基于高通量和传统培养法分析白首乌根际真菌多样性

探讨白首乌根际土壤真菌群落组成结构与分布规律,为优选根际促生菌、提高仿野生种植技术提供科学理论依据。综合Illumina MiSeq高通量测序技术和传统分离培养技术,分析测定3个产地2个根茎深度的白首乌根际土壤真菌群落的丰富度和多样性,分离鉴定可培养根际真菌的种类。6个样品共得到真菌1 589个OTUs,分属于11门35纲84目142科237属,子囊菌门（Ascomycota）和被孢霉门（Mortierellomycota）是样品共同的优势菌门;6个样品通过传统培养法共分离得到103个形态型,分为3门8纲10目12科16属37种,优势菌属为木霉属（Trichoderma）和镶刀菌属（Fusarium）。综合比较,高通量测序技术可以得到更全面的菌落数据,传统分离培养技术可以纯化出适应性强的菌株;不同产地和根茎深度样品间土壤真菌群落存在显著差异性。     

口腔未培养微生物分离培养策略的研究进展

口腔微生物是人体微生物组的重要组成部分,其群落组成丰富且独特。现有研究显示,口腔微生物与龋病、牙周炎等口腔健康问题有直接的联系,因而具有重要的研究价值。随着高通量测序技术的发展,人们对口腔中未培养微生物多样性的认识不断加深,这进一步催生对微生物分离培养技术需求的增加。为此,本文将围绕口腔未培养微生物及其分离培养策略的研究进展,首先介绍口腔中未培养微生物的研究现状;其次分析口腔微生物分离培养中可能的限制因素;最后综述微生物分离培养技术发展及其在口腔未培养微生物研究中的应用。全文旨在为口腔未培养微生物的分离培养提供思路和技术参考。     

未培养微生物研究策略概述

基于未培养微生物数量巨大、种类繁多、基因资源丰富等特点。扼要介绍了未培养微生物的纯培养分离策略和分子生物学研究方法。随着新型培养策略如原位仿生境培养、限制性培养、单细胞微操作等的出现,使未培养微生物的纯培养成为可能。同时由于宏基因组学和高通量DNA测序等现代分子生物学方法技术的逐渐成熟,使来源于未培养微生物的新基因和新活性物质的分离筛选出现了新的机遇与挑战。     

未培养微生物分离培养技术研究进展

自然环境中的微生物具有多样性高的特点,而99%的微生物使用传统的方法仍然是"不可培养的",并且能被培养的小部分微生物不能够代表微生态的多样性。因此,确定新的微生物物种和功能仍然是目前的重要任务。本文将综述基于调整培养基、考虑微生物间相互作用、捕获分离培养、高通量分离培养来分离培养微生物群体中的未培养微生物的方法,及功能性研究的进展情况。     

高通量测序分析环保肥料增效剂对马铃薯根际土壤真菌多样性变化影响

【目的】高通量测序技术对研究环境样品中微生物群落组成具有很大的应用价值。土壤微生物群落结构和多样性及其变化在一定程度上反映了土壤的质量。旨在从微生物群落结构的角度阐述环保肥料增效剂对马铃薯根际土壤主要真菌类群结构的影响。【方法】通过高通量测序结果对比分析应用增效剂前后马铃薯根际真菌宏基因组ITS1区,并依据RDP中设置的分类阈值对序列进行物种分类。【结果】测序结果经过质量控制,共获得有效条带437 375条,依据97%的序列相似性做聚类分析,获得全部样品的可分类操作单元(OTUs)共633个。子囊菌的总体数量在所有样品中最多(相对丰度在56.95%-97.23%之间),且处理后呈增加趋势(HY除外),而担子菌门数量在处理后呈下降的趋势。基于真菌ITS1高通量测序结果获得的α指数显示,样品内部处理和对照之间真菌物种多样性有差别。基于真菌ITS1高通量测序获得的β指数显示,处理组与对照组的真菌多样性之间没有差别,这表明真菌多样性之间的差异更多地取决于样品采集地点。【结论】土壤特性是影响真菌种群的重要因素之一,环保肥料增效剂显著改善了土壤真菌的种群结构。     

