杨树NL-80106转Bt基因植株的获得及抗虫性

通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导将苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)毒蛋白基因Bt转入杨树NL-80106(美洲黑杨×小叶杨,Populus deltoides×Populus simonii),获得了再生植株.PCR及PCR-Southernblotting的分析结果表明,Bt基因已整合到基因组中.部分转基因植株的杀虫实验表明,转基因植株B45和B64对一龄舞毒蛾(Lymantria dispar Linn.)幼虫有明显抗性,饲喂转基因杨树叶片的幼虫死亡率显著高于未转基因的对照植株.     

抗虫的转AaIT基因杨树的获得

通过根癌农杆菌叶盘法将构建在双元载体上的昆虫特异性神经蝎毒素AaIT基因转化至中国南方杨树N106(小叶杨×美洲黑杨,P.deltoides×P.simonii)中,共获得了62株再生植株。PCR分析及PCR产物Southernblotting的分析结果表明,AaIT基因整合在再生植株的基因组上。对部分转AaIT基因植株进行了杀虫实验,转基因植株A5对一龄舞毒蛾(Lymantriadispar)幼虫有明显的抗性,饲喂转基因杨树叶片的幼虫死亡率显著高于未转基因对照植株,其取食面积小,存活幼虫体重明显小于对照。ELISA分析证明了AaIT蛋白的表达。     

小黑杨花药培养植株转化胆碱氧化酶基因提高耐盐性

以小黑杨(Populus simonii ×P. nigra)花药培养植株无菌苗叶片为外植体, 通过根癌农杆菌(Agrob acteriumtumefaciens)介导法将胆碱氧化酶基因(codA)导入小黑杨中, 共获得4株转化株系, PCR扩增和Southern杂交检测结果全部 呈阳性, 表明codA基因已整合到小黑杨花药培养植株基因组中。荧光定量RT-PCR检测证明, codA基因在小黑杨花药培养植株中获得表达。耐盐实验结果显示, 各转基因株系在0.6%的NaCl浓度下能够生长, 而非转基因对照小黑杨受盐害严重, 说明codA基因的导入提高了转基因植株的耐盐性。     

小黑杨花药培养植株转化胆碱氧化酶基因提高耐盐性

以小黑杨（Populus simonii×p．nigra）花药培养植株无菌苗叶片为外植体,通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导法将胆碱氧化酶基因（codA）导入小黑杨中,共获得4株转化株系,PCR扩增和Southern杂交检测结果全部呈阳性,表明codA基因已整合到小黑杨花药培养植株基因组中。荧光定量RT-PCR检测证明,codA基因在小黑杨花药培养植株中获得表达。耐盐实验结果显示,各转基因株系在0．6％的NaCl浓度下能够生长,而非转基因对照小黑杨受盐害严重,说明codA基因的导入提高了转基因植株的耐盐性。     

小黑杨转双价抗虫基因的研究

用根癌农杆菌介导的叶盘法,将蜘蛛杀虫肽与Bt基因C肽序列的融合基因导入小黑杨(Populus simonii×P.nigra),所获得的3株卡那霉素抗性再生植株进行PCR和PCR-Southern杂交检测的结果均为阳性,Southern杂交检测的结果2株为阳性.抗虫试验结果显示,3个转基因株系均具有明显的抗虫效果,能显著抑制舞毒蛾幼虫的生长发育,表现出强烈的抗虫作用.     

转蜘蛛杀虫肽与Bt毒蛋白C肽基因小黑杨对杨扇舟蛾的抗性

为评价转蜘蛛杀虫肽与Bt毒蛋白C肽融合蛋白基因小黑杨对杨扇舟蛾Clostera anachoreta (Fabricius)的抗性,采用苗木套笼饲喂法和石蜡切片法,对取食转基因小黑杨的杨扇舟蛾幼虫的发育、死亡情况和中肠结构进行了研究。结果表明,杨扇舟蛾幼虫分别取食TT3（转基因无性系3）、TT1（转基因无性系1）和CK（非转基因对照）小黑杨后 总历期依次为35.63天、30.39天和28.74天,幼虫化蛹率依次为12.1%、29.3%和44.3%,平均蛹重依次为0.1077 g、0.1714 g和0.1893 g。转基因小黑杨能明显延长杨扇舟蛾幼虫的发育历期,降低化蛹率和蛹重。同时,转基因小黑杨有抑制幼虫蜕皮、增加其死亡率和致蛹畸形的作用,且能破坏幼虫中肠,使中肠细胞排列松散、肠腔食物减少、中肠变形,其破坏作用随时间延长而加剧。一般来讲,TT3对杨扇舟蛾的各种影响作用均大于TT1。     

