铜金属螯合载体固定糖化酶

[目的]制备出含Cu2+的琼脂糖-IDA螯合载体及对其固定糖化酶工艺条件进行优化.[方法]利用金属螯合配体(IDA-Cu2+)与蛋白质表面供电子氨基酸相互作用的原理制备载体,采用紫外分光光度法测定不同影响因素下固定化糖化酶的酶活.[结果]Cu2+的加入量和固定化过程的酸度比给酶量对固定化糖化酶的活性影响还要大,在给酶量80 mg/g载体、1.0× 10-2 mol Cu2+/g载体、pH 4.6和固定化4h的固定化条件下,固定化酶活为252.1 U/g,重复使用5次后酶活为首次固定化酶活的65.1％.[结论]该Cu2+-IDA-金属螯合琼脂糖可用于淀粉水解糖化酶的优良固定化载体材料.     

环氧交联剂和氨基载体固定化海洋假丝酵母脂肪酶*

游离酶经过固定化后,稳定性和环境耐受性得到提高,在食品、医药、化工、环境和皮革等领域可以很好的提高酶的利用率并降低生产成本,具有极大的应用潜力。新型交联剂在固定化酶工艺的应用极大推进了固定化酶研究的深入。借助新型交联剂聚乙二醇二缩水甘油醚(PEGDGE),利用氨基载体LX-1000HA固定化海洋假丝酵母脂肪酶,结合单因素和正交试验优化得到交联及固定化条件为:交联温度30℃,交联2h,交联剂浓度0.75%,pH7.0,加酶量800U,载体量0.5g,固定化2h,固定化温度45℃。根据上述最佳固定化工艺,制备得到固定化酶LX-1000HA-PEGDGE-CRL在最适条件下测得酶活达到160.81U/g,约为此前制备的固定化酶LX-1000HA-GA-CRL(由LX-1000HA和戊二醛交联脂肪酶得到)和LX-1000EA-PEGDGE-CRL(由短链氨基载体LX-1000EA和PEGDGE交联脂肪酶得到)酶活的2倍,发现固定化酶LX-1000HA-PEGDGE-CRL的最适反应温度相比于游离酶提高15℃;在70℃的环境中3h后酶活仍存留70%;循环使用6次后残留65%左右的酶活;酸碱耐受性和储存稳定性也表现良好,4℃保存30天后剩余约70%的初始酶活。同时,将制备的固定化酶LX-1000HA-PEGDGE-CRL与游离酶、固定化酶LX-1000HA-GA-CRL、固定化酶LX-1000EA-PEGDGE-CRL进行了比较,发现固定化酶LX-1000HA-PEGDGE-CRL在温度耐受性和重复使用性等方面具有更好的使用效果。     

环氧树脂固定化L-谷氨酸氧化酶

通过环氧树脂作为载体对经(NH4)2SO4盐析处理后的L-谷氨酸氧化酶(LGOX)进行固定化,优化固定化工艺条件,并利用固定化LGOX转化产α-酮戊二酸(α-KG)。结果表明:饱和度45%的(NH4)2SO4为最佳盐析浓度;当选用环氧树脂ES-105作为固定化载体、树脂加量为20 m L酶液(14 U/m L)加入3.5 g载体、固定化K3PO4缓冲液浓度为0.2 mol/L(p H 7.0)、固定化温度25℃、固定化时间24 h时,固定化LGOX酶活力最高,其酶活回收率为85.9%,比酶活55.7 U/g。利用该固定化酶转化L-谷氨酸产α-KG,当谷氨酸钠质量浓度为100 g/L,反应20 h,产物收率达98.2%。固定化酶重复使用14批次后,产物收率仍有90%以上;重复使用20批,收率有83.2%。因此,该固定化酶具有具良好的操作稳定性。     

交联壳聚糖微球固定化β-葡萄糖苷酶工艺研究

目的:以戊二醛交联壳聚糖微球为载体,通过共价连接反应固定化β-葡萄糖苷酶.方法:以固定化酶比活和酶活回收率为目标,采用单因素方法优化固定化工艺、微球制备条件.结果:微球最佳制备条件:2.5%壳聚糖,2%乙酸,7.5%氢氧化钠,氢氧化钠:乙醇(v/v)=1:1.最佳固定化工艺为:0.1g壳聚糖微球在20mL 3%戊二醛溶液中50℃交联2h.加酶量为7 388mU/g干球,25℃吸附24h.固定化酶比活为6 188mU/g干球,酶活回收率为95.4%.结论:交联壳聚糖微球共价连接法可有效固定化β-葡萄糖苷酶.     