紫茎泽兰内生真菌及其根际土壤真菌的多样性研究

采用传统分离培养技术和高通量测序技术, 系统研究了入侵植物紫茎泽兰不同组织内生真菌及其根际土壤真菌的物种组成差异。培养法选用三种培养基, 从其根、茎、鲜叶、腐叶等组织片段和根际土壤分离获得了140个菌株。这些真菌在97%的ITS序列同源水平下分划为43个OTUs (operational taxonomic units), 属于5个纲、30个属, 优势纲为Sordariomycetes和Dothideomycetes, 各占总分离菌株数的52.86%和30.00%。前6个优势属分别为Diaporthe(23.57%)、Stagonosporopsis(10.71%)、Phialophora(8.57%)、Colletotrichum(6.43%)、Alternaria(5.71%)、Penicillium(5.71%), 占总分离菌株数的60.71%; 不同植物组织之间以及根际土壤之间的真菌群落组成差异明显, Shannon多样性指数在1.37—2.46之间。高通量测序获得了112802个序列, 在97%的ITS序列同源水平下划分为个4216个OTUs, 前6个优势种属分别为Rachicladosporium(19.81%)、Mycosphaerella(11.18%)、Aureobasidium(5.10%)、Agaricus (4.75%)、Alternaria(3.27%)、Delicatula(2.58%), 占测序数的46.69%, Shannon 指数在0.98—4.84之间。两种方法获得的真菌群落组成具有显著差异, 仅Alternaria为共有优势属,但所揭示的不同分离来源的真菌组成情况是一致的, 即植物根、茎、鲜叶、腐叶之间内生真菌群落组成差异明显, 具有组织特异性。根际土壤与根内生真菌群落组成存在一定程度的相似, 说明两者之间联系紧密。研究结果表明, 紫茎泽兰的内生真菌具有较高的多样性, 高通量测序技术能更加全面地反映植物内生真菌的物种组成及多样性信息。     

真菌资源与多样性专刊序言

正"地球上有多少物种?"是最具挑战性的前沿科学问题之一。真菌是仅次于昆虫的第二大生物类群,据估计自然界中真菌有220万到380万种,目前已经描述的真菌仅约12万种,不超过总数的8%。现代的高通量测序技术运用于真菌多样性的研究揭示自然环境中蕴含的真菌多样性甚至可能远远高于我们原先的估计。对于真菌多样性的研究,仍任重道远。我国对真菌的认识     

未培养微生物原位培养技术研究进展

近几十年来,可培养微生物被不断重复培养和筛选,从中分离结构新颖、活性显著的化合物越来越困难,而这些可培养微生物却仅占微生物总数的1%。未培养微生物是指迄今为止在实验室中还无法纯培养的微生物(占99%)。为了解决未培养微生物问题,科学家们突破了传统的培养方式建立了新型原位培养技术。文章详细介绍了未培养微生物在自然环境中的多样性及重要性、微生物不可培养的原因,重点介绍研究策略以及基于原位培养技术原理发展起来的5种未培养微生物培养分离方法,指出了未培养微生物培养技术的发展方向以进一步促进难培养微生物资源的开发与利用。     

广西蚕沙细菌组成多样性解析和VBNC菌群的发掘

【目的】解析广西蚕沙中细菌群落组成与多样性,为蚕沙中菌种资源发掘和蚕沙的综合利用提供科学依据。【方法】通过高通量测序技术研究细菌群落组成特征,同时利用常规稀释涂布平板法和基于复苏促进因子(Rpf)的MPN培养系统解析并筛选蚕沙中可培养和活的非可培养(VBNC)状态的优势菌群,并经16SrRNA基因测序对筛选得到的菌株作初步分类鉴定。【结果】高通量测序表明,广西蚕沙样品中细菌归属于10个门、18个纲、27个目、57个科、96个属,其中4个属的丰度达1%以上,优势菌群为变形菌门(Proteobacteria)肠杆菌属(Enterobacter);通过稀释涂布平板法共获得14个属的33株可培养细菌,其中4个属(Citrobacter、Weissella、Chitinophaga、Pseudoclavibacter)在高通量测序中未被检测到;而在MPN培养系统中,基于复苏促进因子的处理组细菌总数最大检出丰度提高了100倍,并从中共检出21株对Rpf敏感的VBNC菌株,其中6个属(Paenibacillus、Caulobacter、Roseomonas、Pantoea、Erwinia、Acinetobacter)为传统分离法中未能获得的菌属,2个属(Paenibacillus和Caulobacter)在高通量测序中未被检测到。【结论】蚕沙细菌多样性丰富,不同方法解析蚕沙细菌组成多样性存在一定差异,而且通过添加Rpf首次发现了蚕沙中存在大量过去未被认知的VBNC状态细菌,其中从16S rRNA基因序列同源性推测有3个VBNC菌株为潜在新种。此研究结果为深入挖掘蚕沙中微生物资源提供了新的视角与途径,为蚕沙的综合处理提供了研究基础。     

