人snail真核表达载体构建与鉴定

目的:构建人snail基因真核表达载体并鉴定。方法:使用RT-PCR法获取人snail基因全长c DNA,经Bam H I、Eco R I双酶切、连接,插入pc DNA3.1(+)真核表达载体,转化TOP10感受态细胞,用含氨苄青霉素的LB培养基筛选阳性克隆,提取质粒双酶切电泳及测序鉴定,瞬时转染siha细胞Western-blot从蛋白水平鉴定重组质粒在真核细胞内的表达。结果:pc DNA3.1-snail重组质粒经酶切电泳符合预期片段,测序鉴定插入片段与NCBI Gen Bank文库中人snail序列一致,重组质粒瞬时转染后snail蛋白表达量明显增高。结论:成功构建pc DNA3.1-snail重组质粒载体,为进一步探讨snail基因生物学功能奠定了基础。     

CD31启动子表达载体的构建与功能鉴定

目的:构建CD31启动子的绿色荧光蛋白和萤光素酶真核表达载体,转染至内皮细胞系HUVEC和BEND3细胞中,对其生物学功能和活性进行初步检测,作为鉴定内皮细胞的新方法。方法:从基因组中钓取CD31启动子的核酸序列,将其插入pGL4.0萤光素酶载体和慢病毒表达载体pCDH-copGFP,经限制性内切酶酶切和测序验证后瞬时转染HUVEC和BEND3内皮细胞系及对照MCF7乳腺癌细胞,通过双萤光素酶实验检测其启动子活性,荧光显微镜观察绿色荧光表达。结果:双酶切与测序结果表明表达载体中正确插入了CD31启动子序列;双萤光素酶实验和荧光显微镜检测发现CD31启动子特异性在内皮细胞中表达。结论:CD31启动子的萤光素酶和绿色荧光表达载体构建成功,可作为鉴定内皮细胞的新型技术手段。     

FLT-1启动子在血管内皮细胞中特异生物活性的检测及其意义

目的:构建带有组织特异性 FLT-1 启动子的真核表达栽体,检测其在转染的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中对荧光素酶报告基因表达的驱动能力.方法:采用PCR扩增FLT-1启动子,插入到pGL3-Basic-luc载体中,构建携带FLT-1启动子的真核表达载体pGL3-FLT-Basic-luc,经脂质体法转染HUVEC、HepG2、NIH3T3和HEK293 细胞,于转染48h后采用双荧光报告系统检测荧光素酶表达活性.结果:酶切及测序证实构建的pGL3-FLT-Basic-luc栽体中含有序列正确的FLT-1基因启动子,双荧光报告系统检测显示,转染的HUVEC细胞其荧光素酶活性明显高于HEK293细胞(P<0.01),而转染的HepG2和NIH3T3细胞中未检测出荧光素酶表达.结论:克隆的FLT-1启动子具有较高的血管内皮特异性转录活性,可作为血管疾病靶向基因治疗的启动子来源.     

人ING4的基因克隆及真核表达

目的克隆人生长抑制因子家族（inhibitor of growth famility member4,ING4）基因,构建其真核表达载体pEGFP—ING4。方法提取人胎盘总RNA,经RT—PCR扩增出ING4 cDNA,克隆至pEGFP—C2载体,构建的真核表达载体pEGFP—ING4用双酶切、基因测序进行序列鉴定;转染MCF-7细胞用荧光显微镜和免疫组化检测重组质粒的表达。结果RT—PCR产物为750bp的条带,双酶切和基因测序正确,转染可见目的蛋白融合表达。结论从人胎盘组织中成功克隆了ING4基因并构建其真核表达质粒在人MCF-7细胞中表达,为进一步研究1NG4基因的作用及抗肿瘤机制奠定了基础。     

人磷酸葡萄糖变位酶5对肝癌细胞生长和迁移的影响

目的:构建带有Flag标签的人磷酸葡萄糖变位酶5(PGM5)基因的真核表达载体,研究PGM5对肝癌细胞生长、迁移的影响。方法:以人乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增PGM5基因编码序列,酶切后插入pcDNA3.0-Flag载体;将空载体与重组质粒分别转染293T细胞,Western印迹检测PGM5的表达;CCK8生长曲线实验研究PGM5对肝癌细胞生长的影响,细胞划痕实验检测PGM5对肝癌细胞迁移的影响。结果:双酶切及测序结果显示pcDNA3.0-Flag-PGM5真核表达载体构建成功;Western印迹表明PGM5在293T细胞中获得表达;生长曲线和划痕实验显示PGM5可以显著抑制肝癌细胞的生长和迁移。结论:构建了pcDNA3.0-Flag-PGM5表达载体,并发现PGM5可以抑制肝癌细胞生长和迁移,为进一步研究PGM5在癌症发生发展中的作用奠定了基础。     