RNAi分析舞毒蛾谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因对黄酮和槲皮素胁迫响应

为了明确舞毒蛾Lymantria dispar谷胱甘肽S-转移酶家族基因对生长发育影响及对次生物质的响应机制,采用RNAi技术分别沉默LdGSTe2、LdGSTs1、LdGSTs2和LdGSTz1基因,分析对舞毒蛾3龄幼虫体重、存活率、营养利用等生理指标的影响以及次生物质黄酮和槲皮素胁迫响应.结果表明,dsRNA可有效抑制LdGSTe2、LdGSTs1、LdGSTs2和LdGSTz1基因表达,分别注射dsLdGSTe2、dsLdGSTs1、dsLdGSTs2和dsLdGSTz1处理组舞毒蛾幼虫的相对生长率、相对取食量、食物利用率、食物转化率均低于对照组,但对幼虫的存活率无影响,表明LdGSTe2、LdGSTs1、LdGSTs2和LdGSTz1影响舞毒蛾幼虫生长发育;次生物质黄酮和槲皮素胁迫下,沉默LdGSTe2、LdGSTs1、LdGSTs2和LdGSTz1后舞毒蛾幼虫存活率显著下降,体重显著降低.沉默LdGSTe2、LdGSTs1、LdGSTs2和LdGSTz1基因对舞毒蛾幼虫的生长发育、食物利用具有抑制作用,同时影响了舞毒蛾幼虫对黄酮和槲皮素的适应能力.     

转双抗虫基因三倍体毛白杨外源基因表达及性状相关性分析

用部分改造的BtCry1Ac基因与慈菇蛋白酶抑制剂（API）基因构建的双抗虫基因表达载体,通过农杆菌介导法转化了三倍体毛白杨Populus tomentosa Carr.,获得一批转双抗虫基因株系。对转基因株系的抗虫毒蛋白表达进行了ELISA和Western Blot检测,同时用转基因株系叶片对杨扇舟蛾Clostera anachoreta Fabricius和舞毒蛾Lymantria dispar L.幼虫进行室内饲虫试验,并对各项外源基因表达指标进行了相关分析。结果表明：在检测的28个转基因株系中,对杨扇舟蛾高抗株系占总参试系号的41％,中抗系号占35.0％,低抗系号占24％,对舞毒蛾高抗株系占参试系号的70％。转基因植株可明显抑制存活幼虫的生长发育,且不同转基因株系饲养的幼虫发育存在显著差异。连续两年相关分析表明,不同转基因株系幼虫死亡率间存在极显著相关。转基因植株对舞毒蛾和杨扇舟蛾均表达出抗虫性,并存在极显著相关。ELISA检测结果表明,不同转基因株系Bt毒蛋白表达量存在差异,变化在0.0011％～0.0161％。转基因植株对害虫的杀虫效果与Bt杀虫蛋白的表达量存在显著相关,表明Bt毒蛋白在抗虫效果中占有重要地位。转基因植株对卡那霉素表现出一定的抗性,但与抗虫程度相关不明显,单纯用卡那霉素作为筛选手段并不能完全反映植株的真实抗虫效果。     

31株苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因型鉴定及表达产物研究

利用已建立的苏云金芽孢杆菌cry基因的PCRRFLP鉴定体系,鉴定了31株Bt菌株的cry基因类型,并进行了SDSPAGE分析和杀虫生物活性测定。研究表明：25株含cry1基因,表达蛋白130～150kD;其中16株含有对鞘翅目和鳞翅目害虫皆有活性的cry1I基因,其表达蛋白为81kD;15株同时含有cry1和cry2基因(13株表达蛋白约为60kD);10株含有未知待定基因;6株不含所鉴定的cry基因(其中2株有表达产物)。室内生物测定表明：cry1、cry2基因表达的菌株对鳞翅目害虫具有高杀虫活性,7株对舞毒蛾和膜翅目——杨叶蜂幼虫具有较高杀虫活性;含有cry1Aa\,cry1Ac\,cry2或cry1Ab\,cry1Ac\,cry2基因组合的菌株对棉铃虫幼虫均显示杀虫活性,其中6、12、30号菌株毒力最强。不含上述cry基因的菌株均无杀虫活性。以上结果证明,通过cry基因类型鉴定和表达产物的SDSPAGE分析可以预测菌株的杀虫活性。     

