天然氨基酸诱导野油菜黄单胞菌降解DSF-家族群体感应信号活性分析

【背景】野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv. campestris,Xcc)是十字花科植物黑腐病的致病菌。Xcc中DSF (Diffusible signal factor)信号依赖的群体感应系统和RpfB介导的群体感应退出机制均与其致病性密切相关。【目的】分别检测18种氨基酸对DSF-家族群体感应信号分子合成的影响,为研发新型生物防治方法提供思路。【方法】添加不同浓度的氨基酸到ΔrpfC菌株XYS培养体系中,接种后不同时间点取样提取DSF信号分子,利用高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)分析DSF和BDSF浓度。【结果】18种氨基酸中,甲硫氨酸、色氨酸和胱氨酸能有效降低ΔrpfC菌株培养体系中DSF和BDSF水平,抑制效果与氨基酸浓度密切相关;3种氨基酸对DSF信号分子的抑制作用存在叠加效应;甲硫氨酸、色氨酸或胱氨酸不影响ΔrpfCΔrpfB双突变体菌株中DSF和BDSF水平。【结论】首次发现了甲硫氨酸、色氨酸和胱氨酸通过RpfB诱导Xcc退出群体感应状态。     

十字花科黑腐病菌的XC1193基因与致病相关

十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是一种重要植物病原细菌,在全球范围内侵染十字花科植物引起黑腐病,其σ因子在基因表达中起到重要调节作用。XC1193基因在Xcc 8004菌株编码一个σ~70因子,为进一步研究该σ因子在Xcc中的调控作用,利用自杀质粒p K18mobsac B构建了XC1193基因的缺失突变体DM1193。与野生型菌株的比较发现,XC1193基因突变不影响菌体在丰富培养基和基本培养基上的生长;突变体的胞外蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶等生化表型也与野生型一致;植株实验表明XC1193突变不影响过敏反应。采用剪叶接种法进行致病性检测,突变体致病力与野生型一致。而采用喷雾接种法,突变体致病力显著降低,互补菌株致病力恢复至野生型水平。结果表明,该σ因子在十字花科黑腐病菌致病过程中发挥作用,并与Xcc侵染寄主的早期事件有关。     

十字花科黑腐病菌群体密度和DSF信号因子负调控Ⅲ型分泌系统

十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是能在全世界引起十字花科植物黑腐病的革兰氏阴性细菌。群体感应(quorum sensing,QS)是细菌通过感应菌群生长密度调控自身生理活动和致病因子的作用。Xcc QS信号分子为DSF(diffusible signal factor)因子,感受系统由rpf(regulation of pathogenicity factors)基因簇编码。Ⅲ型分泌系统(T3SS)是Xcc与寄主植物相互作用并致病的关键系统,Xcc的Ⅲ型分泌系统是由hrp(hypersensitive response and pathogenicity)基因簇所编码的。研究rpf/DSF系统对Ⅲ型分泌系统的调控作用,对于揭示该病原菌致病分子机制,以及植物病害防治具有重要的意义。针对Xcc 8004菌株,利用连有hrp B基因启动子区的p LGUS报告质导入Xcc 8004中,在XCM诱导培养基中添加DSF因子后通过测定GUS酶活对比DSF对hrp基因的调控作用。结果发现,随着菌体浓度的增长,hrp B基因的表达呈下降趋势;额外加入DSF因子后hrp B基因的表达量呈现下降趋势。十字花科黑腐病菌中菌体密度和信号扩散因子对Ⅲ型分泌系统有负调控作用。     

