扩张柱床吸附层析回收纯化灌流培养生产的单克隆抗体

用扩张柱床吸附层析技术,一步回收纯化连续灌流培养的单克隆抗体。用Streamline SP阳离子交换介质在固定床柱XK16/20上进行条件摸索,扩张床柱Streamline25和50分别用于小规模条件优化和中试规模放大。培养液中的低浓度单抗经此步处理,浓缩10倍以上,纯度提高5～7倍,回收率＞90%,制备周期比固定柱床层析缩短一半以上。 根据培养液中单抗浓度的不同,一次处理量为18～50L,纯化规模由实验室水平（400mg）扩大至中试水平（2g）,生产成本和工艺复杂性大为降低。应用扩张柱床吸附层析技术,建立单克隆抗体回收纯化工艺,具有经济、简便、高效实用和良好的可放大性。     

连续流层析技术在亲和层析中的应用及生产放大评估

生物制药行业迅速发展,尤其是上游表达量的增加和规模的扩大,促使上游培养采用连续灌流方式,同时也推动了下游纯化生产工艺相应的采取连续纯化策略。以灌流培养的Fc融合蛋白为例,采用 BioSMB PD设备,对比了下游工艺亲和层析捕获步骤中单柱批次纯化和连续流层析纯化的样品纯度和收率,并在此基础上进行小试工艺放大和生产实际用量成本计算评估。连续流层析实现了上游灌流培养与下游亲和层析连续化的可行性,工艺稳定,回收率与批次纯化接近,但相比批次纯化,生产效率明显提高,填料载量提高,同时填料使用效率提高,生产成本显著降低。     

正辛酸沉淀在单克隆抗体纯化中的工艺优化与应用

为应对治疗性抗体快速增长的市场需求,抗体上游细胞培养规模和表达量水平已显著提高,而下游纯化工艺的生产效率则相对落后,下游处理能力已成为限制抗体产能的瓶颈。本研究以单克隆抗体mab-X为实验材料,优化了细胞培养液、低pH病毒灭活收集液2种模式的正辛酸(caprylic acid,CA)沉淀工艺条件,并研究了CA处理去除聚体、CA处理灭活病毒等2种应用,在小试的基础上,采用低pH病毒灭活收集液CA沉淀的模式进行了500 L细胞培养规模生产放大研究,对沉淀前后的产品质量和收率进行了检测和对比。结果显示,两种模式的CA沉淀均可显著降低宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)残留和聚体含量,在聚体去除实验中CA沉淀可去除约15%的聚体,病毒灭活研究显示CA对逆转录模型病毒具有完全的病毒灭活能力。在放大生产规模中,下游依次进行了深层过滤收获、亲和层析、低pH病毒灭活、CA沉淀及深层过滤、阳离子交换层析,CA沉淀过程中混合时间和搅拌速度显著影响CA沉淀效果,CA沉淀处理后低pH病毒灭活液中的HCP残留量降低了895倍,沉淀后产品纯度和HCP残留均已控制在单克隆抗体质量要求范围内,CA沉淀可以减少传统纯化工艺中的一个精纯步骤。总之,下游工艺中采用CA沉淀,能够精简传统纯化工艺,并完全满足mab-X的纯化质量要求,而且能提高生产效率、降低生产成本。本研究结果将推动CA沉淀在单克隆抗体下游纯化生产中的应用,为解决目前传统纯化工艺的问题提供参考。     

hGH单克隆抗体的筛选及双抗体夹心ELISA检测方法的建立

采用杂交瘤法制备单克隆抗体,并用辛酸-硫酸铵法纯化单抗,通过ELISA方法和Western blotting测定抗体的效价与特异性,并进行抗体类型、相对亲和力测定;应用纯化的单抗建立hGH双抗体夹心ELISA检测方法。筛选出两株可以稳定分泌抗hGH单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为3E11、2G9,抗体类型均为IgG1,抗体滴度均可达10-10,特异性好,相对亲和力高,以筛选到的两株单抗建立的双抗夹心ELISA法线性范围为0.09～1.5625ng/mL,R2>0.9,灵敏度为0.09ng/mL。筛选出高效抗hGH的单抗,并建立了hGH双抗体夹心ELISA检测方法。     

会议报道

中国生物工程学会8月将举行学术年会暨生物反应器研讨会;第十一届国际植物组织培养和生物技术大会将在北京举行;复旦大学与中科院等单位将举办首届国际计算系统生物学研讨会;“生物质产业与广西发展”学术报告会在南宁举行;蛋白质产品分离纯化与单抗生产技术研讨班在北京举办;单克隆抗体下游纯化技术会议将在上海举办。     

姜老师信箱

蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我在蛋白质分离纯化方面有两个问题想向您请教:1、工厂规模化生产蛋白(分子量约为15kDa),除了采用各种层析方式外,一般还可以用什么方法来对蛋白质进行浓缩?与实验室规模的蛋白纯化相比是否有不同之处?     

