靶向ASGPR的反义核酸与抗HBV药物联合用药的体外抗HBV作用

研究以宿主基因ASGPR为靶的反义核酸与抗乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)药物联合应用的抗-HBV作用,为HBV感染的联合治疗和用药提供新的思路。以HepG2.2.15细胞为靶细胞,脂质体为载体将靶向ASGPR的硫代反义寡核苷酸(ASODN)转染至HepG2.2.15细胞中,6h后加入抗病毒药拉米夫定(3TC)或阿地福韦(ADV),72h后收集细胞培养液,采用酶联免疫法及荧光定量PCR法测定ASODN与抗-HBV药物联合应用后对细胞培养液中HBsAg、HBeAg及细胞分泌HBV DNA的抑制作用。采用金正均Q值法对数据进行分析。拉米夫定(3TC)和阿地福韦(ADV)分别与ASODN联用对HBsAg的抑制呈相加或协同作用。随着ADV浓度的增加,两药的协同作用下降。3TC与ASODN联用对HBeAg的抑制呈拮抗、相加和协同作用,其拮抗作用随着3TC浓度的增加逐渐减弱。ADV与ASODN联用对HBeAg的抑制只呈相加作用。3TC和ADV分别与ASODN联用对HBV DNA的抑制均表现为相加作用或协同作用,取ADV0.5μmol/L与取ASODN0.2μmol/L联用时对HBV DNA的抑制率可提高到72.6%。ASODN在一定条件下分别与3TC及ADV联用有相加或协同抗HBsAg、HBeAg及HBV DNA的表达,尤以抗HBsAg作用显著增强。     

牡蛎多糖体外对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的影响

目的 探讨牡蛎多糖体外抗乙型肝炎病毒(HBV)的作用.方法 采用HepG2.2.15细胞为体外细胞模型,给予不同浓度牡蛎多糖进行混合培养,作用9d后收集上清液,用ELISA法测定上清液中HBsAg、HBeAg的水平,观察药物对HepG2.2.15细胞分泌病毒杭原的影响,同时以MTT法检测药物在体外对HepG2.2.15细胞生长的抑制作用.结果 牡蛎多糖浓度在0.1～1 000 μg/mL时,对细胞无明显的毒性作用;牡蛎多糖可明显抑制HBsAg、HBeAg的分泌,其半数有效浓度( IC50)分别为362.2、558.6 μg/mL,治疗指数(TI)为＞27.6和＞17.9.结论 牡蛎多糖体外具有一定的抗HBV作用.     

高三尖杉酯碱等四种药物的体外抑制乙肝病毒的实验研究

探讨高三尖杉酯碱、干扰素α1b、羟基喜树碱和诺氟沙星这四种药物对乙肝病毒的体外抑制作用。利用HBV全基因组转染的人肝癌细胞系(HepG2.2.15),采用CPE方法观察四种药物对HepG2.2.15的毒性大小,在最大无毒浓度下,将药物加入HepG2.2.15培养8天收集培养液,用ELISA法和荧光定量PCR法分别测定药物对细胞培养上清中HBsAg和HBeAg及HBV-DNA的抑制作用。结果显示在体外高三尖杉酯碱和干扰素α1b对乙肝病毒均有明显的抑制作用,羟基喜树碱对乙肝病毒仅有一定的抑制作用,诺氟沙星则在各浓度均未见对乙肝病毒有抑制作用。本实验证实了高三尖杉酯碱在体外对乙肝病毒有明显的抑制作用,为临床抗乙肝药物的研究提供了一定的理论依据。     

高三尖杉酯碱等四种药物的体外抑制乙肝病毒的实验研究

探讨高三尖杉酯碱、干扰素α1b、羟基喜树碱和诺氟沙星这四种药物对乙肝病毒的体外抑制作用.利用HBV全基因组转染的人肝癌细胞系(HepG2.2.15),采用CPE方法观察四种药物对HepG2.2.15的毒性大小,在最大无毒浓度下,将药物加入HepG2.2.15培养8天收集培养液,用ELISA法和荧光定量PCR法分别测定药物对细胞培养上清中HBsAg和HBeAg及HBV-DNA的抑制作用.结果显示在体外高三尖杉酯碱和干扰素α1b对乙肝病毒均有明显的抑制作用,羟基喜树碱对乙肝病毒仅有一定的抑制作用,诺氟沙星则在各浓度均未见对乙肝病毒有抑制作用.本实验证实了高三尖杉酯碱在体外对乙肝病毒有明显的抑制作用,为临床抗乙肝药物的研究提供了一定的理论依据.     