环磷酸腺苷对太湖界面沉积物可培养细菌多样性的影响

【背景】环境细菌可培养率只有1%,菌间的信息交流是限制培养效率的一个重要原因。细胞间信息传递的"第二信使"——环磷酸腺苷(cAMP)是细菌感知和应对外界变化时使用广泛的物质。【目的】研究cAMP诱导培养下的细菌种群组成变化,以探讨对微生物可培养性的影响,为提高细菌可培养率和菌种资源开发提供参考。【方法】以太湖沉积物为对象,结合高通量测序和分离培养方法解析样品中细菌的多样性。【结果】高通量测序的物种组成分析结果表明,cAMP作用下诱导出60个不同于对照组的OTU(Operational taxonomic unit),其中显著差异的是变形菌门和拟杆菌门,前者提高4.08%,后者降低3.36%,非常显著差异的是疣微菌门。在属分类水平有8个显著差异的菌属,2个非常显著差异的菌属(气单胞菌属和Trichococcus)。分离培养结果显示,cAMP诱导下CFU(Colony-forming unit)提高至1.6倍,诱导培养出微小杆菌属(Exiquobacterium)、微杆菌属(Microbacterium)、热单胞菌属(Thermomonas)、Lacibacter、Pedobacter、Massilia、Kocuria和Arthrobacter。【结论】从高通量结果可知cAMP对变形菌门的菌株生长有显著促进作用,而分离培养结果表明,cAMP提高微小杆菌属、微杆菌属、热单胞菌属、Lacibacter、Pedobacter、Massilia、Kocuria和Arthrobacter的可培养性。     

卷柏内生真菌多样性研究

为探究蕨类植物内生真菌的多样性,本研究采用可培养方法分离江西龙虎山和广东丹霞山的岩壁常见蕨类植物——卷柏的内生真菌,结合形态特征和ITS序列进行菌株鉴定、研究多样性。结果表明：从1 080个组织块中,共分离出234株菌株,卷柏内生真菌的总定殖率为18.98%,总分离率为21.67%。根据分离频率,毛壳菌属Chaetomium（26.50%）、青霉属Penicillium（18.38%）、棒束孢属Isaria（11.97%）、曲霉属Aspergillus（9.42%）为优势属。不同居群地春季卷柏的内生真菌多样性存在差异,龙虎山的分离率为34.72%,而丹霞山仅为6.39%,其优势属也不尽相同。对龙虎山不同季节的卷柏内生真菌多样性研究表明,春季的分离率为34.72%,高于冬季的23.89%,春、冬两季之间的真菌类群相似性系数仅为0.39,差异显著。研究结果将有助于进一步揭示丹霞地貌地区蕨类植物内生真菌物种组成及其影响因素。     

西藏昆诺阿藜种子可培养内生真菌多样性

探究西藏不同地区昆诺阿藜种子内生真菌的物种组成、多样性等群落结构特征,丰富昆诺阿藜种子相关微生物的可利用资源,对于微生物资源利用和昆诺阿藜病害的生物防控具有重要意义。本研究收集西藏不同海拔3个地区(日喀则、拉萨和林芝)的昆诺阿藜种子,利用传统分离方式进行了真菌的培养。从46份昆诺阿藜种子中共分离出947株真菌,经ITS序列分析结合形态观察鉴定为1门9目12科26属77种。所有的真菌都归类为子囊菌门Ascomycota,菌株数量相对丰度最高的3个属为链格孢属Alternaria (40.2%)、镰刀菌属Fusarium (17.4%)和茎点霉属Phoma (13.9%)。按照多样性指数,日喀则地区的昆诺阿藜内生可培养真菌的多样性明显高于拉萨和林芝两个地区。     

