小鼠肠道菌群的多样性不因大肠埃希菌O157:H7感染而降低

目的探讨大肠埃希菌O157∶H7感染对小鼠肠道菌群的影响。方法采用大肠埃希菌O157∶H7菌悬液,灌胃制备感染小鼠。随后测定小鼠的生长情况和死亡率;收集肠道菌群,DGGE检测小鼠个体间肠道菌群的变化,高通量测序检测组间感染小鼠肠道菌群的变化。结果大肠埃希菌O157∶H7感染小鼠与正常对照组小鼠相比,小鼠体重、死亡率差异无统计学意义。DGGE结果显示,在不同小鼠个体之间,它们的肠道细菌的种类和数量存在明显差异。高通量测序结果显示,大肠埃希菌O157∶H7感染小鼠肠道菌群的多样性高于对照组,但优势菌的丰度有显著变化。结论大肠埃希菌O157∶H7感染,尽管极大改变了小鼠肠道优势菌群的比例,但没有降低其多样性。另外,小鼠个体间肠道菌群多样性的差异在微生态研究中不容忽视。     

口服肝素与小鼠肠道菌群的相互作用

口服肝素药物的开发需要系统地理解口服肝素与肠道菌群之间的互作过程。通过荧光体视镜观察荧光素标记的肝素经小鼠口服后在体内的分布情况,利用高效液相色谱法检测肝素在模拟胃肠液中的稳定性和体外培养肠道菌群模拟肠道菌对肝素的降解作用,发现口服肝素主要分布在小鼠胃肠道内,在体外模拟胃肠液条件下肝素结构稳定,但能够被添加肝素的厌氧培养基培养后的肠道菌群降解。为了进一步揭示口服肝素对健康小鼠肠道菌群的影响,利用Illumina MiSeq高通量测序技术测定口服肝素后C57BL/6J小鼠粪便菌群的16S rRNA序列,与口服生理盐水的小鼠粪便菌群进行对比,发现口服肝素的小鼠粪便菌群的生物多样性降低;在门水平上,菌群结构差异不显著;而在属水平上,别样杆菌属Alistipes、副萨特氏菌属Parasutterella和艾克曼菌属Akkermansia相对丰度增高,而嗜胆菌属Bilophila、肠杆菌属Enterorhabdus、瘤胃梭菌属Ruminiclostridium、普雷沃氏菌科Prevotellaceae_UCG_001、瘤胃梭菌属Ruminiclostridium-9、拟杆菌属Bacteroides、Lachnoclostridium、Candidatus_Saccharimonas、Intestinimonas和Dubosiella的相对丰度减少,表明口服肝素能够影响小鼠肠道菌群结构。此外,实验发现口服肝素对小鼠无明显毒副作用,具有较高安全性。研究结果将为开发肝素口服递送策略提供新的思路,为口服肝素类药物的开发提供参考。     

罗伊乳杆菌对小鼠血清细胞因子含量和 肠道菌群的影响

目的探讨罗伊乳杆菌对小鼠免疫力及肠道菌群的影响。方法将50只昆明系小鼠按体重随机分成5组:空白对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组和发酵上清液组。空白对照组灌胃等量生理盐水,其余各组分别灌胃罗伊乳杆菌菌液及发酵液上清21d后,眼球取血收集血清,采用ELISA法检测IL-2、IFN-γ、IgA和IgG含量;采用16SrRNA基因高通量测序分析小鼠肠道菌群变化。结果与对照组相比,其余各组小鼠血清IL-2、IFN-γ、IgA和IgG的水平均明显升高,粪便菌群丰度有所增高,多样性降低。与对照组相比,低剂量组和中剂量组小鼠粪便菌群结构无显著差异,而高剂量组和发酵上清液组小鼠粪便菌群结构差异显著。结论罗伊乳杆菌可以增强小鼠免疫力,提高菌群丰度,改变小鼠肠道菌群结构。     

