团头鲂MSTN基因cDNA结构、表达及过表达对胚胎发育的影响

研究通过cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆得到团头鲂生长抑制素(MSTN)基因的cDNA全长并分析了MSTN基因在团头鲂胚胎、成鱼组织中表达以及MSTN基因在胚胎中过表达情况。结果表明团头鲂MSTN基因的cDNA全长为2187 bp, ORF(开放阅读框)大小为1128 bp, 编码376个氨基酸。组织逆转录PCR (RT-PCR)结果显示, MSTN基因在肌肉、脑和精巢组织中大量表达, 肝脏、脾脏和卵巢组织中的少量表达, 肠、腮、心、眼和肾组织中的微量表达。胚胎逆转录PCR (RT-PCR)结果显示, 在0—44 hpf胚胎发育阶段, MSTN基因表达量较低; 而在48—52 hpf胚胎发育阶段, MSTN基因表达量逐渐升高。整胚原位杂交(WISH)结果显示, 胚胎发育的16 hpf时期MSTN基因主要在脊索中表达, 胚胎发育的28 hpf和55 hpf时期MSTN基因在脑中表达。MSTN基因过表达结果显示, 胚胎在体节发生期出现前-后轴拉长, 背-腹轴变短; 脊索发生扭曲, 强烈抑制体节发育而导致不分化等现象。研究为后续团头鲂MSTN基因的功能研究及团头鲂分子育种提供相关参考依据。     

硬骨鱼类血红蛋白转换表达的新模式——以黄河裸裂尻鱼胚胎型血红蛋白研究为例

为了探讨高原硬骨鱼类胚胎型血红蛋白的转换表达模式, 研究利用转录组数据和克隆方法研究了黄河裸裂尻鱼(Schizopygopsis pylzovi)胚胎型血红蛋白的组成和基因结构, 并通过qRT-PCR和整胚原位杂交方法确定了胚胎发育过程中血红蛋白基因的表达情况。结果表明, 黄河裸裂尻鱼胚胎型血红蛋白基因由hbae1、hbae4、hbbe1和hbbe3组成, 均包含3个外显子和2个内含子, 其中hbbe1/hbae1以“头对头”(3′-5′—5′-3′)转录方式串联在一起, hbbe3/hbae4则以“尾对尾”(5′-3′—3-5′)的转录方式串联在一起。进一步的研究初步判断hbae3、hbae5和hbbe2基因在裂腹鱼亚科鱼类进化过程中可能发生了丢失。qRT-PCR和整胚原位杂交结果均表明在早期胚胎发育过程中4个胚胎型血红蛋白基因的表达都是从受精后第5天(120 hpf)开始明显上升, 但是hbae4和hbbe3基因的高表达只维持在受精后第5天(120 hpf)至破膜期(216 hpf), 随后急剧下降, 而hbae1和hbbe1基因表达从破膜(216 hpf)开始急剧上升。研究揭示了硬骨鱼类一种全新的血红蛋白转换表达模式, 这可能与黄河裸裂尻鱼特殊的进化历程和高原环境的适应有关, 研究结果将为进一步深入研究硬鱼类血红蛋白的时序转换表达和环境适应机制奠定基础。     

斑马鱼胚胎发育过程中TGF-1基因的表达特征分析

为研究转化生长因子 (Transforming growth factor , TGF)1对斑马鱼胚胎发育的调控作用, 通过NCBI获得TGF-1基因序列, TGF-1 cDNA全长1571 bp, 编码377个氨基酸。系统进化树分析发现, TGF-蛋白按照不同的类型严格聚类, 斑马鱼TGF-1与其他鱼类的TGF-1聚集到一个分支, 在进化中非常保守。对斑马鱼胚胎进行RT-PCR和Real-Time PCR检测显示, TGF-1基因为母源表达基因, 在分节期之前的表达水平比较低, 而从咽囊期开始持续高水平的表达。胚胎整体原位杂交发现, TGF-1基因在斑马鱼24 hpf 胚胎中开始有特异信号出现, TGF-1基因的表达主要分布在腮弓、侧线原基、耳囊、嗅觉基板、心脏和前肾等处, 表明TGF-1基因可能参与斑马鱼胚胎免疫调节、循环系统发育和侧线形成。用低氧处理斑马鱼胚胎, 发现低氧处理24h后斑马鱼胚胎发育延迟。利用Real-Time PCR和胚胎整体原位杂交检测发现, 低氧处理后发育延迟的斑马鱼胚胎中TGF-1 mRNA表达量较常氧组显著降低。以上结果表明, TGF-1基因参与斑马鱼胚胎发育调控, 并且可能与低氧处理后斑马鱼胚胎发育延迟有关。研究结果将为深入研究斑马鱼TGF-1基因的功能奠定基础。       

