水稻锌指蛋白基因OsBBX6的克隆、表达及生物信息学分析

锌指蛋白作为植物体内一类重要的转录因子,对植物生长发育、基因调控以及响应外界环境变化方面发挥重要作用。Os BBX6基因属于水稻锌指蛋白B-Box基因家族成员,启动子元件分析发现其含有高温应答元件(HSE)、干旱应答元件(MBS)及非生物胁迫响应元件(TC-rich repeats)等逆境相关元件。组织特异性定量表达分析表明,Os BBX6在叶片中表达最高,根其次,茎和幼穗中表达最低。胁迫处理后的荧光定量PCR发现其受低温诱导上调,受高温、干旱、盐胁迫等抑制表达,表明其正向响应低温胁迫,负向响应高温、干旱、盐胁迫等。另外,本研究还克隆了OsBBX6基因,并对其进行了系统进化、蛋白跨膜、蛋白亚细胞定位及OsBBX6基因共表达等分析,为进一步研究其生物学功能奠定基础。     

大麦NF-YC基因鉴定及在盐胁迫下的表达分析

核因子Y (NF-Y)是由NF-YA、NF-YB和NF-YC三个亚基组成的一类真核细胞转录因子, 主要参与植物生长发育调控和非生物胁迫信号传递。该研究利用生物信息学方法解析了大麦(Hordeum vulgare) NF-YC基因家族功能。首先, 基于大麦基因组数据库鉴定出11个HvNF-YC成员, 分布在除第2号染色体以外的其余6条染色体上, 内含子0-5个。系统进化分析显示, 大麦、拟南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oryza sativa) NF-YC基因家族成员可分为5个亚家族。基因复制分析显示, 6个HvNF-YC基因存在片段复制, 3个HvNF-YC基因存在串联复制。启动子顺式作用元件分析显示, 大多数HvNF-YC基因启动子含有与非生物胁迫及激素响应相关的顺式作用元件。对HvNF-YC家族成员在不同组织不同时期的表达模式分析表明, 不同成员的时空表达存在明显差异, 其中HvNF-YC9和HvNF-YC11可能在籽粒发育初期发挥重要作用。通过分析耐盐型和盐敏感型大麦品种根和叶中HvNF-YC表达量变化, 发现HvNF-YC3、HvNF-YC6和HvNF-YC10主要在盐胁迫初期的根中行使功能, HvNF-YC9主要在长期盐胁迫处理后期的根中起作用。综上所述, 推测HvNF-YC9、10、11三个基因可作为后续探究大麦NF-YC参与耐盐作用机制的候选基因。该研究结果为进一步解析HvNF-YC在大麦中的耐盐调控功能奠定了基础。     

小黑杨转录因子PsnbHLH162基因在盐和低温胁迫下应答分析

为揭示小黑杨（Populus simonii × P.nigra）在面对非生物胁迫时,转录因子PsnbHLH162在植物体内发挥的作用,同时探究该基因在植物体内的信号转导过程,进而为未来获取优良的抗逆树种提供理论基础。以小黑杨为原材料,克隆获取PsnbHLH162基因,对目的基因和启动子进行生物信息学分析;之后用150 mmol·L^-1 NaCl、 4 ℃低温分别对野生型小黑杨进行胁迫处理,利用荧光定量PCR,分析基因响应非生物胁迫的功能。结果显示：PsnbHLH162 cDNA基因片段长537 bp,基因N端内含1个高度保守的HLH结构域。该基因表达蛋白是不含跨膜区域的稳定的亲水性蛋白,其定位在细胞核内且没有转录激活活性。启动子区域内含多种ABA应答、生长素应答、光应答和circadian元件,证实此基因参加非生物胁迫应答。荧光定量PCR结果表明在盐胁迫下,与茎、叶组织相比,基因在根组织的表达量最高;在低温胁迫下,与叶、根组织相比,基因在茎组织的表达量最高。发现野生植株内,PsnbHLH162能被盐、低温诱导表达。     