系统性红斑狼疮小鼠肠道微生物与抗dsDNA抗体水平的相关性

目的探讨系统性红斑狼疮(简称狼疮)TC小鼠肠道微生物菌群结构与抗ds DNA抗体之间的关系。方法 ELISA法检测狼疮TC小鼠血清抗ds DNA抗体,然后分别收集ds DNA阳性组和阴性组的小鼠粪便,利用Illumina Hi Seq 2500高通量测序,进行粪便样本16S测序,比较两组之间的肠道微生物菌群结构与抗ds DNA抗体水平之间的关系。结果通过ELISA检测抗体结果和小鼠粪便高通量测序结果显示,ds DNA阳性组TC小鼠的物种群落多样性显著低于ds DNA阴性组;同时,两组TC小鼠肠道微生物分别在门水平Chloroflexi(绿弯菌门);纲水平Betaproteobacteria(β变形菌纲)、Deltaproteobacteria(δ变形菌纲)和Ktedonobacteria(纤线杆菌纲);目水平Burkholderiales(伯克氏菌目)、Desulfovibrionales(脱硫弧菌目)和Ktedonobacterales(纤线杆菌目);科水平Alcaligenaceae(产碱菌科)和Desulfovibrionaceae(脱硫弧菌科);属水平Parasutterella(副萨特氏菌属)和Desulfovibrio(脱硫弧菌属)上差异有显著性(P0.05)。结论狼疮TC小鼠肠道微生物菌群结构与抗ds DNA抗体高度相关,本研究为进一步阐明肠道微生物菌群与系统性红斑狼疮发病机制的关系提供依据。     

基于高通量测序技术研究色胺酮对溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群的影响

目的研究色胺酮对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导溃疡性结肠炎(UC)模型小鼠肠道菌群的影响。方法用3%DSS自由饮用7 d诱导昆明种小鼠UC模型,灌胃125 mg/kg柳氮磺胺吡啶作为阳性对照,色胺酮组以78 mg/kg水溶液灌胃给药,观察小鼠给药前后的体征,进行疾病活动指数(DAI)评分,观察结肠组织形态变化;ELISA法检测小鼠血清中IL-6、IL-8、IL-10、IL-1β和TNF-α水平变化;每组收集5个粪便样本,利用Illumina MiSeq测序平台采用细菌的16S rRNA进行V4-V5区高通量测序,对测序结果进行生物信息学分析。结果色胺酮和阳性药干预后,DAI评分表明小鼠体征有所改善,HE染色显示UC小鼠结肠组织损伤有一定程度修复,炎性细胞减少;ELISA检测显示小鼠血清中促炎性细胞因子IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α水平下调,抑炎性细胞因子IL-10水平上升;测序后菌群物种注释及生物多样性分析显示色胺酮干预后UC小鼠失调的厚壁菌门/拟杆菌门比例得到一定程度恢复,菌群多样性有一定程度回调,菌群结构向正常状态恢复;肠道菌群LEfSe组间差异显著性分析结果表明4个菌属Erysipelotrichaceae_UCG_003、Sellimonas、Rikenellaceae_RC9_gut_group和Tyzzerella丰度可能与色胺酮对UC治疗作用相关。结论色胺酮治疗UC小鼠后,小鼠体征、结肠组织病理结构、细胞因子水平及肠道菌群变化等结果均表明色胺酮对UC小鼠肠道微生态具有调节作用,为色胺酮抗UC作用机制研究提供了新思路。     

CVTree在454高通量测序分析菌群结构中的应用

目的探究将基于短串频度的CVTree方法用于反映菌群结构的16S rRNA基因的454高通量测序数据分析的可行性,为快速分析高通量菌群结构数据提供新的方法。方法对一个四世同堂的中国家庭7名成员肠道菌群和不同基因型及饮食类型的小鼠肠道菌群用454高通量方法获得16S rRNA基因的V3区的测序数据,用CVTree的方法进行菌群结构的比较分析。结果通过选取合适的短串长度,CVTree的方法能准确检测到各样本间的聚类关系,其结果与之前文献报道的基于Unifrac算法的结果相一致。结论CVTree能快速、有效地处理16S rRNA基因的454高通量测序数据,实现对不同菌群结构相似性的比较分析。     

