十字花科黑腐病菌的XC1193基因与致病相关

十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是一种重要植物病原细菌,在全球范围内侵染十字花科植物引起黑腐病,其σ因子在基因表达中起到重要调节作用。XC1193基因在Xcc 8004菌株编码一个σ~70因子,为进一步研究该σ因子在Xcc中的调控作用,利用自杀质粒p K18mobsac B构建了XC1193基因的缺失突变体DM1193。与野生型菌株的比较发现,XC1193基因突变不影响菌体在丰富培养基和基本培养基上的生长;突变体的胞外蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶等生化表型也与野生型一致;植株实验表明XC1193突变不影响过敏反应。采用剪叶接种法进行致病性检测,突变体致病力与野生型一致。而采用喷雾接种法,突变体致病力显著降低,互补菌株致病力恢复至野生型水平。结果表明,该σ因子在十字花科黑腐病菌致病过程中发挥作用,并与Xcc侵染寄主的早期事件有关。     

十字花科黑腐病菌中甲基趋化受体蛋白的研究

趋化性是有运动能力的细菌对环境中的刺激物产生的趋向或离避行为。在细菌的趋化系统中,能够感应环境中化学物质浓度梯度的化学受体称为趋化受体。十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv. campestris, Xcc)是重要的植物病原菌,也是一种研究微生物与宿主互作机理的重要模式菌,然而关于Xcc中趋化受体的研究还较少。本研究利用生物信息学技术对Xcc8004中的21个甲基受体趋化蛋白(methyl-accepting chemotaxis proteins, MCPs)进行功能域分析并构建了系统进化树。结果表明,Xcc中MCP具有比较高的保守性。利用同源双交换法构建了MCP编码基因的缺失突变体,对这些突变体的生物学功能分析表明:21个MCP编码基因突变后,皆影响Xcc对糖类、氨基酸等趋化物的趋化性;大多数突变不影响细菌的运动性,但XC_2311、XC_2304、XC_1937、XC_2223分别突变后,影响细菌的游动性和泳动性。     

假定蛋白基因XC2038与十字花科黑腐病菌致病相关

十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是研究植物病原细菌和寄主互作的模式细菌,鉴定其致病相关基因对于控制作物病害有重要的意义。XC2038在Xcc 8004中注释为功能未知的假定蛋白基因。本研究利用实验室前期构建的XC2038基因的Tn5gus A5插入突变体164H09,并构建了该突变体的互补菌株C164H09,随后对各菌株的致病性及相关表型进行了检测。结果表明,164H09影响Xcc 8004胞外多糖、泳动性及生物被膜的形成,影响在寄主满身红萝卜上的致病性,而突变体的互补菌株能将以上表型恢复至野生型水平。综上可知,假定蛋白基因XC2038与十字花科黑腐病菌致病相关。     

十字花科黑腐病菌中9个纤维素酶基因的研究

十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)能够侵染几乎所有的十字花科植物引起黑腐病,而纤维素酶作为重要致病因子之一,在病原菌早期侵染中发挥重要作用。通过全基因组检索发现,已测序菌株Xcc 8004中有9个基因(XC_0026,XC_0027,XC_0028,XC_0625,XC_0639,XC_0783,XC_0784,XC_1727和XC_2483)注释为纤维素酶基因。本研究构建了9个纤维素酶基因的单基因缺失突变体和多基因缺失突变体。定性检测突变体纤维素酶活,发现D0639的CMC纤维素酶活力显著降低,其他8个单缺失突变体的CMC纤维素酶活力变化不明显,当9个基因同时缺失即D9,CMC纤维素酶活性完全丧失。在D9的背景进行单基因反式互补,通过定量和定性检测纤维素酶活力,XC_0639能基本上恢复野生型水平,XC_0026、XC_0783和XC_1727只能补回10%的酶活力,而其余几个基因完全不能补回酶活力。本研究首次发现了XC_0639是十字花科黑腐病菌的纤维素酶的主效基因。     

十字花科黑腐病菌中一对假定双组分信号转导系统基因的功能研究

双组分信号转导系统(two-component signal transduction system,TCSs)是微生物适应外界环境最重要的调控系统。十字花科黑腐病菌是引起十字花科黑腐病的主要致病菌,其中有111个双组分调控基因,包括两个未知功能的基因:XC3981和XC3982。为了研究其功能,我们通过同源双交换构建了这两个基因的缺失突变体,并对其进行表型检测及功能互补,结果表明缺失突变体DM3981的致病力显著下降,蠕动性显著增加,互补菌株致病力和蠕动性都能恢复到野生型的水平,说明XC3981与Xcc的致病力和蠕动性相关;缺失突变体DM3982与野生型相比无明显相差异。     