强啡肽单抗融合蛋白的克隆、表达及功能分析

G蛋白偶联受体(GPCR)长期以来是最重要的药物靶点家族,小分子药物层出不穷。然而受研发难度的限制,针对GPCR的抗体或大分子类药物屈指可数。我们利用选择性靶向κ阿片受体(KOR)且无法激活下游信号的单克隆抗体连接强啡肽(Dynorphin)基因、HEK 293F系统进行表达,纯化获得KOR强啡肽单抗融合蛋白,我们将此融合蛋白命名为APF(antibody-peptide fusion)。结果显示,获得的单抗融合蛋白二级结构未显著改变,保持了Dynorphin活性,可激活KOR相关下游蛋白(Gi)活性,调动β-arrestin信号。结果证明,基因层面实现抗体药物改构的可行性,该法可指导新一代抗体偶联药物的改造,为以GPCR为靶点的大分子药物开发提供了新的空间。     

人vasorin蛋白胞外结构域单克隆抗体的纯化及应用

目的:纯化人vasorin(VASN)蛋白胞外结构域的单克隆抗体并鉴定。方法:用表达人VASN蛋白胞外结构域单克隆抗体的杂交瘤细胞免疫小鼠,收集腹水,纯化抗体;ELISA检测单抗的特异性和亲和力,Western印迹、免疫共沉淀、细胞免疫荧光等实验检测单抗的特异性与可能的用途。结果:纯化获得2株抗VASN胞外结构域单抗V20和V21,ELISA结果显示二者均特异性强、亲和力高;Western印迹显示2株单抗均可结合Hep G2细胞中的VASN蛋白,以V20为佳;免疫共沉淀实验结果显示V21能够钓取Hep G2细胞中的VASN蛋白及细胞培养上清中的分泌型VASN;免疫荧光实验结果显示V21能与Hep G2细胞的VASN蛋白结合。结论:纯化获得2株抗人VASN胞外结构域单抗,为进一步研究VASN蛋白的生物学功能提供了实验工具。     

抗人表皮生长因子受体单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

 用人上皮癌细胞系A 431细胞作为抗原免疫BalB/c小鼠,制备七株抗人表皮生长因子受体的单克隆抗体的杂交瘤,这些杂交瘤经三次亚克隆后仍能稳定地分泌单克隆抗体。对其中四株杂交瘤分泌的单克隆抗体进行了鉴定。免疫沉淀放射自显影结果示单克隆抗体3、101和176均可识别A 431细胞膜抗原MW为170000的蛋白质即EGF受体。单克隆抗体59可以识别低分化鼻咽癌细胞膜上EGF受体。单抗3、176和59等可抑制EGF与受体的特异结合,而101和94则不能抑制EGF与受体的结合。 用Protein-A Sepharose CL4B纯化了单抗,纯化的单抗主要为IgG_1亚类。用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳对纯化的单抗进行了纯度测定。     

两步串联层析法纯化鼠抗人CD80单克隆抗体4E5

采用阴离子交换与凝胶过滤两步串联层析法,纯化了小鼠腹水来源的CD80阻断型单克隆抗体4E5。腹水样品经离心、过滤预处理后,在Tris-HCl缓冲溶液(pH8.0, 50mmol/L)条件下上阴离子交换柱对目的单抗进行捕集,采用0-0.5 mol/L NaCl浓度分步洗脱;含目的单抗的洗脱馏分再上凝胶过滤柱纯化,用PB缓冲溶液（pH7.2, 20mmol/L）洗脱,获得目的单抗4E5,其生物学活性高、纯度大于95%,抗体总回收率达61%。     

Bed bug deterrence

A recent study in BMC Biology has determined that the immature stage of the bed bug (the nymph) signals its reproductive status to adult males using pheromones and thus avoids the trauma associated with copulation in this species. The success of this nymphal strategy of deterrence is instructive. Against the background of increasing problems with bed bugs, this research raises the question whether pheromones might be used to control them.