葡萄NCED基因家族进化及表达分析

9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)是植物体内ABA生物合成的关键限速酶, 参与植物对干旱、外源ABA和高盐的响应过程, 降低环境胁迫对植株的危害。基于全基因组鉴定分析葡萄(Vitis vinifera) NCED基因家族成员, 探讨各成员的物种进化关系及各个基因成员在不同组织中的时空表达模式及对干旱、ABA和高盐(NaCl)胁迫的响应, 为进一步揭示该基因家族成员的生物学功能奠定基础。在葡萄基因组中共发现12个NCED基因。其推测的编码蛋白质长度在510 (VvNCED2)-625 aa (VvNCED10)之间。VvNCED蛋白的分子量最大值是70.53 kDa (VvNCED10), 最小值是57.85 kDa (VvNCED2)。在从祖先基因分化之后, 葡萄NCED基因发生了5次复制事件, 同时有2次丢失事件。NCED1/2、NCED3/4、NCED6/7和NCED9/10基因对被认为是通过片段复制产生。上述4对复制基因复制时间分布在3.08-120.0百万年前, 晚于单双子叶植物分化的时间。与对照相比, VvNCED1在ABA处理48小时后显著上调(72.1%), 而VvNCED2显著下调(84.0%)。VvNCED6只在干旱处理14、21和28天的根系中表达量高于对照, 分别为对照的2.49、1.05和1.09倍。VvNCED7只在干旱处理14天的根系中表达量高于对照, 为对照的1.07倍。在ABA处理72小时后, VvNCED3表达量较对照显著下调(59.5%), 而VvNCED4较对照显著上调(169.9%)。VvNCED3/VvNCED4分别在NaCl处理24和48小时出现显著性峰值, 较对照分别上调219.2%和114.4%。保守结构域不同组成和不同胁迫处理下差异表达模式是NCED蛋白发生功能分化的基础。推测NCED在进化过程中发生的功能分化有利于复制事件的发生。     

葡萄NCED基因家族进化及表达分析

9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)是植物体内ABA生物合成的关键限速酶, 参与植物对干旱、外源ABA和高盐的响应过程, 降低环境胁迫对植株的危害。基于全基因组鉴定分析葡萄(Vitis vinifera) NCED基因家族成员, 探讨各成员的物种进化关系及各个基因成员在不同组织中的时空表达模式及对干旱、ABA和高盐(NaCl)胁迫的响应, 为进一步揭示该基因家族成员的生物学功能奠定基础。在葡萄基因组中共发现12个NCED基因。其推测的编码蛋白质长度在510 (VvNCED2)-625 aa (VvNCED10)之间。VvNCED蛋白的分子量最大值是70.53 kDa (VvNCED10), 最小值是57.85 kDa (VvNCED2)。在从祖先基因分化之后, 葡萄NCED基因发生了5次复制事件, 同时有2次丢失事件。NCED1/2、NCED3/4、NCED6/7和NCED9/10基因对被认为是通过片段复制产生。上述4对复制基因复制时间分布在3.08-120.0百万年前, 晚于单双子叶植物分化的时间。与对照相比, VvNCED1在ABA处理48小时后显著上调(72.1%), 而VvNCED2显著下调(84.0%)。VvNCED6只在干旱处理14、21和28天的根系中表达量高于对照, 分别为对照的2.49、1.05和1.09倍。VvNCED7只在干旱处理14天的根系中表达量高于对照, 为对照的1.07倍。在ABA处理72小时后, VvNCED3表达量较对照显著下调(59.5%), 而VvNCED4较对照显著上调(169.9%)。VvNCED3/VvNCED4分别在NaCl处理24和48小时出现显著性峰值, 较对照分别上调219.2%和114.4%。保守结构域不同组成和不同胁迫处理下差异表达模式是NCED蛋白发生功能分化的基础。推测NCED在进化过程中发生的功能分化有利于复制事件的发生。     

