导CsPLK上调表达,干旱诱导CsPLK下调表达,发现该基因在茶树中有明显的逆境应答,推测CsPLK在茶树的生长发育、逆境胁迫发挥重要作用。     

茶树谷氨酰胺合成酶同源基因的克隆及表达分析

在实验室前期构建cDNA幼根文库获得谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS,EC 6.3.1.2)同源序列(contig48)的基础上设计引物,通过SMART RACE技术克隆了该基因cDNA全长序列(命名为GS1-2,GenBank登录号:JQ925873.1)。结果显示:(1)GS1-2基因全长为1 710bp,开放阅读框长1 071bp,编码356个氨基酸,预测蛋白分子质量为39.3kD,理论等电点为5.65;核酸序列分析表明,GS1-2基因与从安吉白茶中克隆的茶氨酸合成酶基因相似性为99%。(2)将GS1-2基因克隆至原核表达载体pET-32a和pMAL-c5x,转化至大肠杆菌,IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE检测结果表明,pET-32a-CsGS1-2转至Rosetta中诱导表达的蛋白与预测蛋白大小一致,主要以包涵体形式存在;而pMAL-c5x-CsGS1-2转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达可产生可溶性蛋白。(3)进一步构建茶树GS1-2酵母表达载体pYES-DEST52-CsGS1-2并转化至酿酒酵母(WAT11)菌液中,添加底物(谷氨酸钠100μmol/L和盐酸乙胺500μmol/L)震荡培养并离心,UPLC-MS测定酶反应产物结果初步表明,目的蛋白不能催化盐酸乙胺和谷氨酸钠合成茶氨酸,但可以合成谷氨酰胺。     

茶树CsPAL3基因的亚细胞定位及遗传转化

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)由多基因家族编码,是花青素等多酚物质合成途径的起始酶,对其合成具有调控作用。以紫化茶树武夷奇种C18为材料,采用Gateway技术体系分别构建了茶树的CsPAL3过表达载体pGWB502:CsPAL3和pGWB505:CsPAL3:GFP,并成功将其转入根癌农杆菌GV3101。注射烟草瞬时表达激光共聚焦扫描显微镜可观察到GFP绿色荧光,结果表明CsPAL3主要集中在细胞核和细胞膜中。通过侵染拟南芥,筛选纯合子,获得稳定表达的转CsPAL3基因拟南芥。实时荧光定量PCR(qPCR)检测发现,CsPAL3在转CsPAL3基因拟南芥中的根部表达量显著高于叶片,且CsPAL3基因受光照调控。该结果为进一步研究茶树CsPAL3基因功能以及促进茶树花青素合成与积累的分子调控机理提供科学依据。     

茶树水通道蛋白基因的克隆与表达分析

从茶树中克隆了6个水通道蛋白(aquaporin,AQP)基因的cDNA全长序列,根据序列相似性和系统进化分析结果,分别命名为CsNIP1;1、CsNIP5;1、CsPIP2;1、CsPIP2;2、CsTIP1;1和CsTIP2;2。氨基酸序列特征分析表明,6个基因的编码氨基酸序列长度在250~301个氨基酸残基,分子量在25.186~30.728kD之间;均为疏水性蛋白,并都含有6个跨膜螺旋;6个基因均含有MIP蛋白家族的特征序列HF/I/VNPA/SI/L/VTI/FA/G和NPA(Asn-Pro-Ala)基序,以及类似沙漏状的跨膜三级结构。荧光定量PCR分析显示:这6个基因在根、茎、叶和花中均表达,且在根中的表达水平最高,表明它们与茶树根系的物质转运密切相关;CsAQPs基因的表达受ABA、高盐、干旱和低温胁迫的调控,表明它们可能参与茶树抗逆响应。     

枸杞LbSPL6基因的克隆及表达分析

从实验室前期对枸杞(Lycium barbarum L.)花发育过程转录组测序结果推测,枸杞Squamosa启动子结合蛋白(Squamosa promoter binding protein-like,SPL)转录因子可能在枸杞花发育过程中发挥重要功能。该研究以宁夏特色植物资源枸杞为材料,采用RACE方法克隆LbSPL6基因,通过生物信息学及基因表达分析对该基因进行初步研究。结果表明:(1)成功克隆获得LbSPL6基因,其开放阅读框全长1524 bp,编码507个氨基酸,分子量为55.34 kD;序列分析表明LbSPL6蛋白中包含3个保守基序,且氨基酸序列与茄科植物同源蛋白的氨基酸序列高度相似。(2)qRT-PCR分析证实,LbSPL6基因在枸杞花器官中表达,并且在花药发育的四分体时期及单核花粉时期表达量较高;亚细胞定位实验证明,LbSPL6蛋白定位于细胞核中。该研究结果为进一步研究枸杞LbSPL6转录因子在花发育过程中的功能和作用机制奠定了基础。     

Hedgehog and patched gene expression in adult ocular tissues

We analysed the expression of members of the hh gene family in adult ocular tissues of newt, frog and mouse by RT-PCR method. Shh displayed restricted expression in the neural retina that was conserved in each species analyzed. X-bhh, X-chh and mouse Ihh were detected in the iris and in the retinal pigment epithelium, while mouse Dhh was detected additionally in the neural retina and faintly in the cornea. We also found that two types of ptc genes, potential hh targets and receptors, were expressed in these tissues, suggesting the presence of active hh signalling there.     

基于COI和ND5序列的中国南部唇鱼骨和间鱼骨群体遗传结构

唇鱼骨和间鱼骨均为分布较广的初级淡水鱼类,是理想的亲缘地理研究材料;且两者形态特征较为相似,不易鉴别,故两者的分布记述和物种有效性存在争议.为了解我国南部唇鱼骨和间鱼骨的群体遗传结构并探讨两者的物种有效性,本研究对8条水系的唇鱼骨和9条水系的间鱼骨共130尾个体的COI和ND5基因序列片段进行了测定,并对这两个基因的组合序列(2151 bp)进行了分析.结果表明: 在130尾个体的COI和ND5基因组合序列中,共有196个核苷酸变异位点,共检测出50个单倍型,单倍型多样性为0.964,核苷酸多样性为0.019,遗传多样性较高.基于COI和ND5基因组合序列构建的 NJ 树显示,所有种群可分为两支,支系Ⅰ包含了韩江和九龙江的全部单倍型以及瓯江的部分单倍型,余下的单倍型组成了支系Ⅱ.两支系间的遗传距离为0.036,而唇鱼骨与间鱼骨之间的遗传距离为0.027.单倍型网络图表明,韩江、九龙江种群和其他水系种群分化较大;漠阳江种群由海南岛种群扩散而来;海南岛各种群及漠阳江种群的单倍型分支与珠江水系单倍型的分支之间的亲缘关系较近,与长江水系单倍型分支之间的亲缘关系则较远;湘江、桂江和柳江之间的亲缘关系较近.AMOVA分析结果显示,地理区之间的变异约占71.2%,地理区内种群间变异约占16.6%,种群内的变异占12.2%,表明其遗传分化主要来自地理区之间.错配分析及中性检验结果显示,全部种群、唇鱼骨种群、间鱼骨种群、支系Ⅰ和支系Ⅱ在历史上均没有发生过明显的扩张.