野油菜黄单胞菌中LipB-LipA是唯一的硫辛酰化途径

【目的】硫辛酸是细胞内重要的辅因子,参与多种基础代谢过程。野油菜黄单胞菌(Xcc)是十字花科植物黑腐病的病原菌,在全球范围内引起植物病害,引起重大经济损失。为此研究Xcc中硫辛酸的合成途径,为防治黑腐病提供新思路。【方法】利用大肠杆菌硫辛酸合成关键酶LipA和LipB序列,同源比对发现Xcc基因组中XC_0713 (XccLipA)和XC_0712 (XccLipB)具有较高的同源性。采用PCR方法分别扩增XccLipA和XccLipB基因,并连入表达载体pBAD24M后分别互补大肠杆菌突变株,并检测转化子生长表型。利用同源重组方法,获得替换突变株,分析其生长性状,并利用剪叶法检测替换突变株对寄主植物甘蓝的致病力。【结果】XcclipA和XcclipB能分别恢复大肠杆菌lipA和lipB突变株在基础培养上生长。XcclipA和XcclipB都是菌体生长的必需基因,不能直接被敲除。但导入pSRK-EclplA后,成功分别获得XcclipA和XcclipB敲除突变株。两种EclplA替换后的敲除突变株在基础培养上都不能生长,添加硫辛酸后能恢复生长表型。在丰富培养基上,XcclipB敲除突变株能正常生长,而XcclipA敲除突变株不能生长,添加硫辛酸后生长也能恢复。分别测定不同培养条件下生长曲线,也得到同样的结果。寄主植物侵染结果显示,与野生菌相比,XcclipA敲除突变株致病性几乎丧失,而XcclipB敲除突变株的致病性与野生菌无显著性差异。【结论】Xcc中lipA编码硫辛酸合成酶,lipB编码辛酰转移酶,两者都是必需基因。Xcc中LipB-LipA途径是唯一的硫辛酰化途径,而没有外源性的硫辛酸途径。lipA敲除后显著影响Xcc的致病性,可作为抗菌药物筛选的靶点。     

十字花科黑腐病菌中一个与趋化性相关基因的突变分析

十字花科作物黑腐病,又称为野油菜黄单胞菌野油菜变种(Xanthomonas campestris pv.campestris,简称Xcc),该细菌是引起十字花科作物等植物发生黑腐病的病原菌,同时该细菌也是人们研究寄主与病原微生物相互作用的具体分子机理的模式菌之一。在Xcc 8004菌株基因组中,XC_2304编码的产物为一个趋化性蛋白。由于细菌的趋化性在病原学方面的意义是非常重要的,为评估XC_2304的功能,本研究利用p K18mob Sac B对XC_2304进行缺失突变,获得缺失突变体DM2304。植株试验发现,突变体DM2304对寄主植物的致病力下降约30%,其互补菌株CDM2304的致病力基本恢复至野生型水平,这表明XC_2304与Xcc致病力有关。利用毛细管法检测DM2304对18种物质的趋化性,结果表明突变体对木糖、苯丙氨酸、精氨酸、蔗糖以及核糖的趋化性比野生型弱。运动性分析发现,DM2304在含有0.3%、0.6%琼脂的NYGA板的游动性稍微降低,表明XC_2304与游动性有关。而DM2304的胞外纤维素酶、胞外蛋白酶、胞外淀粉酶、EPS产量、HR与野生型菌株相比均没有明显差异。本研究为十字花科黑腐病菌中其它与趋化性相关基因提供实验思路,对病原菌如何趋利避害的机制的研究具有一定的意义。     

假定蛋白基因XC2038与十字花科黑腐病菌致病相关

十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是研究植物病原细菌和寄主互作的模式细菌,鉴定其致病相关基因对于控制作物病害有重要的意义。XC2038在Xcc 8004中注释为功能未知的假定蛋白基因。本研究利用实验室前期构建的XC2038基因的Tn5gus A5插入突变体164H09,并构建了该突变体的互补菌株C164H09,随后对各菌株的致病性及相关表型进行了检测。结果表明,164H09影响Xcc 8004胞外多糖、泳动性及生物被膜的形成,影响在寄主满身红萝卜上的致病性,而突变体的互补菌株能将以上表型恢复至野生型水平。综上可知,假定蛋白基因XC2038与十字花科黑腐病菌致病相关。     