辣椒锌指蛋白DnaJ-Like基因家族鉴定及对高温胁迫的表达响应

植物DnaJ-Like锌指蛋白（DNAJE）是近年来发现的一类具有重要功能的蛋白,在光合作用、质体发育与运动和植物抗逆及防御反应中发挥重要作用。基于辣椒全基因组数据,对辣椒DNAJE基因家族（CaDNAJE）进行鉴定,利用生物信息学方法对基因和蛋白特征、比较进化、共线性关系及高温胁迫下基因表达模式等进行分析。结果表明,CaDNAJE基因家族有28个成员,不均匀的分布在10条染色体和3个Scaffold上,氨基酸序列长度为99-470 aa,分子量为10.05-52.26 kD,理论等电点（pI）为4.75-9.64,其编码蛋白主要定位在叶绿体和细胞核中;辣椒、番茄和拟南芥的比较进化分析可将其分为GroupⅠ 和GroupⅡ 2个亚族,同一亚族具有类似的蛋白保守motif和基因结构;CaDNAJE基因启动子区包含大量光响应、激素响应和胁迫应答元件;辣椒与拟南芥DNAJE之间存在10对共线性基因,辣椒种内仅有1对;辣椒不同组织转录组分析发现,GroupⅠ 中多数成员在各组织中均有高表达,而GroupⅡ 中除CaDNAJE2、CaDNAJE9等基因存在高表达外,多数基因表达量都很低甚至不表达;高温胁迫下,辣椒叶片过氧化氢含量急速上升后降低,丙二醛含量持续升高,抗氧化物酶活性也有不同程度的提高。同时,高温诱导热激转录因子Hsf和热激蛋白HSP耐热相关基因及CaDNAJE基因高表达,在不同胁迫时期发挥调控作用。推测CaDNAJE基因家族可能参与辣椒响应高温胁迫,提高其耐受力,以降低细胞损伤。     

木薯MeMYC2.2基因耐低温功能研究

MYC2（MYeloCytomatosis）转录因子是植物应对逆境胁迫过程中茉莉酸信号传导相关的核心转录因子。本研究旨在初步分析木薯MeMYC2.2基因在低温胁迫响应中的功能。利用生物信息学分析木薯MeMYC2.1和MeMYC2.2基因的结构及其编码蛋白的理化性质;通过定量PCR分析了上述2个基因在木薯组培苗叶片中对低温胁迫的响应;通过转基因拟南芥研究MeMYC2.2的抗冻功能。木薯组培苗叶片中2个MeMYC2基因的表达均在低温胁迫早期被诱导,其中,与MeMYC2.1相比,MeMYC2.2差异表达更显著。MeMYC2.2蛋白主要定位于细胞核中,且在酵母中具有明显转录自激活功能,表明该蛋白具有转录因子特性。与野生型相比,过表达MeMYC2.2的转基因拟南芥抗冻能力显著提高。在低温处理下,CBF3基因在转基因拟南芥中的表达量要明显高于其在野生型的表达量,但另外3个CBF基因在转基因拟南芥中的表达量明显下降。木薯MeMYC2.2的表达受低温和茉莉酸调控,可以提高植物的抗冻性,且可能影响CBF基因对低温的响应。本研究为进一步利用MeMYC2基因改良木薯的低温耐受性奠定了理论基础。     