温度对转基因741杨抗虫性的影响

在不同温度下测定转基因741杨的抗虫性,发现转抗虫基因741杨的抗虫性与温度密切相关．随着温度的升高,舞毒蛾幼龄幼虫的总死亡率、累计死亡率均明显升高,且随着昆虫龄级的增加,幼虫对转基因株系和温度的敏感性逐渐降低．温度对取食对照株系的昆虫生长发育有促进作用．温度高,舞毒蛾幼虫的生长发育明显加快,历期缩短,各龄期体重、排粪量增长快,而以转基因杨饲喂的昆虫发育进度随温度变化差异不显著．对1998～2000年温度资料和相应的杨扇舟蛾死亡率建立了回归方程,各高抗和中抗株系的温度-昆虫死亡率曲线均表现为明显的回归关系．     

转TaLEA基因小黑杨无性系生长性状变异研究

以6年生的10个转TaLEA基因和1个非转基因小黑杨无性系为材料,对其生长量、干形、叶片性状、皮孔性状等15个指标进行测定分析。方差分析与遗传参数计算结果表明：11个小黑杨无性系间各性状达极显著差异水平（P＜0.01）,各指标表型变异系数处于1.92%~39.98%,遗传变异系数与表型变异系数接近,重复力处于0.621~0.987,表明基因的转入对无性系各性状的生长有一定的影响,但这种影响主要由遗传因素控制。表型相关分析结果表明转基因小黑杨生长量与干形性状、叶片性状、皮孔性状均呈不同程度的相关性,表明多指标共同作用,控制植株生长发育;利用综合评定法,当入选率为10%,初步选出XL-1和XL-9等2个优良无性系,2个无性系的树高、胸径分别比CK高16.55%和15.38%,比平均值高13.38%和19.46%,遗传增益分别为12.18%和17.42%。本研究为转基因杨树的良种选育提供重要的理论依据。     

丁香酸可增强LdNPV对舞毒蛾致死及亚致死作用

【目的】研究丁香酸(syringic acid,SY)对舞毒蛾核型多角体病毒(LdNPV)致死及亚致死作用的影响,为舞毒蛾Lymantria dispar L.的防治提供科学依据。【方法】采用食料给毒法进行生物测定,评估LdNPV及SY与LdNPV共同对舞毒蛾2龄幼虫的致死和亚致死作用。【结果】取食添加丁香酸人工饲料和正常人工饲料的舞毒蛾幼虫LdNPV致死中浓度(LC50)分别为91.1 OBs/μL和194.8 OBs/μL。当LdNPV浓度为2 400 OBs/μL,取食添加SY的饲料及正常人工饲料的舞毒蛾幼虫LdNPV致死中时间(LT_(50))分别为9.3 d和10.1 d,当LdNPV浓度为24 000 OBs/μL时,其LT_(50)分别为7.8 d和8.1 d,LdNPV的浓度越高致死中时间越短。丁香酸增加了LdNPV对舞毒蛾幼虫的致病力,降低了LdNPV对舞毒蛾幼虫的致死中浓度,缩短了致死中时间。LdNPV对取食正常饲料的雌、雄幼虫历期和蛹期及雌蛾寿命影响不显著,但显著缩短了雄虫寿命,降低了平均每雌产卵量。LdNPV对取食添加丁香酸饲料的幼虫产生明显的亚致死效应,并且LdNPV浓度高于240OBs/μL时雌、雄幼虫历期延长、雄蛾寿命缩短,雄性羽化率降低,雌成虫产卵量降低,产卵量较对照减少一半左右。【结论】结果提示,丁香酸可提高LdNPV对舞毒蛾幼虫的致病力,增加LdNPV对舞毒蛾的亚致死作用。     

转双价抗虫基因毛白杨无性系85号抗虫性研究

以优化的毛白杨无性系85号最适遗传转化体系为基础,通过农杆菌介导法将Bt(CryⅠAc)和API双价抗虫基因导入毛白杨无性系85号基因组.在高浓度卡那霉素的培养基上诱导不定芽和根,初步选择到200株转化植株,PCR检测显示,66株呈阳性反应.Southern杂交和ELISA检测进一步证明,Bt(CryⅠAc)和API双价抗虫基因已整合到毛白杨无性系85号基因组中,并得到了表达.对转化植株用舞毒蛾幼虫进行饲虫试验,结果显示昆虫幼虫的死亡率高达60.0%~77.8%,且存活幼虫的生长发育也受到了明显抑制.研究结果为杨树抗虫育种提供了新的种质资源.     