人M2型丙酮酸激酶促进肾癌细胞生长

目的:构建带myc标签的人M2型丙酮酸激酶(PKM2)的真核表达载体,并瞬时转染肿瘤细胞,初步探讨PKM2的生物学功能。方法:以人乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增PKM2基因,将其插入p XJ-40-myc载体,双酶切和基因测序验证后转染人胚肾293T细胞,Western印迹验证表达;将重组基因和空载体分别转染人肾透明细胞癌Caki-1细胞,CCK8法测定并绘制细胞生长曲线。结果:从人乳腺文库中获得长约1500 bp的DNA片段,连接到p XJ-40-myc载体上,测序结果与目的序列完全一致;转染人胚肾293T细胞后获得表达;细胞生长曲线结果显示,转染myc-PKM2的Caki-1细胞生长较空载体细胞快。结论:构建了myc-PKM2真核表达载体,为进一步研究PKM2在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础。     

FLT-1启动子在血管内皮细胞中特异生物活性的检测及其意义

目的:构建带有组织特异性FLT-1启动子的真核表达载体,检测其在转染的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中对荧光素酶报告基因表达的驱动能力。方法：采用PCR扩增FLT-1启动子,插入到pGL3-Basic-luc载体中,构建携带FLT-1启动子的真核表达载体pGL3-FLT-Basic-luc,经脂质体法转染HUVEC、HepG2、NIH3T3和HEK293细胞,于转染48h后采用双荧光报告系统检测荧光素酶表达活性。 结果:酶切及测序证实构建的pGL3-FLT-Basic-luc载体中含有序列正确的FLT-1基因启动子,双荧光报告系统检测显示,转染的HUVEC细胞其荧光素酶活性明显高于HEK293细胞（P<0.01）,而转染的HepG2和NIH3T3细胞中未检测出荧光素酶表达。结论:克隆的FLT-1启动子具有较高的血管内皮特异性转录活性,可作为血管疾病靶向基因治疗的启动子来源。图     

人CCAAT增强子结合蛋白β抑制骨肉瘤细胞增殖

目的:构建带Myc标签的CCAAT增强子结合蛋白β(C/EBPβ)的真核表达载体,并检测其对骨肉瘤细胞增殖的影响。方法:应用PCR技术从人乳腺文库中扩增C/EBPβ全长编码区基因,并克隆到pXJ-40载体中;将重组质粒转染人胚胎肾293T细胞,采用SDS-PAGE和Western印迹鉴定蛋白表达;另将重组C/EBPβ质粒转染入骨肉瘤细胞系U20S,生长实验检测其对肿瘤细胞增殖的影响。结果:基因测序和双酶切鉴定表明,Myc-C/EBPβ真核表达质粒构建成功;SDS-PAGE和Western印迹结果显示,Myc-C/EBPβ转染人胚胎肾293T细胞后获得表达;生长实验证明C/EBPβ具有抑制骨肉瘤细胞增殖的功能。结论:构建了Myc-C/EBPβ的真核表达载体,为全面了解C/EBPβ的生物学功能及调控机理奠定了基础。     

携带人二氢叶酸还原酶基因慢病毒表达载体构建及鉴定

目的:构建携带人二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的慢病毒表达载体pWPI。方法:采用PCR方法扩增二氢叶酸还原酶cDNA全长,与EZ-T克隆载体连接,HindIII及BamHI-HF限制性内切酶双酶切回收的PCR片段并补平其缺口。慢病毒系统载体使用pWPI系统,采用PmeI酶切载体后回收片段,将其磷酸化,T4酶连接载体与目的基因。表达载体鉴定均采用核苷酸序列测定,重组质粒采用脂质体转染293T包装细胞后获得包装的病毒颗粒。结果:成功扩增二氢叶酸还原酶全长并连接入pWPI载体构建成重组表达载体DHFR-pWPI,重组质粒测序结果显与DHFR基因的同源性达100%,按标准生产程序转染293T后有DHFR基因的表达。结论:成功采用慢病毒载体系统构建了二氢叶酸还原酶重组慢病毒转基因,为探讨DHFR在肿瘤多药耐药过程中的分子机理奠定基础。     