聚乙二醇二缩水甘油醚交联氨基载体LX-1000EA固定化脂肪酶 *

聚乙二醇二缩水甘油醚(PEGDGE)作为双功能环氧试剂,在实验中被用于交联氨基载体LX-1000EA共价固定化海洋脂肪酶,经过处理后的载体共价固定化脂肪酶具有良好的效果。实验经过单因素初筛和正交试验,得到最佳的交联及固定化条件为0.75%交联剂浓度、交联温度35℃、交联时间3h、载体量1.25g、pH9.0、固定化温度55℃、固定化时间1h。对LX-1000EA-PEGDGE固定化酶与游离酶、戊二醛(GA)交联LX-1000HA-GA的固定化酶进行酶学性质的比较,发现LX-1000EA- PEGDGE固定化酶较游离酶最适反应温度未改变,与LX-1000HA-GA相同的是最适反应pH都由7.0提高为8.0。在最适条件中所测LX-1000EA-PEGDGE酶活达到78.84U/g,固定化改变了游离酶的酸碱耐受性,热稳定性和操作稳定性较游离酶和LX-1000HA-GA固定化酶均有提高。LX-1000EA-PEGDGE的热稳定表现优异,在60℃孵育3h后保留90%酶活;使用5次后仍能残余50%酶活;保存30天酶活仍保留60%。首次使用新型双环氧交联剂PEGDGE交联有机氨基载体共价结合固定化脂肪酶,为更有效的固定化方法提供了技术支持,同时也发现交联剂对固定化酶的性质存在较大影响。     

氨基树脂固定化L-苏氨酸醛缩酶及其应用*

L-苏氨酸醛缩酶(L-Threonine aldolase,L-TA)可以催化甘氨酸和醛合成β-羟基-α-氨基酸。β-羟基-α-氨基酸具有两个手性中心,是多种手性药物的中间体。但是,游离的L-TA难以重复利用,分离纯化困难,严重阻碍了工业化应用。固定化技术可以有效解决这些问题。利用氨基树脂NAA固定化来源于Bacillus nealsonii的L-苏氨酸醛缩酶,采用戊二醛作为交联剂,经过条件优化确定最佳固定化条件为:加酶量13 U、载体量0.6 g、0.4%(V/V)戊二醛、活化时间2 h、pH 8.5、35℃、固定化5 h。在此条件下,固定化酶酶活回收率为85.7%。在30℃下半衰期可达59天,为游离酶的6.5倍。将其应用于合成L-syn-对甲砜基苯丝氨酸,使用460 h后,残余酶活为79.4%。进一步开发了载体再利用策略,将失活固定化酶表面的氨基用戊二醛活化后,再与新的游离酶进行固定化,实现载体的再利用。利用该方法载体可重复利用两次,制备的固定化酶仍能使用460 h。该方法大大降低了固定化成本,为固定化L-TA的工业化应用打下坚实的基础。     

海泡石吸附固定化猪胰脂肪酶

以海泡石作为猪胰脂肪酶(PPL)的固定化载体,考察采用物理吸附的方法制备固定化脂肪酶的条件。结果表明:在固载时间4 h、反应磷酸盐(PBS)溶液pH 6.0、反应温度25℃时,可达最大比酶活309 U/g,固定化酶的化学稳定性和热稳定性均较高。同时利用红外谱仪(FT-IR)和扫描电子显微镜(SEM)的分析手段对固定化猪胰脂肪酶试样进行分析,进一步确定了海泡石材料在固定化酶中的作用。     