毛果杨nsLTP基因家族全基因组水平鉴定及其表达特性分析

植物非特异性脂质转移蛋白（non-specific lipid transfer proteins,nsLTP）是一类多基因家族编码碱性蛋白,负责脂肪酸体外结和与膜之间的磷脂转移,在植物生长发育和逆境胁迫响应中扮演着重要角色。目前为止,尚无模式植物毛果杨（Populus trichocarpa）nsLTP家族的研究报导。本研究从全基因组水平对PtrnsLTP家族成员的基因数量、亲缘关系、基因结构、编码蛋白保守基序等特性进行了分析,结果表明：PtrnsLTP家族共由39个基因组成,进化成5个亚家族,其中A亚族含有6个基因、B亚族含有2个、C亚族含有13个、D亚族含有3个、E亚族含有15个。PtrnsLTP家族包含7对旁系同源基因,其中1对大于1,6对Ka/Ks均远小于1,且这6对基因均处于同一个大的进化分支上,进化压力的不同导致基因间的功能出现了分化,编码蛋白均含有Motif 1和 Motif 2保守基序。利用qRT-PCR技术并结合杨树转录组数据对PtrnsLTP的组织表达与盐胁迫响应特性研究发现：各家族成员在毛果杨根、茎和叶中均有表达且经qRT-PCR技术验证后与网站预测结果基本吻合,有11、15和13个成员分别在根、茎和叶中有较高的表达,表明该基因家族参与了杨树不同组织的生长发育;NaCl胁迫下,该家族39个基因中分别有26个成员在根部、14个成员在叶部表达量随着胁迫时间的增加而升高,而32个基因在茎部表现为先升高后降低的趋势。本研究结果对于PtrnsLTP家族基因生物学功能的鉴定与盐胁迫响应基因资源的工作有着积极的推动作用。     

拟南芥高迁移率族蛋白B（AtHMGB）族基因启动子的转录激活功能分析

为了解高迁移率族蛋白B族（high mobility group protein B,HMGB）基因调控植物响应低温、高盐和干旱等外源胁迫的表达调控方式, 本文克隆了拟南芥AtHMGB前5个家族成员的启动子区域（PAtHMGB1,PAtHMGB2,PAtHMGB3,PAtHMGB4和PAtHMGB5）.运用基因重组技术将其分别替换表达载体上35S启动子区域获得重组表达载体,利用农杆菌介导法侵染烟草获得稳定表达的转基因烟草. 运用实时定量PCR检测上述5种启动子的转基因烟草,观察在外源胁迫（低温、高盐和干旱）处理前后gusA基因的表达差异,同时检测转基因烟草种子在不同外源胁迫条件下的萌发状况. 检测结果证实,在低温胁迫下,PAtHMGB2,PAtHMGB3和PAtHMGB4正调控gusA基因的表达,而在干旱或盐胁迫下,gusA基因的表达被PAtHMGB2和PAtHMGB3负调控. 种子萌发结果表明,在干旱胁迫下,PAtHMGB2调控下的转基因烟草比野生型烟草萌发及生长迟缓|在低温胁迫下,PAtHMGB2调控的转基因烟草长势明显强于野生型. 本研究克隆了拟南芥AtHMGB家族前5个成员启动子,分析其生物学功能发现,PAtHMGB2在响应低温和干旱胁迫方面效果尤为显著.     

小黑杨转录因子PsnbZIP1应答盐胁迫功能分析

为揭示小黑杨（Populus simonii × P. nigra）在面对非生物胁迫时,转录因子PsnbZIP1在植物体内发挥的功能,以小黑杨为试验材料,克隆得到PsnbZIP1的ORF区序列长为432 bp,并初步分析PsnbZIP1盐胁迫下的分子机制。采用q-PCR分析PsnbZIP1在150 mmol·L^-1 NaCl处理小黑杨组培苗时的表达模式,发现该基因的表达量快速上升;通过生物信息学分析预测PsnbZIP1转录因子为无跨膜结构且具有信号肽的亲水性不稳定蛋白;用农杆菌（Agrobacterium）介导的烟草（Nicotiana）瞬时表达观察该基因的亚细胞定位情况,结果表明该基因为核定位蛋白;用酵母单杂交实验证明该基因编码的蛋白在酵母体内不具有转录激活功能。对PsnbZIP1基因的启动子序列进行分析,结果表明该启动子包含了生长素应答、脱落酸应答元件、光应答元件以及种子特异性调控的顺式作用调控元件,该基因可能在植物的生长发育与响应胁迫过程中发挥了重要作用;启动子还包括参与干旱诱导的MYB结合位点和MYBHv1结合位点,表明该基因有可能与一些干旱诱导相关MYB基因相互作用。     

