野油菜黄单胞菌野油菜致病变种8004菌株wxcA基因与EPS的产量有关

在以前的工作中,采用转座子Tn5gusA5对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc) 8004菌株进行诱变,获得一批胞外多糖(EPS)合成减少的突变体,对这些突变体的Tn5gusA5的插入位点进行分析后,发现有两株突变体是wxcA基因不同插入位点的突变体。以前认为wxcA基因与脂多糖(LPS)的O抗原合成有关而与EPS的合成无关。为明确wxcA基因的功能,对8004菌株的wxcA基因进行缺失,获得的ΔwxcA突变体的EPS产量与野生型菌株相比,减少了50%,并且一段PCR合成的包含wxcA基因的DNA片段能反式互补ΔwxcA突变体,恢复突变体的EPS产量。这证实了8004菌株的wxcA基因与EPS的合成产量有关。     

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种中一个与EPS合成有关的新基因的鉴定

用转座子Tn5gusA5对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris,简称Xcc)野生型菌株8004进行诱变,分离到一批胞外多糖(EPS)合成减少的突变体。采用TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)分析突变体的Tn5gusA5插入位点,发现其中一株编号为151D09的突变体的插入位点位于Xcc 8004菌株的基因组编号为XC3695的ORF内,该ORF功能尚未见报道。序列分析表明,该ORF演绎的编码产物与Serratia marcescens的kdtX基因和Klebsiella pneumoniae的waaE基因演绎的编码产物分别具有52%和50%的相似性,并具有第2家族糖基转移酶的功能域, 因此暂将该ORF命名为waxE基因。用同源双交换方法构建了waxE基因的缺失突变体,并采用PCR和Southern杂交的方法对突变体进行了验证。waxE基因缺失突变体在营养丰富培养基的生长繁殖不受影响,但其EPS产量与野生型菌株8004相比,降低35%左右,并且一段PCR合成的包含waxE基因的DNA片段能反式互补waxE基因缺失突变体,恢复缺失突变体的EPS产量,表明Xcc waxE基因与EPS的生物合成有关。     

十字花科黑腐病菌中影响致病相关基因XC3814表达的基因鉴定

十字花科黑腐病菌8004菌株的XC3814基因与致病性和胞外多糖合成有关。文章将XC3814的启动子与报告基因sacB融合, 构建了XC3814的表达报告质粒pL3814sac。将该质粒导入野生型菌株8004, 获得了报告菌株8004/pL3814sac。利用转座子EZ::Tn5对报告菌株的基因组进行随机诱变, 分离到3株耐蔗糖的突变体。分析发现其中的1株突变体是由EZ::Tn5插入到编号为XC3882的未知功能的基因所产生的。将由XC3814启动子与报告基因gusA融合得到的报告质粒pGUS3814分别导入8004菌株和XC3882的转座子Tn5gusA5插入突变体, 测定比较pGUS3814的GUS表达水平, 结果显示在XC3882突变体背景下GUS的表达水平比在野生型背景下降低81.3%, 表明XC3814基因的表达水平受XC3882基因的影响。     

野油菜黄单胞菌野油菜致病型胞外多糖合成有关的DNA序列的克隆

以从野油菜黄单胞菌野油菜致病型（Xanthomonascampestrispv.campestris）胞外多糖突变体T117中克隆到的含有突变序列的DNA片段作探针,从野生型菌株中鉴定和克隆了含有相应序列的9．4kbHindⅢ片段。该片段可反式互补突变体T117,完全恢复其胞外多糖的合成,说明该片段至少含有一个完整的与该菌胞外多糖合成有关的基因。     

野油菜黄单胞菌分泌组双向电泳样品制备方法的建立

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是十字花科植物黑腐病的病原细菌。我们建立了Xcc的蛋白质组学研究平台,用于分离、鉴定该菌的致病相关蛋白。为了减少胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)对蛋白材料质量的影响,我们构建了EPS缺陷的Xcc8004ΔgumB突变体。本研究以Xcc8004ΔgumB出发菌株,用诱导培养液培养,取细胞上清通过超滤浓缩得到蛋白质粗提物,分别采用丙酮沉淀法、试剂盒纯化法和丙酮沉淀-试剂盒联用法来纯化蛋白质粗提物,通过比较双向电泳的结果优选最佳的样品制备方法。结果证明丙酮沉淀-试剂盒联用法较为理想,所得双向电泳图片清晰,分辨率高。因此,此方法可以用于制备野油菜黄单胞菌分泌组双向电泳样品,并可以满足进一步研究的需要。     