大肠杆菌转录后调控蛋白CsrA的C末端具有抑制十字花科黑腐病菌胞外蛋白酶活性的功能

CsrA(在有些细菌例如十字花科黒腐病菌中也称为RsmA,统称CsrA/RsmA)是一类在细菌中广泛分布而且氨基酸序列非常保守的RNA结合蛋白。研究表明,CsrA/RsmA作为转录后全局调控因子参与了包括细胞碳代谢、次生代谢、运动性、生物被膜形成以及动植物病原菌的致病过程等许多细胞过程的调控。CsrA/RsmA在不同的细菌中的生物学功能各有异同。在大肠杆菌中,CsrA的主要功能是控制细胞的碳代谢、运动性和生物被膜形成;而在十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pathovar campestris,Xcc)中,CsrA的同源蛋白RsmA的主要功能除了控制碳代谢、运动性和生物被膜形成外,还控制致病性和胞外酶的产生。大肠杆菌的CsrA(CsrAE.coli)是否具有XccRsmA(RsmAXcc)的功能?为了回答这个问题,我们用大肠杆菌的csrA基因(csrAE.coli)互补Xcc的rsmA基因(rsmAXcc)的缺失突变体DM2506。结果显示,csrAE.coli能够互补DM2506的所有表型,说明CsrAE.coli具有RsmAXcc的全部功能。更重要的是,我们发现,无论是rsmAXcc突变体还是野生型菌株,导入表达CsrAE.coli的质粒后均导致其致胞外蛋白酶活性的严重下降,证明CsrAE.coli具有抑制Xcc胞外蛋白酶活性的作用。进一步的实验证实,CsrAE.coli的C末端第53～61位氨基酸残基具有抑制Xcc胞外蛋白酶活性的功能。     

野油菜黄单胞菌分泌组双向电泳样品制备方法的建立

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是十字花科植物黑腐病的病原细菌。我们建立了Xcc的蛋白质组学研究平台,用于分离、鉴定该菌的致病相关蛋白。为了减少胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)对蛋白材料质量的影响,我们构建了EPS缺陷的Xcc8004ΔgumB突变体。本研究以Xcc8004ΔgumB出发菌株,用诱导培养液培养,取细胞上清通过超滤浓缩得到蛋白质粗提物,分别采用丙酮沉淀法、试剂盒纯化法和丙酮沉淀-试剂盒联用法来纯化蛋白质粗提物,通过比较双向电泳的结果优选最佳的样品制备方法。结果证明丙酮沉淀-试剂盒联用法较为理想,所得双向电泳图片清晰,分辨率高。因此,此方法可以用于制备野油菜黄单胞菌分泌组双向电泳样品,并可以满足进一步研究的需要。     

野油菜黄单胞菌6-磷酸果糖激酶基因的初步分析

6-磷酸果糖激酶是糖酵解途径中的关键酶,它催化糖酵解途径中第一个不可逆反应。本研究利用pK18mobsacB自杀质粒采用同源双交换的方法对野油菜黄单胞菌Xcc8004中的6-磷酸果糖激酶基因(XC_0872)进行缺失突变,获得无标记的缺失突变体DM0872。表型检测结果显示DM0872突变体不影响野油菜黄单胞菌对葡萄糖和果糖的利用,不影响胞外多糖的合成,也不影响其致病性。该结果显示糖酵解途径在野油菜黄单胞菌的地位并不重要。另外,我们利用RT-PCR方法检测了XC_0872的转录情况,结果显示XC_0872在Xcc8004中是转录的。而之前曾有报道称黄单胞菌中无法检测出6-磷酸果糖激酶活性,这表明XC_0872进行了转录后调控从而使6-磷酸果糖激酶活性受到限制。本研究为野油菜黄单胞菌中糖酵解途径的调控提供了理论依据,对揭示野油菜黄单胞菌中该途径的调控机制具有一定的意义。     