斑马鱼akt3 基因的克隆及其表达图谱与过表达分析

采用RT-PCR 和RACE 相结合的方法, 克隆得到了斑马鱼的akt3/pkb 基因, 其cDNA 全长为2874 bp,编码479 个氨基酸。斑马鱼akt3 具有akt 家族成员间保守的PH 结构域、催化活性结构域和调节结构域以及两个保守的磷酸化位点Thr305 和Ser472。与已发表的人、大鼠、小鼠的akt3 氨基酸序列比较, 相似性分别为95.8%、94.7%和95.4%。对斑马鱼早期胚胎进行RT-PCR 检测显示, akt3 在0-4hpf(hours post fertilization)含量水平较高, 6hpf 到12hpf 降低至较低水平, 16hpf 后表达量开始逐渐上升, 60hpf 至96hpf 则稳定在较高水平。原位杂交结果表明: akt3 在2hpf 至96hpf 的胚胎中整体都有表达, 没有组织特异性。在成鱼中, 除鳃部外, akt3 在所检测的其他各组织器官中均有表达, 在脑部和卵巢表达量较高; 利用显微注射持续表达myr-akt3 mRNA 研究其功能充分性时结果显示, 过量表达斑马鱼akt3 mRNA 能使斑马鱼胚胎发育滞后且伴随着尾部短粗、体节模糊、尾末端膨大甚至严重缩短等不同程度畸形。而在斑马鱼myr-akt3 注射组发育至24hpf 时观察(以排除akt3 造成的发育延迟的影响), 发现注射过akt3 的斑马鱼胚胎的脑部厚度较对照组显著增大, 表明akt3 对斑马鱼胚胎脑部尺寸发育有影响。       

团头鲂foxO基因家族的序列特征及表达分析

为了研究鱼类foxO(Forkhead box O)基因的功能, 基于组学测序及PCR扩增获得了团头鲂(Megalobrama amblycephala)foxO家族7个基因, foxO1a/b、foxO3a/b、foxO4和foxO6a/b的编码序列, 分别为1965、1892、1929、1959、1878、1803和2157 bp。SMART结构域分析显示该家族基因属于典型的FoxO家族蛋白, 具有保守的Forkhead、FOXO_KIX_bdg和 FOXO-TAD结构域。系统进化分析显示, 团头鲂FoxO与其他鲤科鱼类的同源基因具有较高的相似性。基于qPCR分析显示7个基因在所检测的9个组织中均有表达, 但在各组织间存在表达差异, 其中foxO4在血液中表达量最高, foxO6a在肝脏中表达量最高, 而foxO6b在脑中表达量最高。在胚胎早期发育过程中, foxO1a和foxO1b、foxO3a和foxO3b、foxO6a和foxO6b的表达模式类似; 而foxO4在发育早期, 除了体节出现期、眼色素沉淀晚期、体节生成期和受精后10d表达量高外, 其他时期表达量都比较低。经急性低氧处理后, 团头鲂foxO家族基因的表达水平在所检测的大部分组织中呈现显著上调趋势, 尤其是在肌肉组织中。基于JASPAR分析显示foxO家族基因都包含有Hif-1α结合位点, 利用双荧光素酶报告系统对foxO1b启动子进行了验证, 发现该基因受到Hif-1α调控。这些结果说明foxO基因可能通过Hif-1α介导的途径在团头鲂低氧应激中发挥重要作用。     

