指状青霉cyt b_5和cyt b_5r基因克隆及与cyp51A的共表达

为探究指状青霉细胞色素b5(Cyt b5)与细胞色素b5还原酶(Cyt b5r)在细胞色素P450 CYP51A电子传递方面的功用,研究了指状青霉CYP51A与Cyt b5-Cyt b5r共表达机制;并检测了其对于cyp51A基因表达水平的影响。通过转录组分析筛选并PCR克隆获得了cyt b5与cyt b5r基因,分别命名为HS-Pdcyt b5和HS-Pdcyt b5r。以多基因串联克隆载体p PICZαA为骨架构建了指状青霉共表达质粒ppbr A(p PIC-Pdcyp51A-cyt b5-cyt b5r);电转化法将重组质粒ppbr A导入毕赤酵母X-33中。q RT-PCR分析结果显示,CYP51A与Cyt b5-Cyt b5r共表达后,其基因表达水平升高54%-97%,并维持较长时间(48-72 h)。表明Cyt b5-Cyt b5r系统可将电子高效转移给CYP51A,从而增强cyp51A基因的转录表达。从指状青霉中克隆表达HS-Pd Cyt b5和HS-Pd Cyt b5r蛋白,并通过共表达的方式研究cyp51A基因的功能尚为首次报道。     

不同地理株中肋骨条藻生长特性及RAPD多态性

通过对不同地理株骨条藻形态和亚显微结构的观察和描述 ,鉴定为中肋骨条藻 ,但发现在刺长、细胞间隙、细胞链形态、链上细胞数 ,色素体个数方面存在差别 ;通过不同 N∶ P营养盐实验 ,结果表明 ,在 N∶ P为 16∶ 1时 ,东海株和胶州湾株中肋骨条藻均得到最大生长率 ,分别为 1.6 6 d1 和 1.5 3d- 1 ,东海株中肋骨条藻最大生长率要高于胶州湾株中肋骨条藻 ,这表明在不同的海域环境条件下 ,中肋骨条藻的生长均有各自地域性特征。应用 RAPD技术对两地理株中肋骨条藻进行鉴别 ,以其全 DNA为模板进行 RAPD扩增 ,两不同地理株的中肋骨条藻表现不同的 DNA多态性 ,同样以各自的小亚基片段为模板进行的 RAPD扩增条带也表现出差异性。实验结果表明 ,两株中肋骨条藻应为种下的不同变种或亚种     

夜香树花期荧光定量PCR内参基因的筛选

为筛选夜香树（Cestrum nocturnum L.）香气释放、生物钟等相关基因表达研究适用的内参基因,本研究采用夜香树盛花期叶片和花为实验材料,利用同源克隆和RACE技术,获得了夜香树6种经典的内参基因序列,分别为：Actb7、EF-1A、GAPDH、TUA、TUB2、UBQ;采用荧光定量PCR方法对18s rRNA和这6个内参基因的表达模式进行了分析,并通过Bestkeeper、geNorm、NormFinder 3种程序分析了内参基因的稳定性。结果表明,在花中,Actb7表达最稳定;在叶片中,EF-1A和UBQ的表达比较稳定;在2种组织中,EF-1A的表达相对稳定。3组稳定性分析中,geNorm程序确定的最佳内参基因数目均为2,最佳内参基因组合均为Actb7/EF-1A。本研究通过对稳定内参基因的筛选,以期为准确检测夜香树盛花期花瓣节律运动、香气释放、生物钟变化等相关基因的表达研究奠定基础。     

植物基因表达转录分析中内参基因的选择与应用

管家基因能够在生物体细胞中表达和不断地被转录,对于维持细胞功能发挥重要作用,并在细胞中组成型稳定表达。随着基因表达研究的深入,发现许多管家基因的表达也受到不同程度的调控。选择合适的管家基因作为内参对于准确定量分析目标基因的表达水平至关重要。通过对植物基因表达研究中常用的内参对照基因的表达特性,综述了可以筛选作为内参对照基因的标准和条件的验证。     

太湖新银鱼线粒体D-loop和Cytb片段序列结构与进化速率比较

共获得49个太湖新银鱼(Neosalanx taihuensis)个体的线粒体细胞色素b(Cyt b)全序列和控制区(D-loop)部分序列。所测线粒体D-loop部分序列长度变化范围为648～680bp,识别到位于前端的一个串联重复序列、一个终止相关序列(ETAS),3个中央保守区保守序列(CSB-F、CSB-E、CSB-D)及一个保守序列区保守序列(CSB-1),结构与其他鱼类的研究结果类似。太湖新银鱼线粒体Cyt b和D-loop片段的相对进化速率的比较研究结果表明,太湖新银鱼D-loop总的序列多态性位点的比例为0.83%,低于线粒体Cyt b部分总的序列多态性位点的比例(1.31%)。假设太湖新银鱼Cyt b基因平均进化速率相对值为1,贝叶斯(Bayes)MCMC模拟给出Cyt b基因的相对速率区间估计为1.000±0.131,而D-loop基因的相对速率为0.859±0.261,表明太湖新银鱼D-loop基因的进化速率低于Cyt b基因,同时,后验概率分布的变异方差也比较大。说明Cyt b基因比D-loop基因具有相对较高的进化速率,也相对更接近分子钟假设。因此,可以认为Cyt b基因比D-loop基因更适于太湖新银鱼种内及近缘种间相关分子生态及系统地理格局的研究。     