水稻白叶枯病菌Δrpfxoo基因缺失突变体DSF信号产生和毒性表达

【目的】旨在阐明3个DSF/Rpfxoo信号系统成员RpfFxoo、RpfCxoo和RpfGxoo在水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)毒性表达中的功能。【方法】用标记置换法缺失突变rpfFxoo、rpfCxoo和rpfGxoo基因,测定突变体及其互补菌株的DSF(diffusible signal factor)信号分子产生、胞外多糖(EPS)产生及其对水稻的致病性。【结果】从野生型菌株PXO99A基因组中克隆了推测与DSF信号生成和传导有关的基因rpfFxoo、rpfCxoo和rpfGxoo,获得了相应的单基因或双基因缺失突变体。与PXO99A产生DSF相比,ΔrpfFxoo、ΔrpfF+Cxoo和ΔrpfF+Gxoo均不产生DSF,ΔrpfCxoo过量产生,ΔrpfGxoo产量降低;rpfFxoo、rpfCxoo和rpfGxoo可以分别互补Xoo和Xcc的相应基因突变体,恢复DSF产生表型。除ΔrpfFxoo的EPS产生无明显变化外,其余突变体的均显著减少。所有突变体对水稻的致病性均显著下降。【结论】RpfFxoo、RpfCxoo和RpfGxoo调控了Xoo的DSF信号生成、EPS产生和致病性。     

大肠杆菌转录后调控蛋白CsrA的C末端具有抑制十字花科黑腐病菌胞外蛋白酶活性的功能

CsrA(在有些细菌例如十字花科黒腐病菌中也称为RsmA,统称CsrA/RsmA)是一类在细菌中广泛分布而且氨基酸序列非常保守的RNA结合蛋白。研究表明,CsrA/RsmA作为转录后全局调控因子参与了包括细胞碳代谢、次生代谢、运动性、生物被膜形成以及动植物病原菌的致病过程等许多细胞过程的调控。CsrA/RsmA在不同的细菌中的生物学功能各有异同。在大肠杆菌中,CsrA的主要功能是控制细胞的碳代谢、运动性和生物被膜形成;而在十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pathovar campestris,Xcc)中,CsrA的同源蛋白RsmA的主要功能除了控制碳代谢、运动性和生物被膜形成外,还控制致病性和胞外酶的产生。大肠杆菌的CsrA(CsrAE.coli)是否具有XccRsmA(RsmAXcc)的功能?为了回答这个问题,我们用大肠杆菌的csrA基因(csrAE.coli)互补Xcc的rsmA基因(rsmAXcc)的缺失突变体DM2506。结果显示,csrAE.coli能够互补DM2506的所有表型,说明CsrAE.coli具有RsmAXcc的全部功能。更重要的是,我们发现,无论是rsmAXcc突变体还是野生型菌株,导入表达CsrAE.coli的质粒后均导致其致胞外蛋白酶活性的严重下降,证明CsrAE.coli具有抑制Xcc胞外蛋白酶活性的作用。进一步的实验证实,CsrAE.coli的C末端第53～61位氨基酸残基具有抑制Xcc胞外蛋白酶活性的功能。     

水稻细菌性条斑病菌RpfCxoc/RpfGxoc双组分系统的功能

【目的】旨在阐明双组分系统RpfCxoc/RpfGxoc在水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)DSF(diffusible signal factor)合成、致病性等相关方面的生物学功能。【方法】以Xoc野生型菌株Rs105为母体,利用自杀载体pK18mobsacB缺失突变rpfCxoc、rpfGxoc和rpfGCxoc(rpfCxoc和rpfGxoc双基因),测定突变体及其互补菌株的DSF合成水平、对水稻的致病性、胞外多糖(extracellular polysaccharide,EPS)产量、菌体形态及群体结构。【结果】从Rs105基因组中克隆了rpfCxoc和rpfGxoc基因,并获得了相应的单基因或双基因缺失突变体。与Rs105相比,ΔrpfCxoc和ΔrpfGCxoc过量合成DSF信号分子,但是ΔrpfGxoc合成DSF的能力显著下降;rpfCxoc和rpfGxoc单基因或双基因的缺失突变均导致Xoc的致病性丧失,EPS合成水平下降34.1%-48.5%,形成菌体高度聚集的生物膜结构。【结论】RpfCxoc/RpfGxoc双组分系统调控Xoc的DSF生物合成、EPS产生和生物膜的驱散,是Xoc保持致病性所必需的因子。     