LIM结构域蛋白FHL1C抑制Notch信号途径的转录激活研究

目的:克隆人表达FHL1C基因以及建立真核表达载体和慢病毒载体。方法:从人的骨骼肌细胞来源的cDNA中扩增并克隆人FHL1C基因的编码区,连接至pMD-18T载体酶切鉴定后测序。序列测定确认后,双酶切pMD18T-FHL1C回收片段,插入真核表达载体,构建真核表达载体pCMV-Myc-FHL1C酶切鉴定正确后,转染Hela细胞及Cos7细胞,用Western Blot检测其在转染细胞中的表达,用双荧光素报告基因系统检测其对Notch信号作用。构建FHL1C-IRES-GFP表达单元,建立慢病毒表达载体plen-ti6/V5-FHL1C-IRES-GFP,包装慢病毒后感染培养的细胞,用免疫荧光显微镜、Western Blot检测分析其在被感染的细胞中的表达。结果:通过PCR方法成功扩增了人FHL1C基因的编码区。通过转染Hela及Cos7细胞,使用Western Blot检测其蛋白水平表达,双荧光报告基因系统分析均能够下调激活的Notch信号。成功构建了FHL1C慢病毒表达载体pLenti6/V5-FHL1C-IRES-GFP,包装慢病毒,把获取的慢病毒感染细胞后通过荧光显微镜证实被感染的细胞绿色荧光蛋白正确表达,Western Blot检测证实其表达。结论:成功建立起FHL1C真核表达载体及慢病毒表达系统,为研究急性T淋巴细胞白血病与Notch信号转导通路之间的关系奠定了基础。     

LIM结构域蛋白FHL1C抑制Notch信号途径的转录激活研究

目的：克隆人表达FHL1C基因以及建立真核表达载体和慢病毒载体。方法：从人的骨骼肌细胞来源的cDNA中扩增并克隆人FHL1C基因的编码区,连接至pMD-18T载体酶切鉴定后测序。序列测定确认后,双酶切pMD18T-FHL1C回收片段,插入真核表达载体,构建真核表达载体pCMV-Myc-FHL1C酶切鉴定正确后,转染Hela细胞及Cos7细胞,用Western Blot检测其在转染细胞中的表达,用双荧光素报告基因系统检测其对Notch信号作用。构建FHL1C-IRES-GFP表达单元,建立慢病毒表达载体plen-ti6/V5-FHL1C-IRES-GFP,包装慢病毒后感染培养的细胞,用免疫荧光显微镜、Western Blot检测分析其在被感染的细胞中的表达。结果：通过PCR方法成功扩增了人FHL1C基因的编码区。通过转染Hela及Cos7细胞,使用Western Blot检测其蛋白水平表达,双荧光报告基因系统分析均能够下调激活的Notch信号。成功构建了FHL1C慢病毒表达载体pLenti6/V5-FHL1C-IRES-GFP,包装慢病毒,把获取的慢病毒感染细胞后通过荧光显微镜证实被感染的细胞绿色荧光蛋白正确表达,Western Blot检测证实其表达。结论：成功建立起FHL1C真核表达载体及慢病毒表达系统,为研究急性T淋巴细胞白血病与Notch信号转导通路之间的关系奠定了基础。     

人胰岛素样生长因子-1真核双顺反子表达载体pIRSES2-EGFP-hIGF-1的构建与鉴定

目的:利用基因工程原理构建人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)全长基因的真核表达栽体pIRES2-EGFP-hIGF-1,并观察其在人胚肾293细胞中的表达.方法:应用PCR方法从人肝细胞文库中提取人hIGF-1全长cDNA序列,克隆入T-pMD18载体中,经测序证实序列正确后,利用XhoI/EcoRI进行双酶切并定向插入真核表达载体pIRES2-EGFP中,利用双酶切、电泳和PCR进行鉴定证实插入片段的正确性.应用高效转染试剂X-treme GENE HP DNA Transfection reagent介导真核表达载体pIRES2-EGFP-hIGF-1转染人胚肾细胞(HEK293),转染后利用倒置荧光显微镜与RT-PCR观察目的基因在靶细胞中的表达.结果:经酶切和测序证实重组质粒栽体构建正确,转染后48小时可观察到绿色荧光的表达,RT-PCR结果证实转染pIRES2-EGFP-hIGF-1后可有hIGF-1基因靶细胞中表达.结论:成功构建真核表达载体pIRES2-EGFP-hIGF-1,目的基因与标记基因可同时在靶细胞中表达,为后续研究奠定基础.     

