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1.
人GM—CSF cDNA的克隆和在大肠杆菌中的表达 总被引:3,自引:0,他引:3
从诱导的人胚肺细胞HFL株中提取总RNA.经RT-PCR反应获取了人GM-CSFcDNA,DNA序列测定表明其顺序与文献报道完全一致。为了获得高效表达,应用PCR改造了人GM-CSF的cDNA5’端核苷酸序列,并将改造的人GM-CSF基因插入含T7启动子的质粒pET-11d构建成表达质粒pETC-5,将此质粒转化大肠杆菌株BL21(DE3)得到表达菌株BLEC4。表达菌株用0.5mol/LIPTG诱导2小时后,产生大量重组蛋白并形成包涵体。SDS—PAGE电泳图谱扫描结果表明,rhGM-CSF产量占菌体总蛋白量的16%。ELISA和TF-1细胞培养测定表明,初步纯化和复性的rhGM-CSF具有天然的hGM-CSF生物活性。 相似文献
2.
利用DNA重组技术,将转录因子NF-κBp50基因片段插入pGEX-2T质粒载体,经DNA序列分析证明克隆的正确性.将重组的pGEX-2T/p50转化入大肠杆菌JM109,表达出pGEX-2T/p50融合蛋白.经WesternBlot检测证实表达产物对抗p50c的抗体呈特异性反应,表明克隆的正确性,并成功地应用纯化的p50蛋白制备了免疫血清.为进一步对NF-κB的功能进行研究打下了良好的基础 相似文献
3.
用PCR法扩增出编码人FAS分子胞外区的cDNA片段,直接克隆到pGEM-T载体上,经DNA序列测定后,再插入到谷胱甘肽转硫酶(GST)融合蛋白表达载体pGEX-KG的EcoRⅠ和SalⅠ位点之间,构成重组质粒pKG-hFAS,将此质粒导入大肠杆菌,经IPTG诱导后获得GST-hFAS重组融合蛋白的表达,用谷胱甘肽偶联的Sepharose4B经亲合层析获得纯化的GST-hFAS蛋白,经凝血酶酶切和二次亲合层析去除GST部分,得到纯化的FAS蛋白.用纯化的FAS抗原免疫家兔制备了抗FAS抗体,经检测发现抗FAS抗体能诱导U937细胞发生细胞凋亡 相似文献
4.
根据基因库中的顺序,设计了胶质细胞源神经营养因子(GDNF)基因的PCR引物,以此从人基因组DNA中扩增并克隆了GDNF的编码序列,经DNA测序确认后,该片段克隆到表达质粒pET-3a中,转化大肠杆菌BL21(DE3).培养的重组菌经IPTG诱导,在T7启动子调控下表达出hGDNF蛋白.经电泳分析表明GDNF主要存在于细菌包涵体中.从培养菌中制备包涵体,经充分洗涤,溶解于含8mol/L尿素的变性缓冲液中.经SP-Sepharose柱层析分离,梯度洗脱,以15%SDS-PAGE检查含GDNF的部分.将含单体GDNF部分进行复性,再次用SP-Sepharose离子柱分离同源二体GDNF.最后经SDS-PAGE制备电泳纯化,纯度大于95%.经N端测序表明序列正确.经测定,每升培养菌可得约10mg纯化的GDNF. 相似文献
5.
6.
血管内皮细胞生长因子受体Flt—1胞外区基因的克隆及其在中国仓?… 总被引:1,自引:0,他引:1
朋原代培养的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)提取细胞总RNA,采用逆转录PCR(RT-PCR)方法得到VEGF受体Flt-1胞外区前3个IgG样区域cDNA片段(Flt-1n3)。将获得的受体基因克隆到真核表达载体pcD-NA3.1中,得到重组质粒pcDNA3.1/Flt-1n3,通过南体转染方法将其转入中国仓鼠卵巢细胞(CHO),用G418筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞砍隆。经固相结合实验筛选 相似文献
7.
利用PCR技术并进行DNA序列测定,从人脑cDNA库中扩增得到人豆蔻酰CoA蛋白N端豆蔻酰转移酶的编码基因,构建其在T7启动子控制下的成熟型和His6融合型的表达质粒pMF-hNMT3和pMFHT-hNMT2。转化大肠杆菌BL21(DE3),进行IPTG诱导表达研究。SDS-PAGE分析结果显示,在37℃条件下表达的各种重组hNMR几乎全是不溶性产物,但在较低温度条件下表达的His6-hNMR绝大 相似文献
8.
粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子/白细胞介素—3融合蛋白的表达研究 总被引:1,自引:1,他引:0
利用PCR扩增得到粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-3(IL-3)完整基因片段,将其分别克隆pGEM-T构建成GM-CSF/IL-3融合蛋白基因,DNA序列与设计预期一致。将得到的融合蛋白基因克隆对72RNA聚合酶表达载体pT7zz,得到表达质粒pFu,经转化至表达宿主E.coli BL21(DE3),在IPTG诱导下获得融合蛋白目的产物的直接表达。经SDS-PAGE电泳鉴 相似文献
9.
采用聚合酶链反应(PCR)技术和DNA体外重组方法,克隆出579bp的丙型肝炎病毒(HCV)NS4b基因片段,插入到原核高效表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET/NS4b,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导培养后,获得了目的蛋白的高效表达。SDS-PAGE分析显示在30kD处有一条表达的目的蛋白区带。通过固定化金属配体亲和层析(IMAC)纯化目的的蛋白,ELESA检测结果表 相似文献
10.
利用RT-PCR技术成功地从人胎盘组织中克隆了膜联蛋白V的cDNA,测序分析表明,与文献报道的核苷酸序列完全一致,交膜联蛋白V的cDNA克隆进T7启动子控制下的表达质粒pET-24a(+)中,经大肠杆菌BL1(DE3)后,经IPTG诱导可高效表达分子量为36kD的膜联蛋白V蛋白,表达产物以可溶形式存在。表达产物占菌体总蛋白的38%左右。表达产物经肝素亲和层析纯化后具有明显的延长部分凝血活酶时间的作 相似文献