Fungal communities in mycorrhizal roots of conifer seedlings in forest nurseries under different cultivation systems, assessed by morphotyping, direct sequencing and mycelial isolation

Fungi colonising root tips of Pinus sylvestris and Picea abies grown under four different seedling cultivation systems were assessed by morphotyping, direct sequencing and isolation methods. Roots were morphotyped using two approaches: (1) 10% of the whole root system from 30 seedlings of each species and (2) 20 randomly selected tips per plant from 300 seedlings of each species. The first approach yielded 15 morphotypes, the second yielded 27, including 18 new morphotypes. The overall community consisted of 33 morphotypes. The level of mycorrhizal colonisation of roots determined by each approach was about 50%. The cultivation system had a marked effect on the level of mycorrhizal colonisation. In pine, the highest level of colonisation (48%) was observed in bare-root systems, while in spruce, colonisation was highest in polyethylene rolls (71%). Direct internal transcribed spacer ribosomal DNA sequencing and isolation detected a total of 93 fungal taxa, including 27 mycorrhizal. A total of 71 (76.3%) fungi were identified at least to a genus level. The overlap between the two methods was low. Only 13 (13.9%) of taxa were both sequenced and isolated, 47 (50.5%) were detected exclusively by sequencing and 33 (35.5%) exclusively by isolation. All isolated mycorrhizal fungi were also detected by direct sequencing. Characteristic mycorrhizas were Phialophora finlandia, Amphinema byssoides, Rhizopogon rubescens, Suillus luteus and Thelephora terrestris. There was a moderate similarity in mycorrhizal communities between pine and spruce and among different cultivation systems.Electronic supplementary material Supplementary material is available for this article at and accessible for authorised users     

Activity of dehydroabietic acid derivatives against wood contaminant fungi

The antifungal activity of 10 dehydroabietic acid derivatives with different configuration in A and B rings (cis/trans A/B junction) and different substituents and/or functionalities was evaluated in bioassays in vitro and in situ (pine wood blocks).

The test compounds dissolved in acetone were assayed at several concentrations w/w (test compound/culture medium) against the fungi. The Relative Inhibition (RI) was determined by measuring the radial growth of colonies of the fungi treated with the test compounds by comparison with those of control cultures; the results are expressed as EC₅₀.

The results of bioassays in vitro have shown that hydroxyl and aldehyde functions are required for antifungal activity in this group of compounds and deisopropylation can increase the activity. Our assay of antifungal activity in situ (in pine wood blocks) provides a means to investigate the preservative activities of these antifungal compounds under actual conditions of use.

The dehydroabietic acid derivative cis-deisopropyldehydroabietanol (10) inhibited the growth of several of the fungi tested, in vitro and in situ.

The results obtained in situ with the test compound (10) at 6% and 8% were not significantly different from the reference products and a good level of protection of the wood against the organisms tested was achieved.

The results in wood bioassays present new possibilities in the search for natural new compounds in the wood protection, as an alternative to conventional fungicides.     

套袋与未套袋苹果果实表皮及心部真菌种群结构与变化动态

2011年在山东海阳,2013年在蓬莱和栖霞选取当地常规管理的苹果园,采用传统组织分离法对套袋苹果、未套袋苹果的果实表皮及心部组织进行真菌分离并进行形态学和分子生物学鉴定。对不同时期采集的套袋及未套袋果实表皮与心部的真菌种类、菌落数量、组织分离率、多样性、相似性系数、相对分离频率等指标进行统计分析。结果表明,两个年度内从果实表皮共分离获得真菌43属,从心部获得真菌31属,相对分离频率较高的真菌包括：链格孢Alternaria spp.、枝状枝孢Cladosporium cladosporioides、镰孢菌Fusarium spp.、青霉菌Penicillium spp.等。研究结果表明：果实套袋后,在果实表皮定殖真菌的种类减少,多样性降低,而数量增加,组织带菌率升高;随果实生长,套袋果实表皮上的真菌种类与未套袋果实表皮真菌种类的相似度逐渐降低;7、8月份,套袋果实表皮上真菌种类明显减少,至8月底,套袋果实表面只有链格孢等少数几种优势真菌定殖。果实套袋后,定殖于果实心部的真菌种类和数量有所波动,套袋果和未套袋果上所分离真菌的相似度有所降低;5月底自果实心部分离真菌的种类和数量与9月底所分离真菌的种类和数量差异不大。     