稳定表达Syncytin的EL4细胞系的建立及鉴定

Syncytin是人类内源性逆转录病毒W家族的囊膜蛋白。近期研究发现Syncytin与白血病密切相关。为研究Syncytin的生物学功能,我们克隆了人syncytin,并连接到pIRES2-EGFP质粒上,转化该质粒至感受态大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆进行PCR、酶切电泳和DNA测序鉴定,成功构建了表达syncytin基因的真核表达载体。利用罗氏转染试剂转染重组质粒至EL4细胞,并通过G418选择性培养基筛选,在荧光显微镜下观察细胞中Syncytin表达,用RT-PCR、Western blot检测Syncytin表达水平,结果显示我们成功构建了稳定表达人Syncytin的EL4细胞系。稳定表达人Syncytin的EL4细胞系的建立,为进一步研究人Syncytin功能及其与白血病免疫逃逸的关系提供了重要的细胞模型和实验基础。     

人VHL基因真核表达载体的构建及其对肿瘤细胞生长的抑制

目的:构建人抑癌基因VHL的真核表达载体,并验证其对肿瘤细胞生长的影响。方法:采用PCR技术从人乳腺文库中扩增人VHL基因,将其克隆到p XJ-40-myc载体中,酶切和测序验证后转染人胚肾293T细胞,通过蛋白免疫印迹鉴定其表达;转染人乳腺癌ZR75-1细胞和肝癌Hep G2细胞,通过CCK8法测定细胞生长曲线。结果:从人乳腺文库中扩增得到约650 bp的DNA片段,并克隆至p XJ-40-myc载体上,且测序与目的序列完全一致;转染人胚肾293T细胞后,蛋白免疫印迹检测到相对分子质量为26×103的目的基因表达产物;细胞生长曲线显示,转染myc-VHL的乳腺癌、肝癌细胞较空载体细胞生长慢。结论:构建了myc-VHL真核表达载体,myc-VHL抑制癌细胞生长,为进一步研究VHL在肿瘤发生发展中的功能奠定了基础。     

磷酸化Akt1(Thr308)位点突变真核表达载体的构建及其生物学功能研究

目的:构建磷酸化Akt1(Thr308)位点突变真核表达载体,并瞬时转染胃癌耐药细胞,对其生物学功能进行初步检测。方法:以带有pc DNA3.0-Flag标签的Akt1质粒为模板,采用重组PCR技术扩增得到Akt1(T308A)(苏氨酸突变成丙氨酸)、Akt1(T308E)(苏氨酸突变成谷氨酸)位点突变编码区序列,将其插入pc DNA3.0-Flag载体,双酶切和测序验证后瞬时转染人胚肾293T细胞,Western印迹检测其表达情况;将突变质粒与空载体分别转染人胃癌耐药细胞BGC-823/c DDP,通过Western印迹和实时定量PCR检测Notch1蛋白和m RNA水平的变化,通过CCK-8法检测对耐药细胞生长曲线的影响。结果:双酶切和测序结果表明Akt1(T308A)、Akt1(T308E)的真核表达质粒构建成功,转染293T细胞后获得表达;转染人胃癌耐药细胞BGC-823/c DDP后,利用实时定量PCR和Western印迹证明去磷酸化Akt1(T308A)可抑制Notch1的转录和蛋白水平,模拟持续磷酸化Akt1(T308E)升高Notch1的转录和蛋白表达;细胞生长曲线结果显示,转染Akt1(T308A)较空载体耐药细胞生长慢,而Akt1(T308E)促进耐药细胞生长。结论:PI3K/Akt与Notch1信号通路的激活在胃癌耐药的发生、发展过程中发挥重要作用。     

人抑癌基因NKX2-3真核表达载体的构建及其对肿瘤细胞生长的作用

目的:构建人抑癌基因NKX2-3的真核表达载体,并验证其对肿瘤细胞生长的影响。方法:采用PCR技术从人乳腺文库中扩增人NKX2-3基因,将其克隆到Flag-pc DNA3.0载体中,酶切和测序验证后转染人胚肾293T细胞,蛋白免疫印迹鉴定其表达;转染人结肠癌细胞HCT-116和肝癌Hep G2细胞,通过CCK8法测定细胞生长曲线。结果:从人乳腺文库中扩增得到约1080 bp的DNA片段,并克隆至Flag-pc DNA3.0载体上,测序结果与目的序列完全一致;转染人胚肾293T细胞后,目的基因获得表达;细胞生长曲线结果显示,转染Flag-NKX2-3的人结肠癌、肝癌细胞较空载体细胞生长慢。结论:构建了Flag-NKX2-3真核表达载体,为进一步研究NKX2-3在肿瘤中的功能奠定了基础。     