野油菜黄单胞菌6-磷酸果糖激酶基因的初步分析

6-磷酸果糖激酶是糖酵解途径中的关键酶,它催化糖酵解途径中第一个不可逆反应。本研究利用pK18mobsacB自杀质粒采用同源双交换的方法对野油菜黄单胞菌Xcc8004中的6-磷酸果糖激酶基因(XC_0872)进行缺失突变,获得无标记的缺失突变体DM0872。表型检测结果显示DM0872突变体不影响野油菜黄单胞菌对葡萄糖和果糖的利用,不影响胞外多糖的合成,也不影响其致病性。该结果显示糖酵解途径在野油菜黄单胞菌的地位并不重要。另外,我们利用RT-PCR方法检测了XC_0872的转录情况,结果显示XC_0872在Xcc8004中是转录的。而之前曾有报道称黄单胞菌中无法检测出6-磷酸果糖激酶活性,这表明XC_0872进行了转录后调控从而使6-磷酸果糖激酶活性受到限制。本研究为野油菜黄单胞菌中糖酵解途径的调控提供了理论依据,对揭示野油菜黄单胞菌中该途径的调控机制具有一定的意义。     

TAIL-PCR方法快速分离Xcc致病相关基因序列

以mini-Tn5 gfp-km转座子中nptⅡ片段作为探针,对已获得的五株野油菜黄单胞菌野油菜黑腐病致病型（Xcc)非致病突变体进行了Southern blot分析,结果表明,这五株突变体确由mini-Tn5 gfp-km转座子插入致病相关基因所致,且为单拷贝不同位点的插入。提取这五株突变体总DNA作为模板,采用改进的热不对称交错PCR（TAIL－PCR）方法从其中克隆到了各自转座子插入区侧翼序列,对这些侧翼序列进行了序列测定并将分析结果与GenBank database及Xcc全基因组序列做了比较,结果表明,五个侧翼序列所在的基因确与Xcc致病性有关。这种改进后的TAIL－PCR方法为突变体特别是转座子插入突变体中目的基因的克隆提供了一种简要高效的新方法。     

野油菜黄单胞菌中烯脂酰ACP还原酶的功能鉴定

烯脂酰ACP还原酶是细菌脂肪酸合成的关键酶之一.本研究通过生物信息学分析发现,野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris(Xcc)8004基因组中XC_0119(Xccfab V)注释为反-2-烯脂酰Co A还原酶基因.但其编码产物与铜绿假单胞菌的烯脂酰ACP还原酶Fab V具有较高的同源性,并含有相同的催化活性中心Tyr-(Xaa)8-Lys序列.用携带Xccfab V的质粒载体互补大肠杆菌fab I温度敏感突变株JP1111,转化子能在42℃生长,表明Xccfab V能遗传互补大肠杆菌fab I突变.体外重建脂肪酸合成反应表明,Xcc Fab V能催化不同链长的烯脂酰ACP还原为脂酰ACP,且催化活性不受三氯森抑制.遗传学研究表明,Xccfab V是必需基因,不能获得Xccfab V基因敲除突变株.将携带大肠杆菌fab I的外源质粒导入野生菌后,可敲除染色体上的fab V基因,获得的替换突变株生长特性和脂肪酸组成未发生显著变化,但替换突变株对三氯森敏感.上述结果证实,野油菜黄单胞菌fab V是必需基因,编码烯脂酰ACP还原酶,参与脂肪酸从头合成反应,且Fab V是Xcc对三氯森耐受的根本原因.     

野油莱黄单胞菌两个γPON基因的突变和功能分析

广西大学生命科学与技术学院李恒聪、蒋瑞萍、姜伯乐与唐纪良(广西亚热带生物资源保护利用重点实验室)等5位科研工作者看到细菌的σ54(γPON)是一类可选择性识别启动子序列的σ因子,参与环境适应、细胞生理过程等,如氮代谢、鞭毛和菌毛的生物合成,在一些病原菌中,σ54还与致病性密切有关。为了明确σ54在野油菜黄单胞菌野油菜病变种(Xcc)中是否参与致病过程,用同源单交换定点突变方法,将Xcc 8004中的两个σ54编码基因γPON1(XC1256)和γPON2(XC2168)做单突变及双突变。其突变体表型分析结果表明:单个和同时突     

假定蛋白基因XC2038与十字花科黑腐病菌致病相关

十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是研究植物病原细菌和寄主互作的模式细菌,鉴定其致病相关基因对于控制作物病害有重要的意义。XC2038在Xcc 8004中注释为功能未知的假定蛋白基因。本研究利用实验室前期构建的XC2038基因的Tn5gus A5插入突变体164H09,并构建了该突变体的互补菌株C164H09,随后对各菌株的致病性及相关表型进行了检测。结果表明,164H09影响Xcc 8004胞外多糖、泳动性及生物被膜的形成,影响在寄主满身红萝卜上的致病性,而突变体的互补菌株能将以上表型恢复至野生型水平。综上可知,假定蛋白基因XC2038与十字花科黑腐病菌致病相关。     