广东兰科植物多样性保育现状

为了使广东省的兰科植物及其遗传多样性得到有效的保育, 保存我国重要野生植物资源, 在2017-2019年间, 采用样线和样地相结合的调查手段、专家快速评估和野外调查相结合的评估技术以及Wilcoxon符号秩检验和Friedman检验的统计方法, 对广东省自然分布的兰科植物进行了全面的调查和濒危等级评估, 并对其在广东省自然保护区中的就地保育情况和全国植物园中的迁地保育情况进行了综合分析。结果表明, 广东省分布有兰科植物80属235种, 其中广东特有种20种; 广东兰科植物受威胁物种有186种, 其中极危11种、濒危114种、易危61种; 就地保育的兰科植物有111种, 迁地保育的兰科植物有156种, 就地和迁地共同保育的兰科植物有96种, 保育的有效程度较低; 另外, 就地、迁地、就地和迁地共同保育的兰科植物之间没有体现出明显的差异, 保育工作缺乏选择性和针对性。基于此, 我们建议广东兰科植物的保育工作应重视基础数据的收集和持续的野外监测、提高保育物种的数量、优化迁地保育物种的选择性和针对性、完善迁地保育和就地保育之间的协同性, 同时也应重视立法和公众教育, 并构建广东兰科植物保育的网络系统。     

试论植物园功能变迁与中国国家植物园体系建设

植物资源是自然生态系统的基本组成部分, 是经济社会可持续发展的重要物质来源, 植物多样性是关系到国家生态安全和生物安全的战略资源。就地保护和迁地保护是植物多样性保护的两种主要方法, 构建以国家公园为主体的自然保护地体系是就地保护的主要形式, 构建以国家植物园为引领的植物园体系是迁地保护的主要形式, 二者相辅相成, 共同形成我国较为完整的植物多样性保护体系。通过建设国家植物园体系对我国植物多样性进行迁地保护, 同时开展科学研究、园林展示、科普教育和资源开发利用, 对深入推进生态文明建设和高质量发展具有重要意义。本文回顾了植物园的功能变迁、全球和中国植物园分布与数量以及植物迁地保护现状,讨论了植物园与植物迁地保护的关系, 在此基础上, 提出了我国国家植物园的定义及设立标准, 进而讨论了建设国家植物园体系的意义、挑战、统筹迁地保护和就地保护等问题, 最后提出了我国国家植物园体系的建设目标、管理体制、空间布局和认证等方面的建议, 以期为我国的国家植物园体系建设提供参考。     

白及根部内生真菌多样性研究

白及是地生兰科多年生草本植物,是常见的中草药之一。白及根是白及植株吸收养分和水分的主要场所,开展其根部内生真菌的群落组成及多样性分析,对了解云南原生境白及与根部内生真菌间的共生关系具有重要意义。本研究采用形态学和ITS rDNA分子系统发育分析相结合的方法进行菌株鉴定。结果表明,3个采样点的白及根部分离到可培养内生真菌32株,包括9个目、13个科、16个属。其中木霉属Trichoderma、镰刀菌属Fusarium、拟盘多毛孢属Pestalotiopsis为优势类群,分别占总物种数的21.88%、18.75%、9.38%;中碳垫菌属Nemania、丛赤壳属Nectria、炭角菌属Xylaria、紫霉属Purpureocillium、刺盘孢属Colletotrichum、黑孢子菌属Nigrospora、Biscogniauxia、腐质霉属Humicola、脉孢菌属Neurospora、拟茎点霉属Phomopsis、植物腐霉Phytopythium、毛霉属Mucor、伞状霉属Umbelopsis为常见内生真菌类群。α多样性指数分析表明：各采样点的白及根部内生真菌物种多样性最高的是昆明市水源保护区采样点（D=0.799,H’=1.698）,保山市龙陵县采样点物种多样性最低（D=0.787,H’=1.580）。β多样性分析采样点之间的Jaccard（0.912-0.993）、Bray-Curtis（0.838-0.986）和UniFrac（加权0.618-0.631;不加权0.770-0.799）距离,结果表明3个采样点之间的内生真菌群落组成存在差异。3个采样点的不同地理环境和土壤类型给白及提供了不同的生境条件,是影响白及根部内生真菌物种丰度和群落组成差异的主要因素之一。     