Sema4d基因在斑马鱼早期发育过程中的表达

目的:研究sema(semaphorin)4d基因在斑马鱼早期发育过程中的表达.方法:提取斑马鱼胚胎的总RNA,制备地高辛标记的sema4d RNA反义探针,WISH(整胚胎原位杂交)研究sema4d在斑马鱼早期发育过程中的表达.结果:成功合成sema4d基因探针,获得sema4d基因在斑马鱼早期发育过程中的表达情况:sema4d在0.75 hpf(hours post fertilization)、1.0 hpf、1.5 hpf、12 hpf前普遍性表达;17 hpf开始至24 hpf在头部表达较多,在脊髓、肌肉、中间细胞群ICM(intermediate cell mass)区处有特异性表达区处有特异性表达;48 hpf在头部和躯干肌肉持续表达.结论:Sema4d在早期参与了造血的发生,在脑部,脊髓,肌肉的发育中可能起到了重要作用.     

草鱼干扰素调节因子IRF4亚家族的表达研究北大核心

[目的]了解草鱼干扰素调节因子(IRF)的功能,为研究鱼类天然免疫系统提供理论基础。[方法]利用RTPCR技术检测草鱼(Ctenopharyngodon idella)IRF4a、IRF4b、IRF4-like、IRF8和IRF9的早期胚胎表达、组织表达以及草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)体内诱导表达。[结果]胚胎表达结果显示IRF4a、IRF8和IRF9分别显著表达于0 hpf、0 hpf和30 hpf(P<0.05),IRF4b、IRF4-like表达变化不明显;组织表达结果显示IRF4a、IRF4b、IRF9在鳃中表达最高,IRF4-like、IRF8在脾脏中表达最高。IRF4a、IRF4b和IRF9在感染4 h后表达量显著上调(P<0.05),IRF4-like在感染1 h和24 h时表达量显著上调(P<0.05),IRF8在感染48 h后表达量显著上调(P<0.05)。[结论]胚胎期IRF4a、IRF8存在母源表达现象,能够保护胚胎免受外界干扰,直至草鱼免疫系统完善。IRF4亚家族成员在免疫器官鳃和脾脏中高表达。IRF4a、IRF4b、IRF9和IRF4-like在GCRV病毒感染的前期和中前期发挥作用,而IRF8主要在感染的中后期发挥抗病毒的作用。     

Rspo1调控斑马鱼胚胎汇聚延伸运动的研究

Rspo1 (R-spondin 1)是分泌型Rspos (R-spondins)蛋白家族的成员,在雌性发育、血管生成和癌症等多个方面具有调控作用。为了研究Rspo1在早期胚胎发育中的功能,以斑马鱼(Danio rerio)作为模式生物,利用反转录PCR及原位杂交技术检测rspo1基因的时空表达模式;通过显微注射rspo1 mRNA或rspo1反义寡核苷酸(Morpholino, MO)对rspo1进行过表达或敲降;通过形态观察及原位杂交技术检测胚胎汇聚延伸(Convergence and extension, CE)运动是否正常;利用荧光素酶活性检测实验测定Wnt/PCP信号通路活性水平;通过蛋白印迹法检测表征Wnt/PCP信号通路活性的磷酸化JNK (Jun N-terminal kinase)蛋白的水平。结果显示:rspo1为母源基因,在12hpf前胚胎中呈全身性表达, rspo1的过表达或敲降均影响胚胎的CE运动;过表达rspo1降低Wnt/PCP信号通路报告质粒的活性,而敲降rspo1则增加其活性,与之相一致, rspo1敲降的胚胎中磷酸化JNK的水平显著升高;此外, rsp...     