真核表达载体pIRES2-EGFP-Nurr1的构建及鉴定

目的:构建带有增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP及目的基因Nurr1的真核表达载体pIRES2-EGFP-Nurr1,并检测其在293T细胞中的表达。方法:采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法从大鼠黑质中获取Nurrl基因,连接T载体测序正确后与真核空载体pIRES2-EGFP一起,经Nhe1和Xho1双酶切,T4 DNA连接酶连接,构建pIRES2-EGFP-Nurr1;真核表达载体pIRES2-EGFP-Nurr1测序正确后采用脂质体法将其转染293T细胞,倒置荧光显微镜下观察转染效率,PCR检测Nurr1基因mRNA水平的表达情况,免疫印迹试验(Western Blot)检测Nurr1蛋白的表达水平。结果:酶切及测序鉴定证实成功构建了重组真核表达载体pIRES2-EGFP-Nurr1;293T细胞转染pIRES2-EGFP-Nurr1后可以高度表达绿色荧光,有效转录Nurr1基因并正确的高表达Nurr1蛋白。结论:成功构建Nurr1真核表达载体且在293T细胞中高水平表达,为进一步转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),基因治疗帕金森病奠定基础。     

人角质细胞生长因子2真核表达载体的构建及功能验证

目的:构建人角质细胞生长因子2(KGF-2)基因真核表达载体,探索KGF-2的上皮细胞迁移功能。方法:以人乳腺cDNA文库为模板,PCR扩增KGF-2基因片段,将其插入pXJ-40-myc,经双酶切和测序验证后,将重组质粒转染HEK-293T细胞,采用Western印迹检测重组蛋白;转染人肠上皮细胞FHC,采用细胞划痕实验检测细胞迁移能力。结果:PCR扩增获得627 bp的DNA产物,插入pXJ-40-myc载体,双酶切及测序结果证明重组质粒含有目的序列;转染HEK-293T细胞,Western印迹检测到相对分子质量约23×103的目的蛋白;细胞划痕实验显示,转染Myc-KGF-2的FHC细胞较未转染或转染空载体的细胞迁移能力强。结论:构建了人KGF-2基因真核表达载体,并验证了其促进细胞迁移的功能。     

内含子源性microRNA对内皮型一氧化氮合酶表达及血管内皮细胞增殖的作用

前期工作表明,内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)第4内含子中的27碱基 (nucleotide,nt)重复序列是27-nt microRNA的来源,并对eNOS具有重要的调节作用．为进一步探讨该内含子源性27-nt microRNA参与调节eNOS表达的分子机制及其在内皮细胞增殖中的可能作用,通过构建27-nt microRNA高表达质粒,用脂质体将该质粒转染人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC),Western blot和RT-PCR检测该细胞系中eNOS蛋白和mRNA表达情况以及胞核转录因子的表达改变,并观察HUVEC增殖的变化情况．结果发现：27-nt microRNA 高表达能降低eNOSmRNA的水平和蛋白质表达;同时对转录因子Sp1、Ap1的蛋白质表达也产生了不同程度的抑制作用;转染后细胞的生长速度比未转染的细胞明显减慢,尤其转染了27-nt microRNA的双倍长度突变体(pEGP-mut-54nt-mi)质粒的HUVEC,其生长倍增时间比正常对照组明显延长达49.4%．结果表明,27-nt microRNA明显抑制eNOS蛋白及其mRNA表达,同时 HUVEC增殖受到明显抑制,转录因子Sp1 和Ap1 在27-nt microRNA对eNOS的表达调节中起重要作用．实验提示,内含子源性microRNA与转录因子共同参与对内皮细胞增殖及其相关性基因的表达调节,可能是众多真核细胞中某些疾病相关性基因表达自我调节的重要机制之一．     

DH结构域缺失对SGEF在293T细胞中定位的影响

目的:通过构建带EGFP标签的SGEF基因DH结构域缺失的真核表达载体pEGFP-C1-SGEF-△DH并使其在293T细胞表达,观察DH结构域缺失后SGEF在293T细胞中的定位。方法:利用重叠PCR技术在pcDNA3.1-SGEF质粒上扩增缺失DH结构域的SGEF基因,然后将PCR产物亚克隆到真核表达载体pEGFP-C1上,对阳性克隆进行双酶切和测序鉴定,利用脂质体转染方法转染293T细胞,并用Western印迹和细胞免疫荧光技术对重组质粒pEGFP-C1-SGEF-△DH在293T细胞中的表达及其蛋白定位进行分析。结果:双酶切和测序鉴定表明,pEGFP-C1-SGEF-△DH真核表达质粒构建成功,转染实验发现该质粒能够在293T细胞中表达,表达产物主要定位在细胞核内。结论:构建了带EGFP标签的人SGEF基因DH结构域缺失的真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞293T中表达,表达产物定位于细胞核,为进一步研究SGEF基因DH结构域的细胞生物学功能提供了一个重要的工具。