青枯雷尔氏菌胞外多糖合成缺失突变株构建及其生物学特性

【目的】由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的植物青枯病是一种毁灭性土传病害。胞外多糖(extracellular polysaccharides,EPS)是青枯雷尔氏菌关键的致病因子之一。通过构建胞外多糖缺失突变株,研究胞外多糖在青枯病致病中的作用。【方法】从青枯雷尔氏菌FJAT-91的基因组中克隆出胞外多糖合成结构基因epsD同源臂,克隆至自杀性质粒p K18mobsacB,再将庆大霉素抗性基因(Gm)插入同源臂中间,获得重组质粒p K18-epsD。将重组质粒转化至青枯雷尔氏菌FJAT-91感受态细胞中,通过同源重组敲除epsD基因,获得EPS合成缺失的突变株FJAT-91Δeps 。研究突变株与野生菌株在菌落形态、胞外多糖合成、运动能力、定殖能力的差异性。【结果】突变菌株FJAT-91ΔepsD与出发菌株FJAT-91相比:胞外多糖产量显著减少,生长较慢;泳动能力(swimming motility)和群集运动能力(swarming motility)显著降低;在番茄苗根部和茎部的定殖能力显著降低;弱化指数(AI)为0.905,鉴定为无致病力菌株。【结论】胞外多糖在青枯雷尔氏菌的致病中起着关键的作用,本课题研究成果为开发植物疫苗提供了优良的材料与研究基础。     

十字花科黑腐病菌III型效应物XopXccR1植物亚细胞定位

[目的] 植物病原细菌通过III型分泌系统（type III secretion system,T3SS）将III型效应物（type III secreted effectors,T3SEs）分泌转运到宿主细胞的不同位点上,进而行使不同的致病功能。本研究旨在确定Xcc 8004 III型效应物中分子量最大的蛋白XopXccR1在植物中的亚细胞定位。[方法] 利用生物信息学方法分析XopXccR1的跨膜信息。通过同源重组方法将XopXccR1全长、N端（1–1220 aa）和C端（1221–2030 aa）分别克隆到植物表达载体pCAMBIA-2300-35S：：EGFP上,利用根癌农杆菌介导的瞬时表达浸染本生烟,通过激光共聚焦显微镜观察亚细胞定位结果。[结果] XopXccR1全长和N端定位在本生烟细胞膜上,而C端定位在细胞质中。[结论] XopXccR1的N端与C端可能分别存在定位信号,N端信号主导全长蛋白的最终定位。     

A novel 3-oxoacyl-ACP reductase (FabG3) is involved in the xanthomonadin biosynthesis of Xanthomonas campestris pv. campestris

Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc), the causal agent of black rot in crucifers, produces a membrane-bound yellow pigment called xanthomonadin to protect against photobiological and peroxidative damage, and uses a quorum-sensing mechanism mediated by the diffusible signal factor (DSF) family signals to regulate virulence factors production. The Xcc gene XCC4003, annotated as Xcc fabG3, is located in the pig cluster, which may be responsible for xanthomonadin synthesis. We report that fabG3 expression restored the growth of the Escherichia coli fabG temperature-sensitive mutant CL104 under non-permissive conditions. In vitro assays demonstrated that FabG3 catalyses the reduction of 3-oxoacyl-acyl carrier protein (ACP) intermediates in fatty acid synthetic reactions, although FabG3 had a lower activity than FabG1. Moreover, the fabG3 deletion did not affect growth or fatty acid composition. These results indicate that Xcc fabG3 encodes a 3-oxoacyl-ACP reductase, but is not essential for growth or fatty acid synthesis. However, the Xcc fabG3 knock-out mutant abolished xanthomonadin production, which could be only restored by wild-type fabG3, but not by other 3-oxoacyl-ACP reductase-encoding genes, indicating that Xcc FabG3 is specifically involved in xanthomonadin biosynthesis. Additionally, our study also shows that the Xcc fabG3-disrupted mutant affects Xcc virulence in host plants.     