SB转座子介导的斑马鱼增强子捕获注解分析

为了建立斑马鱼增强子捕获突变体库及研究功能基因的表达调控模式,制备了SB转座子介导的增强子捕获转基因斑马鱼(F0),通过繁育建立了组织或器官特异表达报告基因绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的品系(F1)。选择F1代的SK-3系(脑部特异表达GFP)与野生型TU系斑马鱼交配,收集受精卵(F2),于24 hpf(Hour post fertilization)、2 dpf(Day post fertilization)、3 dpf、4 dpf、5 dpf、7 dpf 6个发育阶段检测报告基因绿色荧光蛋白的表达模式;然后通过Splinkerette PCR(SP-PCR)方法检测SB转座子在斑马鱼基因组中的插入位置,从而确定捕获的增强子和功能基因;最后通过胚胎原位杂交验证内源基因表达模式。结果表明,在F2代胚胎不同发育阶段,GFP表达具有明显的时空特性,前期在前脑,中脑,后脑三个部位均高水平表达,后期表达部位呈后移趋势,各个发育期表达强度基本无变化,结果提示该捕获增强子具有脑部表达特性。sp-PCR结果分析表明增强子位于基因组1号染色体35、914、498-35、914、621位置,在内源性基因ednraa位点附近。原位杂交结果表明该基因在胚胎24 hpf阶段具有转录活性。本研究结果提示SB转座子介导的增强子捕获技术可高效获得插入突变斑马鱼,对研究基因功能和获得具有自主知识产权的新基因具有重要作用。     

鱼类Ⅰ型与Ⅱ型胶原蛋白基因系统进化及其在有/无肌间骨代表鱼中的表达比较分析

研究在分析鱼类Ⅰ型与Ⅱ型胶原蛋白基因系统进化基础上, 以有肌间骨的团头鲂(Megalobrama amblycephala)和无肌间骨的尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)为研究对象, 探究了Ⅰ型与Ⅱ型胶原蛋白基因在二者不同发育阶段及不同部位肌肉组织中的表达模式。系统进化分析结果显示, 胶原蛋白基因col1a1、col1a2和col2a1在有刺鱼和无刺鱼中均各自聚为一支, 团头鲂和罗非鱼3个基因的氨基酸同源性都在90%以下。不同部位肌肉组织(背部上方、尾部上方和尾部下方)的基因表达结果显示, 团头鲂col1a1a和col1a1b基因与罗非鱼该同源基因col1a1在不同肌肉组织中的表达模式存在明显差异。在团头鲂中, Ⅰ型与Ⅱ型胶原蛋白基因在背上肌肉中的表达量高于尾部; 而在罗非鱼中, 其表达模式则相反。团头鲂和罗非鱼不同发育时期的基因定量结果显示: 团头鲂col1a1a和col2a1b基因的表达在肌间骨出现以前(15 dph)和基本出现之后(50 dph)显著(P<0.01)增加, 且Ⅰ型胶原蛋白基因和col2a1b的相对表达量在不同时期差异明显, 其中col1a1a基因在50 dph的表达丰度极高; 与团头鲂相比, 罗非鱼中相应基因的表达量变化较小, 整体波动不大。研究揭示了Ⅰ型和Ⅱ型胶原蛋白在有刺鱼与无刺鱼肌肉中的表达模式, 结果表明col1a1在团头鲂和尼罗罗非鱼两种鱼类中表达模式显著不同(P<0.01), 推测其与肌间骨发育潜在相关。     

Molecular cloning and function analysis of insulin-like growth factorbinding protein 1a in blunt snout bream(Megalobrama amblycephala)

Insulin-like growth factor-binding protein 1(IGFBP-1), a hypoxia-induced protein, is a member of the IGFBP family that regulates vertebrate growth and development. In this study, full-length IGFBP-1a cDNA was cloned from a hypoxia-sensitive Cyprinidae fish species, the blunt snout bream(Megalobrama amblycephala). IGFBP-1a was expressed in various organs of adult blunt snout bream, including strongly in the liver and weakly in the gonads. Under hypoxia, IGFBP-1a mRNA levels increased sharply in the skin, liver, kidney, spleen, intestine and heart tissues of juvenile blunt snout bream, but recovered to normal levels after 24-hour exposure to normal dissolved oxygen. In blunt snout bream embryos, IGFBP-1a mRNA was expressed at very low levels at both four and eight hours post-fertilization, and strongly at later stages. Embryonic growth and development rates decreased significantly in embryos injected with IGFBP-1a mRNA. The average body length of IGFBP-1a-overexpressed embryos was 82.4% of that of the control group, and somite numbers decreased to 85.2%. These findings suggest that hypoxia-induced IGFBP-1a may inhibit growth in this species under hypoxic conditions.     