pSUPER介导的RNAi抗乙肝病毒S基因的研究

目的 研究RNAi抗乙肝病毒的作用.方法 设计并合成一段针对HBV S基因的干扰序列及一段无关的序列,克隆进pSUPER载体中,分别构建pSUPEK-HBS、pSUPEK-nonsense载体,然后将pSUPER、pSUPEK-HBS、pSUPER-nonsense转染进HepG2.2.15细胞中,用ELISA方法对细胞上清中HBsAg、HBeAg进行检测.尾静脉注射HBV转基因小鼠,取血清检测.结果 pSUPER-HBS所表达的siRNA成功的抑制了HepG 2.2.15上清及HBV转基因鼠血清中的HBsAg、HBeAg,抑制率分别达到70%、51%以及60%、42%.结论 针对HBV S区的siRNA能明显抑制HBV的复制.     

反义前S/S基因转移表达抗乙型肝炎病毒的研究

为了观察反义基因转录表达抗乙型肝炎病毒(HBV)的作用,将HBV ayw前S/S基因(preS/S)片段反向插入逆转录病毒载体质粒,构建preS/S反义基因重组体,经转染PA317细胞后,获得重组逆转录病毒颗粒.用重组病毒转导2.2.15细胞后,第3天即可见细胞培养上清HBV表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)表达量减少,到转导后第5天,细胞培养上清中的HBsAg和HBeAg表达量降到最低水平,HBsAg抑制率为71%,HBeAg抑制率为27%,抑制作用至少可持续到转导后第11天.空载及正向插入基因的重组逆转录病毒转导对2.2.15细胞内HBV抗原表达无抑制作用.     

靶向HBs基因的shRNA表达载体的构建及其抑制HepG2.2.15表达HBVsAg的作用

探索用PGenesil-1(Pg)构建的靶向乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因的shRNA表达载体PGenesil-1-HBs(简称Pgs),对体外培养HepG2.2.15细胞中的HBV基因及其抗原表达的抑制作用.设计、合成靶向HBV S区的3对DNA序列,分别插入PGenesil-1中构建3个siRNA表达载体Pgs1、Pgs2、Pgs3,经限制性内切酶,DNA序列测定等技术鉴定确认.筛选并确定最佳细胞接种量及重组质粒转染量后,分别或按不同组合转染HepG-2.2.15细胞,48 h后采用半定量RT-PCR检测HBVsmRNA转录水平,免疫细胞化学技术检测HBsAg表达水平,MEIA分别检测细胞裂解液和培养上清中HBsAg和HBeAg的表达水平.结果表明,HBV真核表达载体Pgs1、Pgs2、Pgs3均能不同程度地抑制HepG2.2.15细胞中的HBsAg、HBeAg合成和HBs-mRNA转录.成功构建的HBV真核表达载体Pgs1、Pgs2、Pgs3,其中PgS3能显著抑制HBsAg表达(P＜0.01).多种表达载体联合对抗原表达的抑制作用效率不同.     