聚乙二醇二缩水甘油醚交联氨基载体LX-1000EA固定化脂肪酶

聚乙二醇二缩水甘油醚(PEGDGE)作为双功能环氧试剂,在实验中被用于交联氨基载体LX-1000EA共价固定化海洋脂肪酶,经过处理后的载体共价固定化脂肪酶具有良好的效果。实验经过单因素初筛和正交试验,得到最佳的交联及固定化条件为0. 75%交联剂浓度、交联温度35℃、交联时间3h、载体量1. 25g、pH9. 0、固定化温度55℃、固定化时间1h。对LX-1000EAPEGDGE固定化酶与游离酶、戊二醛(GA)交联LX-1000HA-GA的固定化酶进行酶学性质的比较,发现LX-1000EA-PEGDGE固定化酶较游离酶最适反应温度未改变,与LX-1000HA-GA相同的是最适反应pH都由7. 0提高为8. 0。在最适条件中所测LX-1000EA-PEGDGE酶活达到78. 84U/g,固定化改变了游离酶的酸碱耐受性,热稳定性和操作稳定性较游离酶和LX-1000HA-GA固定化酶均有提高。LX-1000EA-PEGDGE的热稳定表现优异,在60℃孵育3h后保留90%酶活;使用5次后仍能残余50%酶活;保存30天酶活仍保留60%。首次使用新型双环氧交联剂PEGDGE交联有机氨基载体共价结合固定化脂肪酶,为更有效的固定化方法提供了技术支持,同时也发现交联剂对固定化酶的性质存在较大影响。     

纳米银复合介孔碳材料制备固定化猪胰脂肪酶

以稻壳为原料制备介孔碳材料,对其表面进行纳米银修饰后作为猪胰脂肪酶(PPL)的固定化载体.初步研究并优化该载体固定猪胰脂肪酶的条件.结果表明:在AgNO3浓度为0.01 mol/L、固载时间6h、反应磷酸盐溶液pH为6.0、反应温度25℃时,可达最大酶活,酶活提高3.2倍.同时利用红外图谱(FT-IR)、N2等温吸附-脱附曲线(BET)和扫描电子显微镜(SEM)的分析手段对固定化猪胰脂肪酶试样进行分析,进一步确定了纳米银复合介孔性碳材料在固定化酶实验中的作用.     

树脂载体固定S-腺苷甲硫氨酸合成酶的研究

目的:筛选一种适合S-腺苷甲硫氨酸合成酶固定化的树脂载体,进行固定化工艺优化及固定化酶性质研究。方法:以固定化率和表观酶活回收率为指标,筛选固定化效果最佳的一种树脂,采用单因素实验对固定化条件进行优化。结果:阴离子交换树脂载体ESR-2表现出最优的固定化率(94.03%)和酶活回收率(47.45%);最佳固定化条件为加酶量4U/g、pH 8.0、15℃吸附10h,最佳条件下固定化酶表观酶活为2.1U/g,表观酶活回收率达51.6%。固定化酶的最适pH为8.5,最适温度为35℃,连续反应10批次后酶活剩余77.92%。结论:树脂载体ESR-2固定化S-腺苷甲硫氨酸合成酶酶活及稳定性较好,能够用于S-腺苷甲硫氨酸的工业化大规模生产。     

N-乙酰神经氨酸醛缩酶的固定化及固定化酶性质研究

使用LX-1000HFA氨基树脂对N-乙酰神经氨酸醛缩酶(NAL)进行固定化,并对游离酶与固定化酶的酶学性质及稳定性进行了对比研究。结果显示,最佳固定化条件为载体投放量5.0 g,固定化时间12 h,缓冲液浓度1.0 mol/L,pH7.5,温度25℃。在此条件下制备的固定化NAL活力最高,比酶活可达200 U/g湿载体。与游离酶相比,最适反应温度提高了5℃,最适反应pH没有变化,温度和pH耐受性明显提升。同时固定化酶储存稳定性和操作稳定性也显著增强,在4℃条件下储存10 d后其酶活仅损失6%,重复使用10次后仍保持初始酶活的80%。因此,该固定化酶具有良好的温度稳定性、pH稳定性、储存稳定性和操作稳定性,为酶法工业化生产N-乙酰神经氨酸研究提供了理论依据。     

壳聚糖固定化真菌漆酶及其用于处理酚类污染物的研究

Trametessp. AH282在液体培养条件下经邻甲苯胺诱导能有效合成漆酶同工酶A。以壳聚糖为载体,戊二醛为交联剂进行了漆酶A的固定化研究,确定酶固定化适宜条件为：0.1g壳聚糖与15 mL 5%戊二醛交联8 h后,加入30.0U酶固定12h。在此条件下获得的固定化漆酶催化能力为176.4U/g载体,酶活回收率58.5%。与游离酶相比,固定化漆酶与作用底物愈创木酚的亲和力降低,但固定化酶的稳定性有明显改善。固定化漆酶的最适温度为55℃,比游离酶提高5℃;70℃条件下保温8 h,固定化酶保留酶活56.5%,而在相同条件下游离酶酶活明显下降。使用固定化漆酶反应装置进行酚类化合物转化实验,连续进行12批次操作,固定化酶酶活仍保持60%以上,漆酶使用效率明显提高。     