团头鲂GPR43基因克隆、组织分布及黄连素对其mRNA表达量的影响

试验采用RACE技术克隆了团头鲂(Megalobrama amblycephala)G蛋白偶联受体43(GPR43)基因的cDNA序列, 并探究了不同组织中的GPR43 mRNA表达量及黄连素对其表达量的影响。结果显示, 克隆得到的团头鲂GPR43基因的cDNA序列全长为2026 bp, 含有1个长度为 981 bp的开放阅读框, 编码了326个氨基酸。RT-PCR检测发现GPR43在团头鲂的肠道、肌肉、鳃和肝胰腺中具有较高的表达。为期8周的养殖试验选取均重为(80.00±0.90) g的团头鲂320尾, 随机分于16个网箱中, 饲喂4种不同的试验日粮, 分别为正常日粮(脂肪含量为5%)、正常日粮+50 mg/kg黄连素、高脂日粮(脂肪含量为10%)、高脂日粮+50 mg/kg黄连素。结果显示: 在肠道组织中, 与正常日粮组相比, 高脂组的GPR43表达量降低, 添加黄连素能够显著升高其表达水平(P<0.05)。与正常日粮组相比, 高脂组的胆固醇(CHO)含量以及细胞分裂素蛋白激酶(p38)的表达量均呈现了显著上升(P<0.05)的趋势, 添加黄连素后其含量及表达量显著下降(P<0.05)。肝胰腺组织和肌肉组织中的多不饱和脂肪酸(PUFA)含量变化也有着相似的趋势, 而肉碱棕榈酰基转移酶Ⅰ(CPT Ⅰ)、过氧化物酶体增值因子α&β (PPARα&β)、AMP依赖性蛋白激酶(AMPK)的表达量以及2个组织中的饱和脂肪酸(SFA)和单不饱和脂肪酸(MUFA)含量呈现出了相反的趋势。此外, 在正常日粮中添加黄连素并不能对上述各指标产生明显的调控效应, 有时反而会导致轻微的负调控效应。综上结果表明, 黄连素能够显著上调GPR43在高脂抑制下的表达量, 同时能够缓解高脂诱导的团头鲂肝胰腺脂肪沉积, 改善其脂肪代谢性能。黄连素对于脂肪代谢的调控作用可能通过GPR43受体来实现。     

High-fat diet induces aberrant hepatic lipid secretion in blunt snout bream by activating endoplasmic reticulum stress-associated IRE1/XBP1 pathway

This study was conducted to understand the effect of high-fat diet challenge on lipid transport and endoplasmic reticulum stress in blunt snout bream. Ninety fish (average weight: 41.84 ± 0.07 g) were randomly fed a control diet (6% fat) or a high-fat diet (11% fat) for 9 weeks. The growth performance and feed utilization efficiency were evaluated at the end of the trial. The liver samples of both groups were harvested for molecular analysis and histological evaluation. Compared to the Control group, the high-fat diet group showed no effects on either growth performance or energy intake in blunt snout bream. However, high-fat diet resulted in a massive accumulation of lipid and pathological structural alternations, and disrupted expression of lipid transport-related genes and endoplasmic reticulum stress in the liver of the fish. In vitro, after exposure of the isolated primary hepatocytes from blunt snout bream to oleic acid, the cells showed increased intracellular TG accumulation, decreased VLDL secretion, which was attributed to altered expression levels of lipid transport-related genes through the activated IRE1/XBP1 signaling. The oleic acid-induced detrimental effects were alleviated by co-incubating the cells with an IER1 inhibitor, 4μ8c. In conclusion, high-fat diet could lead to aberrant lipid secretion by activating the ER stress-associated IRE1/XBP1 pathway. Inhibiting the activity of IRE1 represents a promising target to rescue the side-effects of high-fat diet on the liver function of blunt snout bream.     