东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中nce-miR-12220及其靶基因的表达谱

东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae侵染成年蜜蜂导致蜜蜂微孢子虫病。本研究旨在验证东方蜜蜂微孢子虫nce-miR-12220的存在和表达,并检测nce-miR-12220及其靶基因在病原侵染意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica (简称意蜂)工蜂过程的表达谱。Stem-loop RT-PCR和Sanger测序结果显示nce-miR-12220真实存在和表达。靶向预测结果显示nce-miR-12220共靶向KRAB-A和γ tubulin等15个基因。上述靶基因可注释到19个GO条目和3条KEGG通路。RT-qPCR结果显示,相较于接种后1 d (1 day post infection,1 dpi),nce-miR-12220在2 dpi上调表达,而在3-12 dpi阶段总体表现出显著下调表达的趋势。类似地,与1 dpi相比,靶基因KRAB-A在2 dpi上调表达,而在3-12 dpi阶段总体呈下调表达的趋势。另外,与1 dpi相比,靶基因γ tubulin在2-12 dpi阶段总体表现出显著下调表达的趋势。上述结果表明nce-miR-12220与KRAB-A和γ tubulin之间存在潜在的靶向结合和正向调控关系;东方蜜蜂微孢子虫通过下调表达nce-miR-12220抑制KRAB-A的表达进而促进增殖;意蜂工蜂可能通过抑制东方蜜蜂微孢子虫的γ tubulin表达抵御病原侵染。研究结果明确了nce-miR-12220及其靶基因KRAB-A和γ tubulin在东方蜜蜂微孢子虫侵染意蜂工蜂过程中的动态表达规律,为深入探究nce-miR-12220在病原侵染中的功能及调控机制提供了理论和实验依据。     

一株内生砖红镰刀菌促进烟草生长和增强青枯病抗性

课题组前期报道了一株对马铃薯具有促生防病作用的内生砖红镰刀菌Fusarium lateritium (FL617)。为拓展该菌株的应用范围,本研究以同为茄科作物的烟草为研究对象,探究了砖红镰刀菌对其生长和抗病的影响。结果表明,与对照组相比,处理组叶表面积、主根数、叶片数、叶绿素a和叶绿素b含量分别提高了5.0、3.9、1.4、1.3和1.3倍;该结果表明砖红镰刀菌对烟草具有促生作用。生测结果表明,砖红镰刀菌增强了烟草对青枯病的抗病性,其青枯病病情指数下降约30%。植物激素合成相关基因表达模式分析,发现处理组植物激素合成相关基因表达显著上调(1.6-39.9倍);用青枯病菌Ralstonia solanacearum感染寄主植物后分析其水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)和R基因信号相关基因的转录模式,发现与对照组相比,处理组SA、JA相关基因均显著上调(1.2-8.3倍),仅有一个R基因显著下调(50%)。进一步用GFP标记的菌株进行荧光定殖观察,发现植物根系周围簇生着带有绿色荧光信号的真菌菌丝,表明砖红镰刀菌可以定殖于烟草根系。综上所述,推测砖红镰刀菌F. lateritium能够通过定殖于烟草根系介导植物激素、免疫防御相关基因的表达从而影响植株的生长发育和抗病性。     

小麦TaLCD基因的克隆及其对渗透胁迫的调节作用

半胱氨酸脱巯基酶(CDes)可催化降解半胱氨酸(Cys)生成硫化氢(H₂S)。通过克隆小麦(Triticum aestivum)中的L-半胱氨酸脱巯基酶基因TaLCD, 并将其在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中过表达, 探讨TaLCD对渗透胁迫条件下种子萌发和根系生长的影响, 并分析其对干旱胁迫的调节作用。结果显示, 盐胁迫条件下, TaLCD过表达植株种子萌发率显著高于野生型; 甘露醇处理条件下, TaLCD过表达植株的根长也显著高于野生型, 且TaLCD过表达显著提高植株抗旱性。此外, TaLCD过表达植株对ABA更加敏感, ABA处理下TaLCD过表达植株的种子萌发率及根长均显著低于野生型。干旱胁迫下, TaLCD过表达植株胁迫响应基因(COR47、RD29A、RAB18和RD22)及ABA信号途径相关基因(NCED3、HAB1、HAB2、ABI1、ABI2和ABF2)的表达水平均显著高于野生型。因此推测, TaLCD增强植株抗旱和抗盐能力可能依赖于ABA信号途径。     