Use of oligonucleotide probes to identify members of two-component regulatory systems in Xanthomonas campestris pathovar campestris

Summary Two-component regulatory systems comprising a sensor and a regulator protein, both with highly conserved amino acid domains, and commonly genetically linked, have been described in a range of bacterial species and are involved in sensing environmental stimuli. We used two oligonucleotide probes matching the postulated coding regions for domains of sensor and regulator proteins respectively in Xanthomonas campestris pathovar campestris (Xcc) to identify possible two-component regulatory systems in Xcc. Two different fragments of Xcc DNA with homology to both of these probes were cloned. The DNA sequence of part of one of these fragments encompassed a potential open reading frame (ORF), the predicted amino acid sequence of which had extensive homology with regulator proteins of two-component regulatory systems. Analysis of the predicted amino acid sequence for the 3 end of an adjacent ORF revealed a very high level of homology with the C-terminal end of sensor proteins. Strains of Xcc with Tn5-induced mutations in the regulator gene were affected in extracellular polysaccharide production, and also in resistance to salt and chloramphenicol. No effects of mutation in the second clone were observed.     

茎瘤固氮根瘤菌ORS571中motA基因的功能分析

[目的] MotA是细菌的鞭毛马达蛋白,是跨膜质子通道的重要组成结构之一,在调控鞭毛运动中具有至关重要的作用。本研究探究了Azorhizobium caulinodans ORS571中鞭毛马达基因motA对菌株表型和植物互作的影响。[方法] 通过同源重组原理和三亲接合转移方法构建突变菌株∆motA,测定野生型与突变体在菌体生长、运动、固氮、胞外多糖合成、生物膜形成及根系定殖能力的差异。[结果] 与野生型相比,突变体菌体生长没有明显差异,但其运动能力完全丧失,固氮、胞外多糖合成、生物膜形成及根系定殖能力减弱。[结论] MotA鞭毛马达蛋白对A.caulinodans ORS571的运动、固氮、胞外多糖合成、生物膜形成及根系定殖能力均有调控作用。     

野油菜黄单胞菌中烯脂酰ACP还原酶的功能鉴定

烯脂酰ACP还原酶是细菌脂肪酸合成的关键酶之一.本研究通过生物信息学分析发现,野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris(Xcc)8004基因组中XC_0119(Xccfab V)注释为反-2-烯脂酰Co A还原酶基因.但其编码产物与铜绿假单胞菌的烯脂酰ACP还原酶Fab V具有较高的同源性,并含有相同的催化活性中心Tyr-(Xaa)8-Lys序列.用携带Xccfab V的质粒载体互补大肠杆菌fab I温度敏感突变株JP1111,转化子能在42℃生长,表明Xccfab V能遗传互补大肠杆菌fab I突变.体外重建脂肪酸合成反应表明,Xcc Fab V能催化不同链长的烯脂酰ACP还原为脂酰ACP,且催化活性不受三氯森抑制.遗传学研究表明,Xccfab V是必需基因,不能获得Xccfab V基因敲除突变株.将携带大肠杆菌fab I的外源质粒导入野生菌后,可敲除染色体上的fab V基因,获得的替换突变株生长特性和脂肪酸组成未发生显著变化,但替换突变株对三氯森敏感.上述结果证实,野油菜黄单胞菌fab V是必需基因,编码烯脂酰ACP还原酶,参与脂肪酸从头合成反应,且Fab V是Xcc对三氯森耐受的根本原因.     