野油菜黄单胞菌中3-羟基脂酰ACP脱水酶Fab Z的生理功能

【背景】野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv. campestris, Xcc)引起十字花科植物黑腐病,在全球范围内造成经济损失,亟须深入研究其致病机理,开发新的黑腐病防控措施。细菌脂肪酸合成系统不仅为细胞膜合成提供原料,其中间代谢产物还是许多生物活性分子合成的底物,具有重要的生理功能,也是抗菌药物筛选的重要靶标。【目的】研究XccfabZ对扩散信号分子(diffusible signal factor, DSF)类信号产量、致病力、胞外酶、胞外多糖和运动性等方面的影响。【方法】利用报告菌株检测法分析了不同替换突变株的DSF类群体感应信号产量。利用同源重组原理,在DSF类信号高产菌株中获得替换突变株,利用高效液相色谱(highperformanceliquid chromatography, HPLC)法测定DSF类信号产量。利用剪叶法检测替换突变株对寄主植物甘蓝的致病力,并分析了不同菌株的胞外多糖、胞外酶和运动性差异。【结果】报告菌株检测法和HPLC法都证明大肠杆菌fabZ替换突变株(XccΔfabZ/pSRK-EcfabZ)中DSF类信号产量显著下降。...     

采用两种突变方法对甘蓝黑腐病菌XC1348基因的功能解析

为研究甘蓝黑腐病菌Xcc8004基因组中一个功能未知的假定蛋白XC₁348的基因功能,本研究用自杀质粒pK18mob和pK18mobSacB分别通过同源单交换和同源双交换构建XC₁348的非极性整合突变体1348nk和有标记的缺失突变体DM1348Gm,并对两种突变体的表型进行检测,结果显示该基因突变后不影响细菌的胞外多糖（EPS）产量、胞外酶活性以及细菌游动性。有趣的是该基因的两种突变体的致病力存在较大差异,原因可能是Xcc经两种方法定点突变后分别具有的不同基因组结构而影响到某些基因的表达所致。通过研究初步了解了XC₁348基因的功能并为今后改进定点突变方法提供现实依据。     

水稻细菌性条斑病菌REC结构域蛋白基因vemRXoc的功能鉴定

水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)是水稻的主要病原细菌之一,该菌引起的水稻细菌性条斑病可导致水稻减产、品质下降.Xoc GX01菌株基因组中含有一个与十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)的致病相关基因vemR一致性高达95.27%的同源基因XOC2152,其编码蛋白中含有磷酸信号识别受体REC结构域.为了研究XOC2152基因在Xoc中的生物学功能,本研究通过基于自杀质粒pK18mob同源整合方法,构建了XOC2152的非极性突变体NK2152.该突变体的胞外多糖产量仅为野生菌株的27.33%,平板游动半径为野生菌株的40.96%,对铜离子耐受能力极显著降低.针刺接种水稻(日本晴品种) 10 d后,Xoc GX01处理的病斑平均长度为(3.86±1.19) cm,而突变体NK2152处理的病斑长度为(0.98±0.45) cm.带有该基因片段的pLAFR3可以互补突变体的表型和致病力变化.上述结果表明XOC2152基因具有与Xcc的vemR类似的功能,被命名为vemRXoc基因.本研究表明XOC2152基因(vemRXoc基因)与水稻细菌性条斑病菌的致病力、胞外多糖产量、运动能力以及对铜离子的耐性等相关.     

十字花科黑腐病菌中一个受HpaS调控的基因的功能分析

十字花科黑腐病菌(Xcc 8004)中一对双组份系统hpa S/hpa R2在致病过程中有重要作用,以前的研究发现,XC2388的表达可能受XC3669/XC3670的调控。为分析XC2388的功能,本试验采用p K18mob Sac B介导的同源双交换的方法构建缺失突变体,对新获得的缺失突变体DM2388的分析发现,XC2388突变后,病原菌对寄主萝卜叶的致病力与野生型相比降低80%,采用PCR扩增XC2388完整的ORF,将新获得的1 349 bp的DNA片段克隆在p LAFR3质粒上,将新获得的重组质粒导入DM2388,发现互补菌株CDM2388的致病力可以恢复至野生型的60%,表明XC2388与致病性相关。以MMX培养基为介质绘制生长曲线,经分析发现突变体的生长严重受阻,在培养基中加入Thr后可以恢复生长,表明DM2388可能是与Thr合成相关的营养缺陷性菌株。     