应用生物信息学方法筛选幽门螺杆菌疫苗候选抗原

目的：应用生物信息学分析方法筛选幽门螺杆菌新的疫苗候选抗原。方法：从TIGRCMR下载幽门螺杆菌26695和J99株全基因组序列,应用生物信息学SignalP、PredTMBB、LipoP、TMHMM、Phobius、PSORT-B和SubLoc等分析软件,筛选幽门螺杆菌新的外膜蛋白和分泌蛋白疫苗候选抗原。结果：从幽门螺杆菌26695株筛选得到54个编码β-桶型跨膜蛋白、脂蛋白或分泌表达蛋白的疫苗候选蛋白抗原,从幽门螺杆菌J99株得到61个呈现上述表达方式的疫苗候选蛋白抗原;且这2株细菌的疫苗候选蛋白呈现良好的交集状况,即有43个候选疫苗蛋白是相同的。结论：用生物信息学分析方法可以从全基因组范围内快速筛选到保守的分泌或表面暴露的疫苗候选抗原,为疫苗抗原的快速筛选与鉴定奠定了基础。     

家养及大型养殖场鸡肠道微生物菌群及四环素耐药菌多样性的比较研究（英文）

本研究分析比较了农家家养鸡与大型养殖场鸡肠道菌群组成及抗四环素抗性基因在肠道菌群中的分布情况。通过454焦磷酸法对细菌16SrRNA V3区进行测序来分析肠道菌群的组成;用平板琼脂法筛选四环素耐药菌株,对其16SrRNA基因全长测序,并与RDP(Ribosomal Database Project)数据库比对进行菌种鉴定;聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测常见四环素耐药基因。家养鸡粪便中菌群香农多样性指数为5.321±0.590,养殖场鸡为4.398±0.440,前者显著大于后者(Mann-Whitney U test,P=0.008)。从家养鸡和养殖场鸡粪便中随机分离到69株和65株四环素耐药菌株,后者四环素耐药菌的种类多于前者。家养鸡较养殖场鸡的肠道菌群更具多样性,而抗生素抗性基因在养殖场鸡的肠道菌群中分布更广泛。结果表明,不同饲养方式对鸡的肠道菌群有影响,对抗生素抗性基因的分布也有一定影响。     

家养及大型养殖场鸡肠道微生物菌群及四环素耐药菌多样性的比较研究

本研究分析比较了农家家养鸡与大型养殖场鸡肠道菌群组成及抗四环素抗性基因在肠道菌群中的分布情况。通过454焦磷酸法对细菌16S rRNA V3区进行测序来分析肠道菌群的组成;用平板琼脂法筛选四环素耐药菌株,对其16S rRNA基因全长测序,并与RDP (Ribosomal Database Project)数据库比对进行菌种鉴定;聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测常见四环素耐药基因。家养鸡粪便中菌群香农多样性指数为5.321±0.590,养殖场鸡为4.398±0.440,前者显著大于后者(Mann-Whitney U test,P＝0.008)。从家养鸡和养殖场鸡粪便中随机分离到69株和65株四环素耐药菌株,后者四环素耐药菌的种类多于前者。家养鸡较养殖场鸡的肠道菌群更具多样性,而抗生素抗性基因在养殖场鸡的肠道菌群中分布更广泛。结果表明,不同饲养方式对鸡的肠道菌群有影响,对抗生素抗性基因的分布也有一定影响。     