实时定量PCR评估金针菇的内参基因稳定性

金针菇在中国和日本是最受人喜爱的食用菌之一,在重要栽培食用菌中产销量排名第四。近年来,已在活性物质、分子标记及基因鉴定方面开展了大量工作,但未见有金针菇内参基因稳定性研究的报道,导致金针菇基因表达研究无内源参考基因稳定性数据作为参考。本研究采用geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder 4种软件评估18S核糖体RNA（18S）、28S核糖体RNA（28S）、60S核糖体蛋白L18（Rpl18）、肌动蛋白1（Act1）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（Gapdh）、翻译延伸因子EF1-alpha（Ef1A）、DNA指导的RNA聚合酶亚基2（Rpb2）、细胞色素C氧化酶亚基1（Cox1）及细胞色素b（CytB）等9个内参基因的稳定性。综合分析结果显示,单个基因中Act1基因最稳定,CytB表达稳定性最差,但单个候选内参基因的稳定性不能够满足定量PCR实验要求;根据geNorm软件分析结果,CytB和Rpb2是金针菇定量PCR的稳定内参基因组合。本研究首次评估了金针菇的内参基因稳定性,将为后续的基因表达研究提供参考。     

鼠尾藻对赤潮异弯藻和中肋骨条藻的抑制作用

通过共培养的方法,研究了鼠尾藻（Surgassum thunbergii）培养水的过滤液、新鲜组织、干粉末、水溶性抽提液对赤潮异弯藻（Heterosigma akashiwo）和中肋骨条藻（Skeletonema costatum）生长的抑制效应,建立了分隔共培养系统并证明了抑制物质的存在,排除了细胞直接接触抑制的可能性.结果表明,在共培养实验中,鼠尾藻新鲜组织、干粉末及水溶性抽提液对赤潮异弯藻和中肋骨条藻的生长具有显著的抑制作用,且在较高浓度下对两种赤潮微藻的生长具有致死效应.在一次性及半连续培养方式下,鼠尾藻培养水过滤液对赤潮异弯藻的生长无抑制效应,而对中肋骨条藻的生长具有显著的抑制效应.     

草鱼MYH mRNA表达量分析中采用的内参基因稳定性比较

本研究分别以β-actin、18S rRNA和GAPDH为内参基因,采用实时荧光定量PCR对草鱼早期发育时期肌球蛋白重链(myosin heavy light,MYH)基因的mRNA表达量进行分析,并比较不同内参基因对MYH基因mRNA表达水平检测结果的准确性.研究结果表明,以β-actin和GAPDH作为内参,MYH基因mRNA表达水平完全一致,其表达量从原肠到仔鱼阶段逐次递增,仔鱼与原肠期阶段相比表达量差异显著;当采用18S rRNA作为内参时,MYH基因mRNA在发育阶段的表达量呈不稳定状态.因此,β-actin和GAPDH均可作为内参基因,用于草鱼早期发育中MYH基因mRNA的相对定量研究:而18S rRNA作为内参时,可能会对检测结果造成偏差.本研究不仅准确的揭示了草鱼MYH基因mRNA的表达特征,并且为荧光定量PCR技术在鱼类基因表达研究方面提供了有价值的参考.     

小蔗螟Cytb基因序列的分析研究(鳞翅目:螟蛾总科:草螟亚科)

扩增并测定了小蔗螟线粒体细胞色素b(Cyt b)基因,其序列全长1146 bp,利用分子生物学软件分析了包括小蔗螟在内的4目(鳞翅目、双翅目、鞘翅目、缨尾目)共19条Cyt b基因序列.分析结果显示:鳞翅目昆虫AT含量明显低于其它昆虫,其中小蔗螟AT含量为75.1%;AT含量与A或T碱基使用的偏倚没有明显的相关性;碱基替换主要发生在密码子第三位,并且颠换率远大于转换率;密码子使用频率与基因碱基组成AT偏倚有相关性;相比于核苷酸数据,氨基酸所显示的遗传距离更为准确;使用Cyt b基因构建的系统进化树支持昆虫的单源进化学说.     

猪sall4b基因的克隆及表达分析

sall4基因是sall基因家族的一个成员,在胚胎发育、器官形成和干细胞多能性的维持以及重建中都起到重要作用,有sall4a和sall4b两种剪切突变体类型。目前猪的sall4基因序列尚未获得。鉴于其在多能性细胞调控中的作用,对猪的sall4基因进行了克隆测序,并对其在各组织及胚胎中的表达进行了初步研究。通过5和3 RACE克隆得到猪sall4基因cDNA全长序列(2 372 bp),序列分析证明此基因编码的蛋白结构更接近于小鼠和人Sall4B亚型,同源性可达70%～80%,而与其他物种的Sall4A相比则缺少一段含锌指结构域的片段,同源性降至30%～55%。Real-time PCR证明猪sall4b基因广泛表达于猪的各种器官,其中除卵巢组织呈高量表达之外,脾、肺、心和睾丸表达量也相对较高;在早期胚胎发育过程中除4-细胞阶段相对表达量较低,其他阶段呈高量表达。免疫荧光跟踪Sall4在猪早期胚胎中的表达情况发现Sall4在着床前胚胎中全程表达并定位于细胞核中,在囊胚阶段基因表达趋向于定位在内细胞团中。表达分析证明sall4b基因与多能性紧密相关,预示着猪sall4b基因将可能作为新的重编程因子用于诱导猪多能干细胞的体系中。