十字花科黑腐病菌群体密度和DSF信号因子负调控Ⅲ型分泌系统

十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是能在全世界引起十字花科植物黑腐病的革兰氏阴性细菌。群体感应(quorum sensing,QS)是细菌通过感应菌群生长密度调控自身生理活动和致病因子的作用。Xcc QS信号分子为DSF(diffusible signal factor)因子,感受系统由rpf(regulation of pathogenicity factors)基因簇编码。Ⅲ型分泌系统(T3SS)是Xcc与寄主植物相互作用并致病的关键系统,Xcc的Ⅲ型分泌系统是由hrp(hypersensitive response and pathogenicity)基因簇所编码的。研究rpf/DSF系统对Ⅲ型分泌系统的调控作用,对于揭示该病原菌致病分子机制,以及植物病害防治具有重要的意义。针对Xcc 8004菌株,利用连有hrp B基因启动子区的p LGUS报告质导入Xcc 8004中,在XCM诱导培养基中添加DSF因子后通过测定GUS酶活对比DSF对hrp基因的调控作用。结果发现,随着菌体浓度的增长,hrp B基因的表达呈下降趋势;额外加入DSF因子后hrp B基因的表达量呈现下降趋势。十字花科黑腐病菌中菌体密度和信号扩散因子对Ⅲ型分泌系统有负调控作用。     

十字花科黑腐病菌dsbA基因控制的亚细胞蛋白质组分析

本研究以十字花科黑腐病菌(Xarcthomorcas campestris pv.campestris,Xcc)8004菌株为研究对象,采用双向电泳—质谱技术分析比较了dsbA1A2突变体和野生型菌株的分泌蛋白、周质蛋白表达谱。与野生型菌株相比,选取的31个差异蛋白中,14个蛋白点显著上调,17个蛋白点显著下调。对这些蛋白质点进行质谱鉴定和分析,结果显示,dsbA1A2基因的缺失导致了周质蛋白中与β桶结构膜蛋白形成有关的伴侣蛋白SurA的含量降低,几种未知功能的分泌蛋白的分泌量减少以及外膜蛋白OmpW、OmpW1在周质空间的积累。推测这些蛋白质对Xcc 8004的致病性至关重要,为进一步研究Xcc 8004中DSB系统的作用机理提供了依据。     

十字花科黑腐病菌一个新的III型效应物XC3176的鉴定

摘要:【目的】在十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv． campestris,Xcc)的致病因子中,III型分泌系统(Type III Secretion System,T3SS)是至关重要的致病系统,III型效应物通过III 型分泌系统直接转运到寄主植物细胞内。本研究通过效应物水平转移的特征获得候选基因,旨在鉴定一个新的依赖于III型分泌的效 应物。【方法】以缺失了N-端58个氨基酸的AvrBs1作为报告系统构建效应物鉴定报告质粒pLJB3176,导入ΔavrBs1和ΔhrcV,通过检测报告菌株在辣椒ECW-10R上的过敏反应来鉴定XC3176是否为III型效应物。构建XC3176融合GUS报告质粒pLGUS3176,导入野生菌株Xcc 8004、ΔhrpG和ΔhrpX,通过测定菌株GUS活性检测hrpG、hrpX对XC3176 的调控作用。构建XC3176缺失突变体和互补菌株,通过剪叶法接种检测XC3176对Xcc 8004致病性的影响。【结果】XC3176融合AvrBs1报告菌株在非寄主辣椒ECW-10R上能 引发过敏反应,GUS活性检测显示ΔhrpG/pLGUS3176、ΔhrpX/pLGUS3176比8004/pLGUS3176的GUS酶活显著降低,致病性检测显示突变体Δ3176与野生型Xcc 8004相比在寄主满身红萝卜上的病斑长度有显著减少,互补菌株C3176 的病斑长度能补回到野生型水平。【结论】XC3176是依赖于hrcV分泌的III型效应物,hrpG、hrpX正调控XC3176,XC3176与Xcc致病相关。     

3种接种方法对十字花科黑腐病菌Xcc8004菌株在拟南芥Col-0上致病力的影响

十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pathovar campestris,Xcc)是引起十字花科植物黑腐病的病原菌,也是研究寄主与病原微生物相互作用分子机理的模式菌之一.Xcc可以感染白菜、萝卜和甘蓝等十字花科农作物,也可以感染重要的模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana).由于拟南芥的全基因组测序已经完成,因此,拟南芥是研究寄主植物对Xcc浸染的防卫反应的分子机理的最理想的寄主材料.但是,到现在为止,一套完善的在拟南芥上进行Xcc致病检测的实验系统还没有建立.为此,本研究比较了"叶片压渗法"、"剪叶法"和"叶片中脉穿刺法"这3种常用的病原细菌接种方法对Xcc的实验室菌株8004 (以下简称Xcc8004)在哥伦比亚生态型拟南芥(A.thanliana ecoype Colombia 0,Col-0)上的致病力的影响.结果发现,在拟南芥Col-0叶片上用"叶片压渗法"接种Xcc8004可以引起明显致病症状,而用"剪叶法"和"叶片中脉穿刺法"接种均不能引起病症.这一结果说明,不同的接种方法的对Xcc在拟南芥上的致病力有很大的影响.因此,要在拟南芥Col-0上进行Xcc8004的致病力检测,本研究建议采用"叶片压渗法"而不用"剪叶法"和"叶片中脉穿刺法".此外,本研究还建立了一套简易的拟南芥试验用苗的栽培方法.     