十字花科黑腐病菌中一个与抗逆有关的小RNA的鉴定

十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pathovar campestris,Xcc),是引起十字花科植物黑腐病的病原菌。Xcc要经历寄生、腐生等多种环境变化,为适应这些环境变化,需要调控相应基因的表达。除蛋白外,小RNA在基因表达调控中也起到关键作用。本实验室前期实验从Xcc 8004中鉴定出数百个小RNA,但是绝大多数小RNA的功能仍然未知。本研究通过构建一个小RNA(sRNA3843)的过量表达株来研究其生物学功能。确定该小RNA过量表达后,对其过量表达株OE3843进行了一系列的表型检测。结果发现,s RNA3843过量表达株OE3843对金属离子Cu^2+、Zn^2+、Cd^2+及蛋白变性剂SDS的耐受能力明显下降,表明s RNA3843与Xcc的抗逆有关。本研究的实验结果为深入研究小RNA在Xcc抗逆中所起的作用及其作用机理打下基础。     

hxc2, an Arabidopsis mutant with an altered hypersensitive response to Xanthomonas campestris pv. campestris

A chemical mutagenized population of Arabidopsis Col-0-gl plants was screened for an altered hypersensitive response (HR) after spray inoculation with an HR-inducing isolate of Xanthomonas campestris pv. campestris (strain 147). Three classes of mutant were identified: those exhibiting an HR- phenotype or partial loss of HR; hyper-responsive mutants showing necrotic lesions rapidly leading to the collapse of leaves; and susceptible mutants. One mutant belonging to the susceptible class, hxc-2, was extensively characterized. The compatible phenotype observed several days after initiation of the interaction was confirmed by measurement of in planta bacterial growth and use of bacterial strains constitutively expressing the GUS reporter gene. In the same way, accumulation of autofluorescent compounds, salicylic acid production and defence gene expression in the mutant were found to be similar to that displayed by the susceptible ecotype. Inoculation of hxc-2 with different avirulent bacteria suggests that the mutation is specific for the interaction with the Xcc 147 strain, although the mutation has been shown to affect a single dominant locus, different from the resistance locus defined by genetic analysis of resistance to Xcc 147. Genetic mapping of the mutation indicated that it is located on chromosome III, defining a previously unknown resistance function in response to X. c. campestris.     

Construction of a single-transposon-insertion mutant in Rhizobium sp. strain TAL1145 from a double-insertion mutant

A method for developing a single-transposon-insertion mutant from a double-insertion mutant in Rhizobium is described. An exopolysaccharide (EPS)-defective mutant containing two Tn 5-lacZ insertions was complemented with cloned wild-type DNA for EPS synthesis. One of the Tn 5-lacZ insertions from the mutant was transferred to the complementing plasmid by homologous recombination. The plasmid containing the Tn 5-lacZ insertion in the gene involved in EPS synthesis was transferred into the wild-type strain and the Tn 5-lacZ was homogenized to obtain an EPS-defective mutant with a single Tn 5-lacZ insertion.     

野油菜黄单胞菌8004甘天丝亮特征序列酯酶及其酯酶结构域在大肠杆菌中的表达，包涵体复性及性质

【目的】了解野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris pv. campestris）8004 GDSL(蛋白序列中甘氨酸、天冬氨酸、丝氨酸和亮氨酸特征序列)酯酶的性质。【方法】利用PCR方法扩增Xcc_est及其不同结构域的基因,这些基因以组氨酸标签融合蛋白的形式在大肠杆菌中获得表达。融合蛋白通过镍亲和色谱纯化。【结果】部分纯化的Xcc_est 在催化对硝基苯丁酸酯时,最适pH值为8.0,最适温度为52 °C。 Xcc_est 对于对硝基苯丁酸酯的Km值和Vmax值分别是47.6 ± 4.6 μmol/L, 和67.6 ± 7.8 U/mg,Xcc_est的酯酶结构域(Xcc_estN1-334)对于同一底物的Km值和Vmax值分别是 469.4 ± 9.8 μmol/L和2.5 ±0.9 U/mg。Xcc_est的成熟结构域(Xcc_estN26-606)可以获得成功复性,但是成熟酯酶结构域(Xcc_estN26-334)不能获得复性。复性后的Xcc_estN26-606底物谱较广,在室温下具有较高稳定性。【结论】复性的成熟结构域蛋白(Xcc_estN26-606)具有一定的生物转化应用前景。