FLT4 基因在斑马鱼早期发育过程中的表达

目的:研究FLT4(VEGFR3)基因在斑马鱼早期发育过程中的表达。方法:提取斑马鱼胚胎的总RNA,制备地高辛标记的FLT4RNA反义探针,WISH(整胚胎原位杂交)研究FLT4在斑马鱼早期发育过程中的表达。结果:成功合成FLT4基因探针,获得FLT4基因在斑马鱼早期发育过程中的表达情况:FlT4在2-cell、32-cell、oblong、shield期前普遍性表达(0.75h、1.7h、3.7h、6h);24h在头部表达较多,特别是在ICM(intermediate cell mass,中间细胞群)区处有特异性表达;48h、72h在头部表达均较高表达。结论:FLT4在早期参与了血管的形成和造血的发生,在脑部和肾小管的发育中可能起到了重要作用。     

白藜芦醇对高脂胁迫团头鲂抗氧化能力、非特异免疫机能和抗病力的影响

为探讨白藜芦醇（RSV）对高脂胁迫团头鲂特定生长率、抗氧化能力、非特异免疫机能和抗病力的影响,试验设计5组饲料:正常脂组（脂肪水平5%）、高脂组（脂肪水平11%）以及在高脂组中分别添加0.04%、0.36%、1.08% RSV。养殖试验持续10周,在采样结束后,进行嗜水气单胞菌攻毒试验,记录攻毒后96h的成活率。结果表明:团头鲂的特定生长率和日均采食量在添加1.08% RSV组出现最小值,并显著低于其他各组,且团头鲂的饲料效率表现出相似趋势。长期高脂饲喂可导致团头鲂血浆GSH含量显著下降,血浆MDA和NO含量显著升高,形成氧化应激。而长期氧化应激状态,可使团头鲂血浆溶菌酶活性和补体C3含量显著降低,肝脏中HSP70和HSP90应激调控基因表达上调,TNF-α炎症反应基因表达也上调。添加0.04% RSV组显著降低了血浆中SOD活性;添加0.36%和1.08% RSV组显著降低血浆MDA和NO含量,显著抑制了血浆SOD和CAT活性,且添加1.08% RSV组显著增加了鱼体血浆GSH含量。添加0.04%、0.36%和1.08% RSV组均显著提高了团头鲂血浆补体C3含量和溶菌酶活性,显著下调了高脂胁迫团头鲂肝脏中HSP70、HSP90与TNF-α mRNA的表达量。嗜水气单胞菌攻毒后团头鲂的成活率显著受到RSV的影响,并且在1.08% RSV添加组成活率最大。综上结果表明,团头鲂摄食高脂日粮之后,机体处于氧化应激状态,导致鱼体非特异免疫力和抗病力低下。而添加适宜剂量的RSV能够改善机体这种氧化应激的状态,提高鱼体的非特异免疫力和抗病力,其中以1.08%的添加量最优。     

斑马鱼NUP98基因的克隆及其时空表达图谱

目的：斑马鱼NUP98基因的克隆及其在个体早期发育过程中的表达情况研究。方法：提取斑马鱼胚胎的总RNA,制备地高辛标记的NUP98RNA反义探针,WISH（整体胚胎原位杂交）研究NUP98在斑马鱼早期发育过程中的表达;提取斑马鱼胚胎各时相和成鱼各组织的RNA,实时定量PCR检测斑马鱼胚胎各时相和成鱼各组织中的表达。结果：成功克隆斑马鱼NUP98基因,通过实时定量RT-PCR和原位杂交,获得NUP98基因在斑马鱼早期发育过程中的表达情况：NUP98在2-cell、32．cell、oblong、shield期、12h前普遍性表达（0．75h、1．7h、3．7h、6h、12h）;24h以后在眼部、头部表达较多,特别是在脊索表达较高;斑马鱼NUP98在0、0．5h、6h、12h、24h、48h表达逐渐降低,到72h和96h表达有所增加,但是仍低于24h其表达水平;NUP98在成鱼眼、脑、鳔、肾、肝、睾丸、胆囊、卵巢、鳍、心、肠、肌肉、腮、皮肤的表达中,眼的表达最高,明显高于其他组织,腮、卵巢、肠的表达次之,肌肉、鳔、胆囊、睾丸、皮肤、脑的表达紧随其后,鳍、肝、心、肾的表达最低。结论：NUP98基因可能在个体脑部、脊索及眼部的早期发育过程中起到了重要作用;NUP98基因可能具有抑制肿瘤发生的作用,该基因的调节异常对白血病的发生发展可能有重要影响。这些研究结果为进一步研究NUP98基因在造血系统中的作用,评估其是否适合作为血液系统恶性肿瘤的新的治疗靶点等奠定了理论基础。