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种8004菌株wxcA基因与EPS的产量有关

在以前的工作中,采用转座子Tn5 gusA5对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc)8004菌株进行诱变,获得一批胞外多糖(EPS)合成减少的突变体,对这些突变体的Tn5 gusA5的插入位点进行分析后,发现有两株突变体是wxcA基因不同插入位点的突变体。以前认为wxcA基因与脂多糖(LPS)的O-抗原合成有关而与EPS的合成无关。为明确wxc4基因的功能,对8004菌株的wxcA基因进行缺失,获得的△wxcA突变体的EPS产量与野生型菌株相比,减少了50％,并且一段PCR合成的包含wxcA基因的DNA片段能反式互补△wxcA突变体,恢复突变体的EPS产量。这证实了8004菌株的wxcA基因与EPS的合成产量有关。     

十字花科黑腐病菌全局转录后调控蛋白RsmA抑制胞外蛋白酶产生

胞外蛋白酶、胞外淀粉酶和胞外纤维素酶是十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)的重要致病因子,它们的表达受到严格的调控。本实验室之前的研究发现,在Xcc8004菌株中,编码全局转录后调控蛋白RsmA的基因rsmA缺失导致胞外淀粉酶和胞外纤维素酶产量显著下降,但不影响胞外蛋白酶的产量。因此认为,RsmA正向调控胞外淀粉酶和胞外纤维素酶的产生,而不调控胞外蛋白酶的产生。为了进一步明确RsmA是否参与胞外蛋白酶的表达调控,本研究构建了rsmA的过量表达株OErsmA,检测了其胞外蛋白酶产量,并和带有空的过表达载体的野生型菌株(WT/pB)的胞外蛋白酶产量进行了比较。结果发现,OErsmA的胞外蛋白酶产量比WT/pB的显著下降,证明RsmA具有抑制胞外蛋白酶产生的功能。Northern杂交结果显示,主胞外蛋白酶基因prtA的mRNA积累量在OErsmA和WT/pB中没有明显差异。而凝胶阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)结果显示,(His)₆-RsmA能...     

广西十字花科黑腐病菌致病性分化及遗传多样性分析

为了研究广西十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,XCC)的致病性差异和遗传多样性。本研究采用剪叶接种法对来自广西十字花科物种的24个菌株进行致病性分析,并利用细菌基因组的重复序列PCR(Rep-PCR)技术,对供试菌株的遗传多样性进行研究。结果表明:采用剪叶接种方法,供试菌株致病力均可划分为5种致病型,且与菌株的地理来源有一定的相关性;利用细菌基因组重复序列通用引物进行Rep-PCR扩增,在遗传距离为0.79时,供试菌株可被划分为5个遗传相似组,与染病作物无明显的关联性,而与同一地区的关系有相对明显的关联性,并由此得到这样的结论:侵染广西十字花科黑腐病菌存在明显的致病性分化和丰富的遗传多样性。     

十字花科黑腐病菌中转录调控因子HpaR1调控一个纤维素酶基因的表达

十字花科黑腐病菌（Xcc8004）中的一个转录调控因子XC₂736（HpaR1）在致病过程中具有重要的作用。前期研究发现该转录调控因子可能调控胞外纤维素酶的合成。为了解HpaR1对纤维素酶的转录调控机理,本研究对HpaR1进行原核表达纯化,并与488bp的包含XC₀639的启动子区DNA片段进行凝胶电泳迁移率试验,发现HpaR1与XC₀639启动子可以发生结合。将488bp的XC₀639的启动子DNA片段与报告基因gus融合,构建XC₀639的报告质粒pGUS0639r,分别导入野生型8004菌株和缺失突变体DM2736中,分析发现在突变体背景下GUS的表达水平比野生型背景明显降低。表明HpaR1正调控XC₀639的表达。构建XC₀639的极性整合突变体PK0639,检测发现PK0639几乎丧失胞外纤维素酶的活力;通过功能反式互补构建的互补菌株CPK0639可以恢复纤维素酶活性。研究结果表明HpaR1通过调控纤维素酶基因XC₀639的表达来调控细胞的纤维素酶活性。本研究为更深入地了解HpaR1如何调控细菌生理生化功能奠定了基础。