地毯草黄单胞菌双组分系统VgrS-VgrR基因敲除及表型筛选

【目的】研究地毯草黄单胞菌双组分系统VgrS-VgrR与致病性的关系,为木薯细菌性病害的高效防控提供分子生物学证据。【方法】采用同源重组方法构建vgrS和vgrR的插入失活突变体,用可移动的cosmid载体p HM1构建互补菌株。检测突变体的致病性、细菌游动性、胞外酶、胞外多糖的变化,观察细菌对H_2O_2和金属离子胁迫的反应。【结果】相比野生型菌株,vgrS和vgrR突变体接种寄主植物木薯后致病力显著降低,突变体的游动性减少、蛋白酶活性减弱、H_2O_2耐受性降低,在高浓度金属离子Fe²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Co²⁺的胁迫条件下菌体生长显著减弱。然而,vgrS和vgrR突变体的胞外多糖含量显著升高,分别是野生型的2.14和1.89倍。【结论】阐明了VgrS-VgrR系统在细菌致病过程中发挥的重要作用,为鉴定VgrS-VgrR调控机制提供线索,为药物筛选提供靶向目标。     

荧光假单胞菌2P24中opgGH基因影响抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚的产生

【目的】抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-diacetylphloroglucinol,2,4-DAPG)是生防菌株荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens) 2P24防治植物病害的关键因子,然而对2,4-DAPG生物合成的调控通路并未完全解析。【方法】前期利用Tn5随机突变的方法获得一株对棉花立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)拮抗能力完全丧失的突变菌株W3,本研究利用基因互补等方法研究该突变体中被破坏的基因对菌株2P24分泌2,4-DAPG和其他生防相关性状的影响。【结果】Tn5插入位点及其序列分析表明突变菌株W3中Tn5破坏了opgG基因。鉴于opgG和opgH基因组成操纵子,利用同源重组技术构建了opgGH内缺失突变菌株。与野生菌株2P24相比,opgGH突变菌株中2,4-DAPG的产量显著降低。对其他生防相关性状的检测发现,突变opgGH基因并不影响群体感应系统(quorum sensing,QS)信号分子的产生、氢氰酸的产生以及生物膜的形成,但可抑制菌株2P24的游动性。转录融合实验进一步表明opgGH基因并不调控gacA基因及其调控...     

蛋白-O-岩藻糖基转移酶1基因CfPOFUT1在果生炭疽菌中的功能分析

【目的】蛋白-O-岩藻糖基转移酶1 (protein O-fucosyltransferase 1,POFUT1)是催化蛋白质O-岩藻糖基化的关键酶,在动物和人体内被证明调控一系列的生理病理过程,然而POFUT1基因在果生炭疽菌乃至真菌中还未见报道。本研究旨在克隆果生炭疽菌中CfPOFUT1基因,并分析其生物学功能。【方法】利用RT-PCR技术扩增CfPOFUT1的基因并进行生物信息学分析,构建了CfPOFUT1基因的沉默和过表达载体,通过PEG介导法将载体导入原生质体中获得CfPOFUT1基因的沉默和过表达突变体。测定了野生型菌株、CfPOFUT1沉默菌株和过表达菌株在PDA上的菌丝生长、分生孢子产生、萌发与附着胞形成、胁迫应答和致病力、杀菌剂敏感性等生物学表型。【结果】与野生型菌株相比,基因过表达突变体产孢量显著增加,致病力增强,对嘧菌酯敏感性降低,但对多菌灵和咪鲜胺敏感性增强。基因沉默突变体产孢量减少,细胞壁完整性、内质网应激敏感性提高,致病力减弱,对嘧菌酯敏感性提高,但对多菌灵和咪鲜胺敏感性降低。【结论】CfPOFUT1基因参与调控果生炭疽菌分生孢子产量,细胞壁完整性、内质网对应激和药剂敏感性,并对其致病性也具有一定的影响。