发根农杆菌对骆驼刺的转化及转化组织的形态发生

将骆驼刺离体再生苗的茎切段经发根农杆菌A4菌株感染后,在含500mg/L头孢霉素的MS无激素培养基上培养,产生了转化的发根和愈伤组织.转化根在附加2mg/L2,4-D和0.5-1mg/L6BA的MS培养基上培养后,亦可诱导出愈伤组织.在含3mg/L6BA和0.5mg/LNAA的培养基上诱导出了苗的分化.冠瘿碱分析表明,在95%以上的发根和75%的转化愈伤组织及再生植株中都显示了T-DNA的整合和表达.染色体检查发现,约81%的发根细胞具有正常染色体数(2n=18),其余则存在染色体数目的变化,在继代培养一年之后,转化体仍维持旺盛的再生能力.     

发根农杆菌诱导桑树毛状根体系的建立

应用发根农杆菌ACCC10060,以直接接种和共培养2种方法侵染桑树10 d龄子叶,并将2种处理的外植体分别接种于MS+AS(乙酰丁香酮,100 μmol/L)的平板,暗培养2 d后转接至MS+CS(头孢霉素,200 mg/L)平板培养3周,每3 d转接1次以除去其中所含的发根农杆菌菌体,结果2种侵染方法均成功诱导桑树产生毛状根,诱导效率分别为14%和17%.在无激素MS培养基上离体培养除菌后的毛状根,呈现旺盛的生长态势和典型的发状根结构特点.CTAB法提取毛状根基因组并进行PCR检测,结果扩增出了423 bp的rolB基因片段,表明Ri质粒的T-DNA已经成功整合到桑树的基因组中.     

发根农杆菌介导药用甘薯西蒙1号的遗传转化

用发根农杆菌A4分别感染药用甘薯西蒙1号的叶片、茎切段、叶柄等外植体,诱导出毛状根,并对毛状根进行了离体培养.采用L9(34)正交设计法优化甘薯西蒙1号的毛状根诱导条件;PCR扩增检测转化毛状根;用高效液相色谱仪检测了毛状根中咖啡酸的含量.结果表明:转化中茎切段是最合适的外植体,最佳感染时间20 min,共培养最佳时间为2天;PCR扩增检测表明发根农杆菌Ri质粒的T-DNA片段已整合进植物的基因组中;经高效液相色谱仪证实毛状根中含有咖啡酸,含量为0.03792 mg/g.     

发根农杆菌诱导玉米毛状根发生及再生植株

发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)侵染玉米愈伤组织15天左右获得毛状根. 转化根在不含激素的培养基上快速生长, 并表现出典型的毛状根性状. 在含ZT 1.6 mg/L和NAA 0.4 mg/L的MS培养基上, 毛状根再生成完整转化植株. PCR-Southern杂交证实T-DNA已整合入转化株的染色体组.     

基于发根培养体系的甘薯品种抗线虫特性鉴定研究

利用发根农杆菌诱导的甘薯发根体系,鉴定甘薯品种抗线虫的特性。试验在甘薯品种徐薯18、栗子香和鲁78066诱导的发根体系上,接种马铃薯腐烂线虫,六周后调查发根繁殖线虫情况及线虫侵染发根情况,然后评价它们的抗线虫特性。结果表明:培养六周后,线虫在徐薯18、栗子香和鲁78066发根上繁殖倍数分别为8.82,0.76和0.70;在徐薯18发根上观察到多处线虫侵入位点,在栗子香和鲁78066发根上只观察到一处线虫侵入位点;基于以上结果,鉴定徐薯18为易感线虫病品种,栗子香和鲁78066为抗线虫病品种,徐薯18和鲁78066的鉴定结果和发病地自然诱发鉴定结果相一致,栗子香不同于发病地自然诱发鉴定结果。鉴定结果表明:用不同品种的甘薯发根作鉴定其抗线虫特性,具有体系简单、直观方便、重复性好以及不受自然环境影响等优点,进一步完善可以作为植物对线虫病抗性鉴定新的体系。     