青岛胶州湾四种类型湿地AM真菌多样性

对青岛胶州湾4种类型湿地（盐田、滩涂、湖泊和河口）中芦苇Phragmites communis、香蒲Typha orientalis和碱蓬Suaeda glauca 根围土壤中丛枝菌根（arbuscular mycorrhizal,AM）真菌进行孢子分离与鉴定,分析湿地生态系统中植物根围AM真菌群落特征。共分离到AM真菌5属10种,包括斗管囊霉属Funneliformis 2种、无梗囊霉属Acaulospora 3种、近明球囊霉属Claroideoglomus 2种、球囊霉属Glomus 1种、巨孢囊霉属Gigaspora 2种,其中,斗管囊霉属Funneliformis及地斗管囊霉Funneliformis geosporum的分离频度和相对多度最高,分别为湿地中AM真菌优势属和优势种。滩涂和河口湿地中植物AM真菌侵染率显著高于湖泊和盐田湿地植物,AM真菌孢子密度以滩涂湿地最高（572个/20mL）,湖泊湿地最低（220个/20mL）;滩涂湿地的种丰度和Shannon-Wiener指数最高,分别为3.8和1.2。从植物种类来看,AM真菌侵染率总体呈现出香蒲>碱蓬>芦苇,AM真菌孢子密度以香蒲最高,芦苇最低,植物种类对AM真菌种丰度和Shannon-Wiener指数影响不显著（P>0.05）。二因素方差分析和典型RDA相关分析表明,寄主植物种类对AM真菌孢子密度有一定影响,但湿地类型对AM真菌多样性的影响更为显著（P<0.05）,胶州湾湿地土壤因子Ca ²⁺、速效P含量与AM真菌孢子密度、物种丰度和多样性指数显著负相关,而速效K、Na ⁺、pH与其显著正相关。结果表明植物种类主要影响AM真菌孢子密度,AM真菌多样性受植物种类和湿地类型综合影响,滩涂湿地较丰富的AM真菌多样性可能与该湿地较良好的理化性质有关。     

卵孢小奥德蘑覆土真菌群落特征及其影响因素

卵孢小奥德蘑Oudemansiella raphanipes是一类依赖覆土栽培的食用菌。本文采用Illumina MiSeq高通量测序技术结合生态学及统计学分析方法研究卵孢小奥德蘑覆土真菌群落特征和影响因素。结果表明,与原始覆土内真菌群落相比,种植卵孢小奥德蘑后的覆土内真菌群落多样性显著下降;在组成方面,虽然优势菌门仍为子囊菌门Ascomycota,但其中的Cladosporium、Acremonium、Gibberella和Emericellopsis等属的相对丰度有所降低,而隶属于被孢霉门Mortierellomycota的Stilbella、Neocosmospora、Pseudogymnoascus和Preussia等属的相对丰度呈增加趋势。卵孢小奥德蘑覆土真菌以腐生营养型为主,与原始覆土相比,种植卵孢小奥德蘑后的粪生营养型真菌和木腐菌呈增加的趋势;进一步研究发现pH、速效钾、速效磷和总氮等覆土土壤理化性质显著影响真菌群落的多样性和结构,pH和速效钾含量与真菌群落的丰富度和多样性呈显著负相关关系。研究结果为深入解析卵孢小奥德蘑覆土微生态机制奠定基础。