枯草芽孢杆菌SC2-4-1葡聚糖酶基因gluB的克隆及序列分析

β-1,3-1,4-葡聚糖酶活性检测结果表明,从辣椒根际筛选的拮抗菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SC2-4-1能产生β-1,3-1,4-葡聚糖酶.以菌株SC2-4-1的基因组DNA为模板,用PCR方法克隆了该菌的葡聚糖酶基因gluB,其开放阅读框为711bp,编码237个氨基酸.Blast分析,该序列与已报道的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ATCC 842的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因gluB相似性为85%.所得基因序列的系统发育分析显示,该基因属于β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因.DNAMAN软件比对,所得葡聚糖酶氨基酸序列具有催化裂解β-1,3-和β-1,4-糖苷键的葡聚糖酶活性位点.     

多粘类芽孢杆菌SC2 xynD和gluB的克隆及序列分析

β-1,4-木聚糖酶和β-1,3-1,4-葡聚糖酶活性检测结果表明,多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)SC2能同时产生β-1,4-木聚糖酶和β-1,3-1,4-葡聚糖酶.以菌株SC2的基因组DNA为模板,通过TAIL-PCK方法克隆到4 807bp的DNA片段.DNAMAN软件分析,该DNA片段包含2个开放阅读框(ORF),ORF1长度为1 908 bp,编码含635个氨基酸、分子量为67.8kD的蛋白;ORF2长度为714 bp,编码含237个氨基酸、分子量为26.8kD的蛋白.BLAST分析结果表明,ORFI与已报道的P.polymyxa ATCC 842的xynD基因相似性为94%.ORF2与P.polymyxaWY110的gluB基因相似性为99%.基因序列的系统发育分析进一步说明.ORFI和ORF2分别为β-1,4-木聚糖酶基因xynD和β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因gluB.     

β-1,3-1,4葡聚糖酶基因克隆表达及其抗菌活性与机理研究进展

β-1,3．1,4-葡聚糖酶是一类能水解β-1,3．糖苷键和β-1,4-糖苷键的酶,因其主要分解大麦中的β-1,3-1,4-葡聚糖和细菌地衣多糖,所以又称地衣多糖酶。综述了β-1,3．1,4-葡聚糖酶基因的克隆表达及其抗菌活性与机理最新研究进展。     

高杆野生稻PR2同源序列的分离与序列分析

根据已知植物病程相关蛋白基因β-1,3-葡聚糖酶基因（PR2）的保守结构域设计2对简并引物,从高杆野生稻基因组DNA中分离出3条防卫基因类似物（defense—genes analogues,DGAs）,其中2条具有通读的ORF,另一条提前出现终止密码子。对这3条序列在NCBI上进行同源性搜索发现,在核苷酸水平这3条序列均与水稻的β-1,3-葡聚糖酶基因具有90％～93％的同源性,与已知大麦、小麦、高梁、黑麦、燕麦、玉米等其它植物的β-1,3-葡聚糖酶基因具有69％-81％的同源性。在氨基酸水平与水稻、大麦、小麦、黑麦的β-1,3-葡聚糖酶具有60％～93％的同源性。对具有通读ORF的2条序列RD1-GG6和RD1-GG12进行表达分析,发现经水杨酸（SA）诱导后表达量明显提高。     

大豆β-1,3-葡聚糖酶(GmBG1)及其同源蛋白的生物信息学分析

β-1,3-葡聚糖酶是普遍存在于多种生物中的一类多基因家族蛋白,属于PR-2家族蛋白,与植物的生长发育及防御体系有关。克隆和鉴定大豆β-1,3-葡聚糖酶家族基因对大豆抗逆育种具有重要意义。本研究应用生物信息学的方法共筛选获得45个β-1,3-葡聚糖酶基因。结果表明,GmBG1具有典型的β-1,3-葡聚糖酶家族的保守结构域及氨基酸位点,含有347个氨基酸,pI值为8.71,二级结构以ɑ螺旋为主,且N端信号肽为α螺旋结构,属于碱性蛋白。大豆β-1,3-葡聚糖酶家族基因主要在根和花中表达;实时荧光定量PCR分析表明,在腐霉菌P.ultimum的侵染下GmBG1基因在不同的抗病品种中的表达量存在差异;GmBG1基因在抗病品种中24 h时表达水平最高,而感病品种的该表达量无明显变化;此外抗病品种的该表达量明显高于感病品种。     

绿色木霉LTR-2 β-1, 3-葡聚糖酶基因的克隆及其在 毕赤酵母中的表达

根据从GenBank中检索到的木霉菌β-1,3-葡聚糖酶基因序列设计引物,以高产β-1,3-葡聚糖酶菌株--绿色木霉LTR-2的cDNA为模板,采用PCR方法扩增得到内切β-1,3-葡聚糖酶基因(glu).将glu克隆至载体pMD18-T上,进行了全序列测定.序列分析表明该基因由2289个核苷酸残基组成,含有一个开放阅读框架,可以编码762个氨基酸,与报道基本相同.翻译后的氨基酸序列含有两个β-1,3-葡聚糖酶的保守区RVVYIPPGTY和AASQNKVAYF.基因与已发表的木霉β-1,3-葡聚糖酶基因有较高的同源性,其中和哈茨木霉bgn3.1和绿木霉bgn13.1的同源性达到93%.序列已经提交GenBank,登录号为EF176582.将glu基因插入到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)穿梭载体pPIC9K中,获得重组质粒pGLU14,经线性化后转化毕赤酵母菌株KM71.经大量平板筛选,获得能有效分泌表达β-1,3-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌株KGLU14,菌落PCR扩增证实了glu基因已经整合到酵母基因组中.SDS电泳结果表明其β-1,3-葡聚糖酶的分子量大约为80kDa,和理论推测值大致相同.摇瓶发酵结果表明,培养基中β-1,3-葡聚糖酶的活力可达889U/mL.     

甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因的电子克隆与分析

以高粱β-1,3-葡聚糖酶基因(β-1,3-glucanase gene)cDNA序列为探针,搜索甘蔗EST数据库,而后通过电子克隆技术,拼接获得甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因ScBG。采用生物信息学方法,对该基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、跨膜结构域、卷曲螺旋、亚细胞定位、信号肽、功能域及高级结构等方面进行了预测和分析。结果表明:ScBG基因全长1270bp,包含一个长达1011bp的完整开放读码框(open reading frame,ORF),编码336个氨基酸,分子量为34.8KD,理论等电点为4.98。该蛋白质很可能是胞外定位的诱导物释放型酸性葡聚糖酶,是一种稳定的分泌蛋白,且可信度达最高等级1。该蛋白属于糖苷水解酶第17家族,含有N端信号肽,在第7～29位氨基酸处含有跨膜信号区,在第31～321位氨基酸处含有糖苷水解酶17家族结构域,含2个主要的功能结构域。10个物种ScBG蛋白氨基酸序列的同源性分析表明,甘蔗ScBG基因编码蛋白与高粱β-1,3-葡聚糖酶基因的编码蛋白的同源性最高,达79.82%。以上研究结果为ScBG基因下一步的分子克隆、功能鉴定和应用提供基础。     

向日葵菌核病根际拮抗菌的筛选与鉴定及其拮抗机理的初步研究

利用梯度稀释和对峙试验的方法,从向日葵根际土壤筛选到18株对向日葵菌核病病原菌—核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)有拮抗效果的细菌,其中1株具有较强的拮抗效果,命名为XRK4。经过形态观察及16S rDNA序列分析,将XRK4鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。研究表明XRK4具有β-1,3-1,4-葡聚糖酶活性。设计引物以XRK4的基因组DNA为模板扩增得到长度为732 bp的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的完整基因,其开放阅读框架编码243个氨基酸。XRK4可能因产生葡聚糖酶,降解病原菌细胞壁而具有拮抗活性。     

白菜型冬油菜β-1,3-葡聚糖酶基因在低温胁迫下的表达

为探明β-1,3-葡聚糖酶基因(β-1,3-glucanase)对油菜(Brassica campestris)抵御低温胁迫能力的作用,通过蛋白质谱分析得到β-1,3-葡聚糖酶蛋白,采用RT-PCR技术克隆白菜型冬油菜(B.rapa)陇油6号和天油4号β-1,3-葡聚糖酶的c DNA序列;并对该序列进行生物信息学分析;进而采用实时荧光定量PCR及半定量PCR检测β-1,3-葡聚糖酶基因在低温胁迫下的表达模式。结果获得长度为1 032 bp的陇油6号β-1,3-葡聚糖酶基因开放阅读框,编码343个氨基酸,相对分子量为38.102k Da,理论等电点为6.63,其与菜心(B.rapa subsp.chinensis)和甘蓝型油菜(B.napus)的蛋白质氨基酸序列同源性高达93.94%。该基因编码的酶是一个主要由α-螺旋组成的亲水性稳定蛋白,含有1个信号肽,存在2个跨膜结构域。该基因在进化上高度保守,其保守序列属于植物的糖基水解酶家族17特有的保守结构域。β-1,3-葡聚糖酶基因表达模式分析显示,4°C时该基因上调表达,继续低温(–4°C)胁迫处理,该基因上调表达至峰值,至–8°C时其表达下调。研究表明从白菜型冬油菜中克隆的β-1,3-glucanase在冬油菜品种陇油6号抗寒过程中发挥作用。     

三明野生蕉β-1,3葡聚糖酶基因克隆及其低温下SA处理后的表达分析

以三明野生蕉(Musaspp.AB group)为材料,利用RT-PCR和RACE技术,克隆获得β-1,3葡聚糖酶5个基因(Mugsp1.2~Mugsp5)的cDNA和DNA序列。序列和生物信息学分析表明Mugsp1.2、Mugsp2、Mugsp3、Mugsp4和Mugsp5的ORF长度分别为1 020、1 047、999、1 023和960bp,分别编码339、348、332、340和319个氨基酸;Mugsp1.2、Mugsp2和Mugsp4蛋白具有N端和C端(CTPP)信号肽结构,推测为Ⅰ类β-1,3葡聚糖酶,而Mugsp3只含有N端信号肽,无CTPP结构,Mugsp5则不具有信号肽结构;构建Mugsp1.2、Mugsp2、Mugsp4瞬时表达载体并转化洋葱表皮的亚细胞定位观察结果显示,常温下Mugsp1.2、Mugsp2和Mugsp4主要在细胞膜、细胞质上表达,而经过8℃低温处理后Mugsp1.2、Mugsp2和Mugsp4均能够转移至细胞核表达;β-1,3葡聚糖酶基因在不同低温处理下的实时荧光定量(qRT-PCR)检测结果显示,β-1,3葡聚糖酶基因均能响应低温胁迫,是低温胁迫相关基因,但基因间表达水平存在差异;低温下SA处理后的定量结果显示,SA处理会推迟β-1,3葡聚糖酶基因的表达。