小青杨组织营养品质和舞毒蛾幼虫生长对大气CO2浓度升高的响应

利用开顶式气室研究了1年生小青杨绿叶、细根、粗根和树皮内营养成分对CO2浓度升高的响应,并检验了上树取食的舞毒蛾幼虫的生长反应.结果表明：CO2浓度升高环境下小青杨绿叶、细根、树皮和粗根中的氮含量显著降低,绿叶、树皮和粗根中的碳氮比显著增加,但细根中碳氮比增加未达到显著水平;CO2浓度升高对所有杨树组织的总碳含量均无影响;CO2浓度升高显著增加了绿叶中总可溶性糖和总非结构碳水化合物的浓度,而绿叶淀粉含量仅在部分采样日期发生显著增加,除细根可溶性糖含量在CO2浓度升高处理下降低外,根系和树皮中各碳水化合物指标的浓度均未发生显著变化;CO2浓度升高环境下2龄舞毒蛾幼虫上树取食13d后体重显著低于自然CO2浓度处理下幼虫的体重,但幼虫继续在各自的实验处理下取食11d后,体重未表现出显著性差异.大气CO2浓度升高对杨树各组织内的营养成分含量均有影响,绿叶营养品质变差可能是导致低龄舞毒蛾幼虫生长受抑制的主要原因.     

Bt毒蛋白在转基因抗虫玉米中的表达及在亚洲玉米螟中的转移积累

以两个转Bt基因抗虫玉米品系G03-2396、G03-2739和对照玉米品种苏玉16为材料,采用室内生物测定法研究它们对亚洲玉米螟的抗性, 并采用酶联免疫技术（ELISA）检测这两个转基因玉米品系不同组织中Bt毒蛋白的表达量及亚洲玉米螟3龄与5龄幼虫取食转基因玉米后体内和粪便中的Bt毒蛋白含量.结果表明：转Bt基因抗虫玉米心叶对玉米螟幼虫的毒性较强,初孵幼虫取食6 d后的存活率不到3%,3龄幼虫取食6 d后的存活率小于70%,抗虫玉米雌穗的毒性小于心叶.两个转Bt基因玉米心叶和雌穗中均表达了一定量的Bt毒蛋白,但心叶中的毒蛋白含量高于雌穗;Bt毒蛋白表达量依次为G03-2739心叶（39.6 μg·g^-1FM）> G03-2396心叶（26.1 μg·g^-1 FM）> G03-2396雌穗（17.0 μg·g^-1 FM）> G03-2739雌穗（14.6 μg·g^-1 FM）.取食转基因玉米心叶或雌穗后,3龄幼虫体内的Bt毒蛋白含量显著高于5龄幼虫;同龄幼虫取食心叶后其体内及粪便中Bt毒蛋白含量均显著高于取食雌穗的个体.其中,取食G03-2739心叶的5龄幼虫粪便中的Bt毒蛋白含量最高,达10.4 μg·g^-1 FM;取食其雌穗的3龄幼虫粪便中的Bt毒蛋白含量最低,仅2.7 μg·g^-1 FM.     

不同光照强度下兴安落叶松对舞毒蛾幼虫生长发育及防御酶的影响

为了探讨舞毒蛾对光照环境变化引起的落叶松抗性的变化是如何响应的,分析了不同光照强度处理的兴安落叶松对舞毒蛾幼虫生长发育状况和生理指标变化的影响。研究发现,取食50%和25%光照强度下生长的落叶松后,舞毒蛾幼虫平均体重、蛹重、化蛹率和羽化率与对照组相比均显著下降（P<0.05）。幼虫体内保护酶SOD、POD、CAT和解毒酶ACP、AKP、CarE、GSTs、MFO活性与对照组(100% 光照)相比均显著降低（P<0.05）且除CAT外在50%光照强度下降低最为显著（P<0.05）;4龄和5龄幼虫取食同一光强处理的落叶松后,SOD、POD、CarE、GSTs和MFO活性5龄显著低于4龄（P<0.05）,ACP和AKP活性5龄却显著高于4龄（P<0.05）,表明昆虫在不同的发育阶段启用不同的排毒酶系。光照差异对取食人工饲料的舞毒蛾生长发育和排毒代谢酶活性均没有显著影响,说明舞毒蛾生长发育和酶活性的变化是因寄主植物抗性的影响而非光照强度的作用。本研究结果表明,采取适当的营林措施调节林分内的光照条件,可以提高落叶松的自主抗虫性,增强其抵御害虫危害的能力,有效控制害虫危害,减少化学农药的施用量。     