乙二醇缩水甘油醚交联海藻酸钠-羧甲基纤维素钠固定化脂肪酶

以海藻酸钠、羧甲基纤维素钠(CMC)为载体,分别以乙二醇缩水甘油醚(EGDE)和戊二醛为交联剂,采用包埋交联法对脂肪酶进行固定化,结果显示EGDE的交联效果要优于戊二醛,添加EGDE的固定化酶酶活最好。得到制备固定化酶的最优方案为海藻酸钠2.5%,CMC浓度1.5%,给酶量800U/ml复配载体,氯化钙5%,以0.02%的EGDE交联固定30min,由此制备得到酶活约为380 U/g的固定化酶,酶活收率约为50.09%。固定化酶的最适反应p H为8.5,比游离酶增大0.5个单位;最适反应温度是45℃,比游离酶提高5℃;耐热性能变好,且重复使用7次后仍能保持60%左右的相对酶酶活。     

磁珠固定化结核分枝杆菌二氢叶酸还原酶及其表征

比较Ni~(2+)-NTA磁珠和羧基磁珠固定结核分枝杆菌二氢叶酸还原酶(Mycobacteriumtuberculosis dihydrofolate reductase,Mt DHFR),探索适合小分子配体混合物库筛选的Mt DHFR固定化方法。重组表达带6×His标签Mt DHFR,纯化后表征酶学性质,比较用Ni~(2+)-NTA磁珠和羧基磁珠固定化时相应固定化容量、保留活性、稳定性及对抑制剂响应。结果表明,Ni~(2+)-NTA磁珠对Mt DHFR固定化容量为(93±12)mg/g磁珠(n=3),但酶比活保留不超过32%,Ni~(2+)明显抑制酶活性,EDTA与Ni~(2+)呈协同抑制效应,Fe~(3+)无显著干扰。羧基磁珠活化固定Mt DHFR的容量(8.6±0.6) mg/g磁珠(n=3),固定化酶比活保留(87±4)%(n=3)。在含50 mmol/L KCl的100 mmol/L HEPES (pH 7.0)中,游离和固定化Mt DHFR在0℃保存16 h活性都无显著改变,但在25℃保存16 h,游离酶活性下降近60%而羧基磁珠固定化Mt DHFR活性下降仅35%。甲氨喋呤对游离Mt DHFR和固定化Mt DHFR的IC50无显著差异(P0.05)。综上,Ni~(2+)-NTA磁珠不适合固定化Mt DHFR;羧基磁珠固定化Mt DHFR能保留活性、热稳定性及对抑制剂的响应,该固定化方法有望用于快速筛选其配体混合物库。     

以环氧乙烷为活性基的多孔颗粒状固定化青霉素酰化酶的制备*

报道了用以环氧乙烷为活性基的多孔颗粒状载体 (Eupergit C)制备固定由巨大芽孢杆菌 (^{B .megaterium})产生的青霉素酰化酶的研究。用己二胺 ,赖氨酸对载体进行化学修饰后制备固定化酶 ,获得了较好的固定结果。用未修饰的载体制备固定化酶 ,经 2 4h固定反应 ,酶活力达 1 76.5IU/g (wet) ,酶活力总收率达 53.7%,酶蛋白的固定量为 197mg/g(dry) ,酶蛋白的固定效率达 87.5 %。游离酶的酶浓度对制备固定化酶的活力无显著影响。当加酶量从     

海藻酸钠固定化重组川芎咖啡酸-3-O-甲基转移酶

利用IPTG诱导含有川芎咖啡酸-3-O-甲基转移酶(LCCOMT)的大肠杆菌工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-LCCOMT,经Ni~(2+)亲和层析、质谱鉴定获得纯化的LCCOMT。采用海藻酸钙凝胶包埋固定LCCOMT,单因素实验考察最佳固定化条件对固定化酶活力的影响,并确定了固定化酶的最适温度、pH值、Km、Vmax与反应批次等酶学性质。确定的条件分别为海藻酸钠质量分数1.5%,CaCl_2浓度2.5 g/L,固定化时间2 h,载体与酶质量比40 000∶1。通过正交实验确定最终固定化条件为CaCl_2浓度2.5 g/L,海藻酸钠质量分数2.0%,固定化时间1 h,载体与酶质量分数35 000∶1时,固定化效果最好,此时相对酶活力为75.43%。固定化酶的最适催化温度为37℃、最适pH值为7.5,较游离酶分别增加0℃和0.5;Km、Vmax分别增高0.40和0.74;实验确定固定化酶的半衰期,连续使用6次,酶活力仍保留50%。     