毛乌素沙地油蒿叶建成成本及相关叶性状沿降水梯度的变化

干旱区植物在如何提高水分利用效率与降低叶建成成本之间可能存在一种权衡。我们假设: 与湿润区植物相比, 干旱区植物能通过调节叶功能性状之间的关系(如通过提高单位面积叶氮含量(N_area)), 实现在相同的叶建成成本下具有更高的水分利用效率。为了验证这一假设, 该研究以毛乌素沙地的广布物种油蒿(Artemisia ordosica)为研究对象, 分析了油蒿叶建成成本沿降水梯度的变化规律及其与比叶面积(SLA)、单位质量叶氮含量(N_mass)、N_area和叶碳稳定同位素比率(δ ¹³C)的关系。结果表明: 油蒿单位质量叶建成成本(CC_m)在不同降水条件下差异不显著, 而单位面积叶建成成本(CC_a)在不同降水条件下虽有显著差异, 但并未随降水减少而明显增加。油蒿CC_m与SLA无显著相关性, 与叶δ ¹³C值呈显著正相关关系。油蒿叶建成成本与N_area呈显著正相关关系, 但这种关系格局在低降水量(264 mm)区与高降水量(310-370 mm)区之间存在策略位移现象——即在相同叶建成成本下, 低降水量区植物比高降水量区植物具有更高的N_area。以上结果表明, 尽管高水分利用效率与高叶建成成本相关, 但与高降水量区植物相比, 低降水量区植物具有较高的N_area并没有导致其叶建成成本增加。     

混合接种球孢白僵菌与摩西球囊霉对烟草促生抗逆影响

利用球孢白僵菌Beauveria bassiana与摩西球囊霉菌Glomus mosseae以单独和混合接种的方式在烟草Nicotiana tabacum苗期进行接种处理,检测烟草苗期和成熟期的农艺性状和生理特性。结果表明：在育苗期,混合接种处理烟苗具有最大的叶长和最大叶宽,与对照相比提高了30.27%和42.98%,球孢白僵菌处理组生物量最大,AM真菌处理组烟草株高最高;在成熟期,混合接种处理组烟草的株高、最大叶长、最大叶宽、茎围、生物量等指标均优于单接种处理,且过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）等抗氧化酶活性最高,丙二醛（MDA）含量最低。球孢白僵菌和AM真菌可协同提高烟草生长和抗逆能力。     

丛枝菌根真菌对烟草香气相关物质代谢的影响

丛枝菌根(AM)真菌能够与植物共生,促进寄主植株营养元素的吸收,提高植株抗逆性,但鲜见其对香气物质代谢作用的报道。本试验研究了AM真菌摩西球囊霉对烟草叶片腺毛和香气相关物质代谢的影响。结果表明: 接种AM真菌能够增加烟草叶片腺毛的密度,并诱导烟草叶片腺体毛状体脂质分泌所必需的腺体特异性脂质转运蛋白基因(NtLTP1)表达量增加;提高香气相关物质绿原酸、茄尼醇和类胡萝卜素含量;同时促进了香气物质合成途径中关键酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)和多酚氧化酶(PPO)活性;诱导香气相关物质代谢关键酶苯丙酰胺转氨酶和多酚氧化酶基因NtPAL和NtPPOE,以及黄酮醇合酶和角鲨烯合酶基因NtFLS和NtTSS表达上调。说明接种摩西球囊霉能够增加香气产生部位腺毛的数量和分泌活性,并促进烟草叶片香气物质的生物合成过程。