不同损伤形式诱导合作杨叶片中酚类物质含量的差异

采用机械损伤、舞毒蛾(Lymantria dispar)幼虫取食、机械损伤伤口涂抹舞毒蛾口腔分泌物3种方法处理合作杨(Populus simonii×P.pyramidalis 'Opera 8277')扦插苗叶片,24 h后用高效液相色谱(HPLC)检测叶片中香豆酸等9种酚类物质的含量,比较不同损伤形式诱导的酚类物质含量的变化差异,以探讨酚类物质含量变化的原因.结果表明,机械损伤和舞毒蛾取食诱导的酚类物质含量变化存在显著差异,而机械损伤伤口涂抹舞毒蛾口腔分泌物与舞毒蛾取食处理诱导的酚类物质含量变化相似,推测舞毒蛾口腔分泌物是造成机械损伤与昆虫取食处理间酚类物质含量变化差异的关键因素.     

转新型双价抗虫基因杨树对光肩星天牛及美国白蛾的抗性鉴定

为明确双价基因chitinase-BmkIT对鞘翅目害虫光肩星天牛及鳞翅目害虫美国白蛾的抗虫效果, 分别以转该双价基因的杨树茎干和叶片为材料,采用室内茎干接虫和叶片接虫方法鉴定其对光肩星天牛Anoplophora glabripennis和美国白蛾Hyphantria cunea幼虫的抗性。结果表明：转基因株系132-2,144-1,123-1对美国白蛾幼虫的致死作用和生长发育影响显著高于取食未转化叶片的处理（P＜0.05）,且对其后代产生了影响,表现为幼虫不能化蛹或化蛹后不能羽化或羽化不正常;但供试的8个转基因株系对光肩星天牛幼虫无明显的致死和生长抑制作用,表现为幼虫死亡率和体重均与取食非转化茎干幼虫无显著差异（P＞0.05）。结果提示,双价基因chitinase-BmkIT可作为杨树鳞翅目害虫的抗虫基因源,并且对延缓害虫抗性的产生具有一定的意义。     

转cry1Ab/cry1Ac基因玉米Cry1Ab/Cry1Ac融合蛋白表达及对亚洲玉米螟的室内杀虫效果

【目的】室内抗螟性评价是转Bt基因抗虫玉米研发和安全性评价的重要环节。【方法】采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定了转cry1Ab/cry1Ac基因玉米ZZM030心叶中Cry1Ab/Cry1Ac融合杀虫蛋白的表达量;采用室内生测法测定了分别取食转基因玉米ZZM030和非转基因玉米X249心叶后亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis敏感品系ACB-BtS、Cry1Ab抗性品系ACB-AbR和Cry1Ac抗性品系ACB-AcR初孵幼虫的存活率。【结果】转基因抗虫玉米ZZM030 4叶期和8叶期心叶中Cry1Ab/Cry1Ac融合杀虫蛋白的表达量分别是10.62和2.94 μg/g FW。敏感品系亚洲玉米螟初孵幼虫取食转基因玉米ZZM030心叶2 d的存活率仅为23.6%,4 d后存活率为0,而取食非转基因对照玉米X249心叶4 d的存活率高达93.1%。Cry1Ab抗性品系和Cry1Ac抗性品系初孵幼虫取食转基因玉米ZZM030心叶6 d后的存活率分别为11.1%和12.5%,而取食非转基因玉米X249心叶6 d后的存活率分别为81.9%和77.8%。【结论】转cry1Ab/cry1Ac基因玉米ZZM030心叶中高表达的Cry1Ab/Cry1Ac融合蛋白对亚洲玉米螟初孵幼虫具有极高的杀虫效果。     

以胆碱脱氢酶基因对小黑杨花粉植株的遗传转化

以小黑杨（Populus simoniixP．nigra）花粉植株叶片为外植体,用根癌农杆菌介导法将胆碱脱氢酶基因（betA）导入其中,将获得的4株卡那霉素抗性转基因株系进行PCR检测,结果均为阳性。用荧光定量PCR对转基因株系的betA基因转录结果检测表明,4个转基因株系均已表达外源基因,但表达量有差异。对获得的4株转基因株系及对照进行NaCl胁迫处理,当NaCl浓度为0．55％时,非转基因小黑杨花粉植株生根率为0,转基因株系生根率为80％～100％;在NaCl为0．70％～0.80％时,则转基因株系生根率也为0。4个转基因株系的甜菜碱含量显著高于未转基因对照,说明抛融基因的导入提高了转基因株系的耐盐性。