D-泛解酸内酯水解酶的固定化及酶学性质

为有效提高D-泛解酸内酯水解酶的利用效率,笔者选择合适的载体对酶进行固定化,在优化固定化条件的同时研究固定化酶的最佳反应条件和酶学性质。结果表明,选择的最佳固定化载体为树脂D380,最佳固定化条件为:酶的吸附添加量为30 U(以1 g湿树脂计),吸附pH 7.0,吸附温度30℃,吸附时间5 h,戊二醛体积分数0.1%,交联时间1 h。在最优条件下得到的固定化酶的比酶活为(11.5±0.12) U/g。固定化酶的最适反应温度为37℃,最适反应pH为7.5。游离酶和固定化酶的动力学常数K_m分别为170.25和207.60 mmol/L。Ca~(2+)对酶促反应有激活作用,Mn~(2+)对该酶有较强的抑制作用。     

“构象记忆”的辣根过氧化物酶的微水相共价固定化

本研究利用酶在微水溶剂中的"构象记忆"特性,以壳聚糖微球为载体,以辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)为研究对象,将HRP于活性构象下冻干"固定"后,在二氧六环:水=99:1(V/V)微水介质中与载体进行共价交联,同时与传统水介质中共价交联固定化的HRP进行比较。结果发现,两种介质中固定化HRP的最适温度都提高到60°C,最适pH均为6.5,而微水相中固定的酶活力损失较低,酶活比传统水相中固定的酶高6倍以上;70°C保温30min后,微水相中固定的酶保留75.42%的活力,而水相中固定的HRP仅存15.4%的活力;微水相中固定的HRP具有更好的操作稳定性和热稳定性,60°C下连续操作5次之后,微水相固定的HRP保留77.69%的酶活,而水相固定的HRP仅存16.67%的酶活;微水相中固定的HRP在苯酚的去除中表现得更具优势;微水相中共价交联制备的CS-HRP-SWCNTs/Au酶修饰电极对H2O2的响应信号比水相中共价固定的酶电极强2.5倍,灵敏度更高。本研究表明利用酶的"构象记忆"在微水介质中进行共价交联是固定化酶的一种可行方法,所制备的固定化酶具有更优良的性质。     

氨基化细菌纤维素载体的制备及其固定β-半乳糖苷酶

利用二氯亚砜和乙二胺对细菌纤维素薄膜进行氯化和氨基化制备氨基化细菌纤维素薄膜,并以该薄膜作为载体固定β-半乳糖苷酶,研究载体的结构性质和固定化酶的制备条件及相关酶学性质。通过元素分析、红外光谱和X线光电子能谱等分析方法来表征载体性质。结果显示,有大量氨基接入细菌纤维素表面。最佳的固定化酶的条件:戊二醛添加量4 g/L,固定化时间3 h,酶添加量3 mg/m L,p H7.0和交联时间90 min,此条件下,最高酶活回收率为78.4%,吸附酶量为63.1 mg/g。与游离酶相比,固定化酶的最适温度为40℃,比游离酶高10℃,最适p H提高0.5,有向碱性方向移动的趋势,重复使用7次后剩余77.8%的相对酶活力。     

氨基载体共价结合固定化海洋假丝酵母脂肪酶

共价结合法是重要的工业酶固定化方法,利用稳定的共价键固定化工业酶,在载体和酶间形成多点共价连接,可以制备稳定性较好的固定化酶,更具有实际应用价值。利用氨基载体共价结合固定化海洋假丝酵母脂肪酶,采用较为廉价的戊二醛进行辅助交联,通过单因素和正交试验,确定最佳固定化条件为:25℃、pH5. 0、0. 1%戊二醛、0. 25g载体、交联0. 5h、固定化1h、加酶量为800U,最终得到的固定化酶酶活达到83. 01U/g。固定化脂肪酶的最适pH较游离酶向碱性方向偏移,最适反应温度提高10℃,固定化酶的热稳定性和酸碱稳定性比游离酶好且重复使用性和储存稳定性明显优于游离酶。同时发现交联剂是制备固定化脂肪酶的重要因素,因此探索新型交联剂对于固定化效果的提高具有重要意义,为海洋假丝酵母脂肪酶的固定化工艺技术和工业应用奠定了良好基础。