利用pSOS系统筛选靶向HBV病毒X基因的siRNA

构建靶向乙肝病毒(HBV)X基因的真核表达载体pSOS-X-siRNA和pSOS-siRNA,转染肝癌细胞系HepG2和HepG2.2.15,筛选和验证高效siRNA。设计4个靶向X基因siRNA,将siRNA和HBx基因插入载体pSOS得重组质粒pSOS-X-siRNA;pSOS-X-siRNA经PacI酶切去除目的片段HBx后得pSOS-siRNA。将质粒pSOS-X-siRNA和pSOS-siRNA分别转HepG2和HepG2.2.15肝癌细胞株。荧光显微镜下观察HepG2细胞绿色荧光(GFP)减弱程度预估干扰效率。ELISA检测HepG2.2.15细胞上清HBsAg、HBeAg表达,Western blotting检测胞内蛋白HBsAg、HBcAg表达,Real time PCR检测胞内HBsmRNA、HBx mRNA的转录。转染4d后,siRNA4使HepG2细胞的GFP信号表达程度最低,为阴性对照的9%,预测其干扰效果最强。siRNA4使HepG2.2.15细胞转染后4d上清的HBsAg蛋白表达为对照的(13.92±1.14)%(P0.05)、HBeAg为(21.69±4.92)%(P0.05),胞内的HBsAg、HBcAg蛋白表达量灰度比值为0.175±0.025、0.0825±0.028,均为各处理组中最低(P0.01),HBs mRNA和HBx mRNA分别降为对照的0.237±0.028(P0.01)、0.110±0.022(P0.01),差异有统计学意义,证实siRNA4为高效干扰位点。利用pSOS成功筛选并验证构建靶向HBV X基因的siRNA靶点。     

联合应用siRNA和拉米夫定抑制HBV复制和表达的实验研究

观察联合应用小干扰RNA和拉米夫定对HepG2.2.15细胞中HBV抗原表达和复制的抑制作用。构建并转染重组质粒psil-HBV到HepG2.2.15细胞中。转染后的细胞培养基中加入拉米夫定(0.05μm),分别于48、72、96 h收获细胞。用ELISA方法检测HBeAg和HBsAg;HBV DNA水平用实时定量PCR测定;用逆转录PCR检测HBV mRNA水平。96 h后联合应用小干扰RNA和拉米夫定组细胞培养上清中HBeAg和HBsAg抑制率分别为91.8%和82.4%(P<0.05);HBV mRNA表达水平明显降低。HepG2.2.15细胞中联合应用小干扰RNA和拉米夫定对HBV复制的抑制作用比单独应用siRNA或拉米夫定更有效。     

特异性表达siRNA的新型乙肝核酸药物的研究

旨在研究靶向于HBsAg的肝脏特异性siRNA,实现核酸药物高靶向性、高特异性基因治疗乙肝。通过重组PCR的方法构建靶向于HBsAg的肝脏特异性表达的siRNA的核酸药物。将目标载体转染HepG2 2.2.15细胞,用ELISA的方法测定转染细胞培养液内HBsAg的含量。PCR鉴定和测序确定重组PAAV-MCS载体PApoE1-ApoE2-hAAT-siHBsAg-U1 3’Box构建成功。重组质粒对HepG2 2.2.15细胞分泌的HBsAg所产生的抑制作用自转染后5 d达到高峰,抑制率达到(30±0.28)%(P<0.01),siRNA特异性表达单元能显著降低HepG2 2.2.15细胞HBV DNA的拷贝数。成功构建的肝脏特异性、siRNA高表达的核酸药物可以有效地抑制HBV基因的表达和复制,为乙肝的进一步治疗研究做了关键性工作。     

纳米级灵芝子实体粉末和破壁灵芝孢子粉体外抗肿瘤活性研究

对纳米级灵芝子实体粉末及破壁灵芝孢子粉石油醚提取物(PE)、氯仿提取物(CE)、丙酮(AE)、甲醇提取物(ME)、水提取物(WE)与灵芝子实体及灵芝孢子提取量进行对比,利用GC-MS联用仪对石油醚提取物进行了成分分析鉴定,对水提物中总糖进行了含量测定,并利用宫颈癌细胞Hela和晶体上皮细胞SRA01/04进行了体外增殖作用和剂量效应关系研究,为灵芝资源的保护及进一步开发利用提供理论基础。结果表明,纳米化灵芝子实体及破壁灵芝孢子不同溶剂提取量显著增加,纳米级灵芝子实体粉末水提取物具有抑制宫颈癌细胞Hela和晶体上皮细胞SRA01/04增殖的作用。破壁灵芝孢子各溶剂提取物对宫颈癌细胞Hela和晶体上皮细胞SRA01/04没有明显的增殖抑制作用。     