发根农杆菌转化怀地黄再生植株

利用发根农杆菌15834菌株感染怀地黄组培苗子叶、叶柄和茎切段,建立了有效的毛状根培养及其植株再生体系。毛状根可直接从受伤的外植体产生,能在无外源激素的1/2MS固体和液体培养基上自主生长,表现出典型的发根特征。用100μmol/L乙酰丁香酮处理对数生长期的农杆菌菌液感染子叶获得了46.7%的最高转化频率;在附加0.2mg/L KT和3.0mg/L 6/BA的1/2 MS培养基上,毛状根能100%形成愈伤组织,51.49%分化出芽;分化芽在1/2 MS培养基上100%生根,形成具有矮化、节间短和根系发达等特征的转化再生植株且移栽后生长旺盛;1个转化毛状根克隆的梓醇含量为0.557mg/g,是鲜地黄梓醇含量的48.5%,是生地鲜重梓醇含量的18%。rolB基因PCR、Southem blot分析、冠瘿碱纸电泳和RT-PCR扩增检测证明农杆菌Ri质粒上的T-DNA整合到怀地黄基因组中并表达。     

4种发根农杆菌对朱砂根组培无菌叶片毛状根诱导的影响

以朱砂根(Ardisia crenata Sims)组培无菌叶片为材料,用4种发根农杆菌菌株(A4、ATCC15834、LBA9402和R1601)分别侵染进行毛状根诱导,比较朱砂根叶片毛状根诱导的最适培养基种类、预培养时间、侵染方式、共培养时间以及不同发根农杆菌的致根能力。研究表明:(1)朱砂根无菌叶片毛状根诱导最适培养基为1/2MS培养基,预培养2d、共培养2d,毛状根诱导率最高(31.87%)。(2)最佳侵染方式以剪好的幼叶和活化好的菌液(100mg/L AS)一起在28℃、180r/min黑暗条件下共振荡8~15min。(3)4种发根农杆菌均能诱导朱砂根叶片毛状根产生,但A4、ATCC15834效果最好,其致根能力大小顺序依次为ATCC15834A4LBA9402R1601。(4)PCR分子鉴定表明,发根农杆菌Ri质粒T-DNA已成功整合到宿主细胞核基因组中。     

发根农杆菌介导的尾巨桉遗传转化体系的建立

发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）的建立对植物功能基因的验证具有重要意义,为了在桉树（Eucalyptus）中建立发根农杆菌介导的遗传转化体系,本研究以不同的发根农杆菌菌株侵染尾巨桉（Eucalyptus urophylla × E. grandis）的叶片和茎段,确定合适的农杆菌菌株和外植体类型,在此基础上开展农杆菌浓度、侵染时间对毛状根诱导的影响。结果表明：采用发根农杆菌菌株MSU440,以叶片为外植体进行发根诱导,最高获得了81.0%的毛状根诱导率,毛状根平均根长达到3.23 cm。在发根农杆菌浓度为OD₆₀₀=0.3、侵染时间为30 min时,共培养48 h后经过20 mg·L^-1卡那霉素筛选培养,通过PCR分子鉴定和GUS染色证实外源基因稳定地整合在桉树毛状根基因组中,转化率达20.2%。初步建立了发根农杆菌介导的桉树遗传转化体系,为桉树基因功能鉴定和进一步的转基因育种奠定基础。     

发根农杆菌转化大豆的研究

本文利用发根农杆菌感染大豆不同外植体,在成熟胚靠近子叶节部位诱导产生毛状根。经冠瘿碱检测表明,毛状根及由此产生的愈伤组织均有甘露碱存在,说明Ri质粒的T-DNA已整合到大豆的转化根及愈伤组织中。转化根再生实验表明,在含NAA和IAA8mg/L的MS培养基上得到不定根的分化,MS和B_3培养基及6％蔗糖对转化丛生芽的诱导有利。转化的丛生芽在MS基本培养基上进一步长成小植株。     

纤维植物罗布麻发根的诱导及植株再生

利用3种发根农杆菌(LBA9402.R601,和R1000)转化纤维植物罗布麻无菌种子苗的根茎叶不同外植体部位,首次诱导其生成发根并实现了直接由发根途径的植株再生.罗布麻发根诱导与所用的发根农杆菌菌株,外植体部位及光周期密切相关.发根农杆菌LBA9402感染罗布麻的根外植体,实现了最高转化率达100%.与LBA9402及R601相比,被发根农杆菌R1000感染的根外植体适合在黑暗环境下培养.其诱导生成的发根密度可达平均每个外植体22条.在不加激素的1/2 MS培养基上,LBA9402和R601诱导产生的发根可以诱导生成不定芽,不定芽诱导率达20%.不定芽切下后,在不加激素的1/2 MS培养基上2周内可以诱导生根.通过聚合酶链式反应(PCR)对发根及再生植株进行了鉴定,证明发根农杆菌的T-DNA插入了植物的基因组.为罗布麻的分子育种建立了稳定的转化及再生体系,为下一步通过转入外源基因改善其农艺性状奠定了基础.