灵芝发酵液酸性醇提物抗慢性支气管炎疗效的研究

通过灵芝发酵液酸性醇提物对小鼠的镇咳、祛痰实验,及烟熏小鼠肺部组织的形态学观察,研究灵芝酸性醇提物抗慢性支气管炎的疗效。灵芝发酵全液,不同剂量的灵芝酸乙醇提取物、灵芝酸正丁醇提取物均能显著延长二氧化硫诱发的小鼠咳嗽潜伏期,并显著抑制小鼠咳嗽次数,有明显的镇咳作用。60mg/kg给药量的正丁醇提取物使小鼠气道酚红排泄量较对照组提高了50.7%,祛痰疗效也明显优于双黄连口服液。肺组织切片病理检查表明,灵芝酸性提取物明显减轻烟熏小鼠的气管、支气管粘膜损伤,慢性支气管炎的组织病理学变化明显轻于单纯烟熏模型组,且抗炎、抗损伤作用与双黄连相当,这可为灵芝酸产品的研究开发提供一定的药理依据。     

不同灵芝菌株菌丝体乙醇提取物体外抑瘤活性的比较和机理

以人急性早幼粒白血病细胞HL-60细胞株作为模型,用MTT法测定生长抑制率,流式细胞Annexin Ⅴ实验和DNA含量法研究抑瘤机制,比较了8个灵芝Ganoderma lucidum菌株发酵菌丝体乙醇提取物的体外抗肿瘤活性和抑瘤机制。筛选结果得到了能产生高抑瘤活性乙醇提取物的灵芝菌株L5。其对HL-60细胞的抑制率为91.4±0.9%(72小时,125μg/mL); 作用48小时后,13.3%的细胞发生早期凋亡,G0/G1期细胞比例比对照组增加15.9%,而S期细胞比例则下降了8.4%,G2/M期细胞数减少7.6%。本研究证明了灵芝菌丝体乙醇提取物能有效抑制HL-60肿瘤细胞的体外生长,抑制率与菌株相关,其抑瘤机制与细胞G0/G1期阻滞和诱导凋亡有关。     

灵芝子实体中两个新的天然三萜类化学成分的分离、纯化和鉴定

本文采用硅胶和MCI柱层析的方法,从灵芝Ganodermalucidum子实体中分离纯化三萜类化合物。从灵芝子实体的氯仿萃取层中,分离纯化到灵芝属中的2个新天然产物,运用现代NMR技术分析确定了它们的结构,分别为methyl7β-hydroxy-3,11,15,23-tetraoxo-5α-lanost-8-en-26-oate(methylganoderateD)(Ⅰ)和methyl12β-acetoxy-3,7,11,15-tetraoxo-5α-lanost-8-en-24-oate(methyllucidenateD)(Ⅱ)。     

冬虫夏草与韩芝液体发酵混合培养特性研究

平板培养基上比较了冬虫夏草、韩芝及树舌的菌丝生长速度和对淀粉的利用情况,结果显示三者的生长速度分别达到1.28、0.64和0.55 cm/d,且韩芝与树舌对淀粉的利用均优于冬虫夏草;混合培养结果得出菌种的最佳菌龄比为虫草:韩芝=3 d:5 d,最佳的接种比例为2:3;正交试验混合发酵最佳的培养基配方(%):葡萄糖1.0、淀粉2.0、黄豆粉2.0、酵母粉0.5,在此条件下,菌丝生物量达到最大值1.97 g/100 mL。     

HPLC指纹图谱技术在灵芝组织分离试验中的应用

利用 HPLC 指纹图谱技术研究从同一灵芝子实体不同部位组织分离获得的菌株三萜化合物的差异。用常规组织分离方法获得不同菌株,在 A、B、C、D 四种培养基上进行出菇试验,运用HPLC指纹图谱技术获得各子实体三萜提取物 HPLC 指纹图谱,计算图谱间的相似度,分析三萜指纹的差异。结果表明,从子实体不同部位分离获得的四个菌株在同一培养基相同条件下培养获得的灵芝子实体的三萜指纹图谱相似度均大于0.99;同一部位分离获得的菌株在不同培养基相同培养条件下获得的子实体,其粗三萜 HPLC 图谱相似度均大于0.96;不     

HPLC指纹图谱技术在灵芝组织分离试验中的应用

利用HPLC指纹图谱技术研究从同一灵芝子实体不同部位组织分离获得的菌株三萜化合物的差异。用常规组织分离方法获得不同菌株,在A、B、C、D四种培养基上进行出菇试验,运用HPLC指纹图谱技术获得各子实体三萜提取物HPLC指纹图谱,计算图谱间的相似度,分析三萜指纹的差异。结果表明,从子实体不同部位分离获得的四个菌株在同一培养基相同条件下培养获得的灵芝子实体的三萜指纹图谱相似度均大于0.99;同一部位分离获得的菌株在不同培养基相同培养条件下获得的子实体,其粗三萜HPLC图谱相似度均大于0.96;不同的组织分离部位和不同的培养基对灵芝菌株三萜指纹图谱的影响均不显著。18号菌株在C培养基上培养获得的子实体三萜含量最高,上层菌肉为最优组织分离部位,C培养基为最优培养基。灵芝的三萜组成不受生长环境的影响,而生长环境会对其三萜化合物含量产生一定的影响。本文首次应用HPLC指纹图谱方法对灵芝组织分离获得的菌株的差异性进行了研究。     

虫药蜣螂对灵芝发酵物风味组成的影响

采用顶空-气相色谱-质谱联用对虫药蜣螂和添加蜣螂发酵后的灵芝发酵物的风味物质进行了测定,进而分析了添加蜣螂对灵芝发酵物风味组成的影响。结果表明,虫药蜣螂和灵芝发酵物(添加蜣螂)中分别含有40和30多种风味物质。添加蜣螂发酵后,灵芝发酵物跟对照相比新出现了5种风味物质,分别为苯甲醛、α-松油醇、苯乙醇、唑苯并噻和桃金娘烯醇。其中α-松油醇、苯乙醇和唑苯并噻是蜣螂中的风味成分,苯甲醛和桃金娘烯醇为新产生成分。所有5种风味物质均为食品香料物质。蜣螂中其它风味成分经灵芝发酵转化或降解后,未出现在灵芝发酵物中。因此,添加蜣螂发酵对灵芝发酵物的风味无不良影响。结果还提示灵芝细胞可生物转化或降解虫药蜣螂中的部分风味物质。     

不同植物药提取物对灵芝细胞生长和胞内三萜产物形成的影响

研究了不同植物药的水提和醇提物对灵芝深层发酵过程中菌丝量和胞内三萜产量的影响。将不同植物药的水提物和醇提物分别加入到发酵基础培养基中,培养7d后检测灵芝生物量和胞内三萜含量。结果表明,金银花和枸杞子水提物添加浓度为100mg/L时,可促进灵芝细胞的生长（p＜0.05）。连翘水提物对灵芝生长和胞内三萜的形成都有显著促进作用,当连翘水提物浓度为400mg/L时,胞内三萜产量从对照的（192.54±8.99）mg/L提高到（302.52±3.79）mg/L。金银花和枸杞子醇提物浓度为200mg/L时能显著促进灵芝细胞生长;枸杞子醇提物在同样浓度下还能促进灵芝胞内三萜的形成。但板蓝根和银杏叶水提物和醇提物都对灵芝的细胞生长和胞内三萜形成有较强的抑制作用。     

生物富硒对灵芝营养成分的影响

在人工栽培灵芝中,通过外施硒盐以生物转化法获得富硒灵芝,以不同含硒量的富硒灵芝子实体为试样,系统研究了灵芝生物富硒后对其主要营养成分多糖、蛋白质、氨基酸和矿物质等的影响。结果表明：硒可以明显提高灵芝中多糖、蛋白质以及氨基酸的含量,但并不改变灵芝蛋白质的分布和蛋白质中氨基酸的组成配比,而对矿质元素则有不同的影响,如富硒灵芝子实体中人体必需微量营养元素硒有极明显地增加,而铜和钼等人体必需微量元素的含量有一定量的增加,但铁、钙、锶等矿质元素的含量则有所下降。