三联益生菌对便秘小鼠肠道推进功能改善及其对 小鼠肠道菌群调节作用的研究

目的研究新型嗜酸乳杆菌NCFM-乳双歧杆菌Bi-07-鼠李糖乳杆菌NH001三联益生菌制剂对便秘小鼠小肠蠕动的促进作用,以及其对小鼠肠道菌群构成比例的调节作用。方法小肠推进率实验:将50只KM小鼠适应性饲养后随机分为空白对照组、模型对照组和低中高三个剂量组。空白对照组和模型对照组给予蒸馏水,低中高剂量组每天分别给予0.165、0.330、0.990g/(kg·bw)益生菌制剂,灌胃14d后使用复方地芬诺酯建立小鼠便秘模型观察小肠墨汁推进率;肠道菌群调节作用实验:将42只BALB/c小鼠中随机抽取10只作为自身对比空白组,适应性饲养后将所有小鼠随机分为空白对照组和低中高三个剂量组,空白对照组给予蒸馏水,各剂量组以相同剂量给予益生菌制剂灌胃。自身对比空白组于灌胃前无菌采集小鼠直肠粪便,所有小鼠灌胃30d后无菌采集直肠粪便,使用16SrDNA基因测序对粪便中菌群DNA进行多样性及各水平菌群物种测定。结果高剂量组便秘小鼠小肠推进率显著高于模型对照组(P0.05);各剂量组肠道菌群多样性、双歧杆菌属、乳杆菌属数量较灌胃前显著增加(P0.05),大肠埃希菌属、梭菌属、肠球菌属较灌胃前显著降低(P0.05)。结论三联益生菌能够有效促进便秘小鼠肠道蠕动能力,改善便秘症状;同时对小鼠肠道菌群结构有调节作用。     

乌梅对抗生素所致小鼠肠道菌群失调的改善作用

本研究旨在探讨药食同源中药乌梅对抗生素所致小鼠肠道菌群失调的改善作用,为乌梅的进一步开发利用提供科学依据。构建广谱抗生素诱导的小鼠肠道菌群紊乱模型,40只ICR小鼠随机分为空白对照、模型组、乌梅低、中、高剂量组,连续灌胃15天后,采集小鼠新鲜粪便样本。采用高通量测序技术对乌梅干预前后小鼠的肠道菌群进行16S rRNA基因测序,对测序结果进行生物信息学分析,并检测体质量和炎性因子改变。结果显示,中、高剂量乌梅可以显著降低小鼠体重;中剂量乌梅可以调节抗生素引起的TNF-α、IL-1β、IL-6的变化至正常水平;病理切片显示高剂量乌梅对胃有一定刺激作用。对菌群结构的分析表明乌梅可以部分改善抗生素引起的菌群紊乱的状况:在门水平上,中、低剂量的乌梅显著降低变形菌门的相对丰度;在属水平上,中、低剂量的乌梅显著上调Lactobacillus(P=0.001,P=0.000)和Faecalibaculum(P=0.005,P=0.038),高、低剂量的乌梅显著上调Bifidobacterium(P=0.000,P=0.000)和Blautia(P=0.049,P=0.000)的相对丰度。本研究从肠道微生态的视角为乌梅的临床应用提供科学依据,并揭示其作为肠道微生态调节剂产品的前景。     

人参皂苷对 BALB/c 小鼠肠道菌群的影响

目的:随着人参药用和保健价值的不断发掘,人参皂苷引起人们越来越多的关注,但有关人参皂苷与肠道菌群之间相互作用的研究仍为空白领域,本实验旨在探明人参皂苷对小鼠肠道菌群的影响,以期为人参皂苷的推广应用提供理论基础和实验依据。方法:有机溶剂法提取人参皂苷,将正常BALB/c小鼠按2 mg/0.1 kg人参皂苷进行连续灌胃饲养,分别在灌胃第10 d和第13 d无菌收集小鼠粪便,提取肠道细菌基因组总DNA,应用PCR-DGGE技术获得肠道菌群分子指纹图谱,进行菌群结构相似性、多样性分析,并将感兴趣的优势条带进行切胶、测序分析,对获得的序列在Gene Bank数据库比对。结果:灌胃人参皂苷后小鼠肠道菌群结构发生改变,荧光假单胞菌和丁酸梭菌数量明显增加。结论:人参皂苷使小鼠肠道的菌群结构和数量发生明显改变,天然的人参皂苷口服很难被直接吸收利用,因此推测人参皂苷可能以肠道菌群作为发挥生物学作用的靶点,进而行使提高健康水平等保健功能。     

幽门螺杆菌UreB和HspA DNA疫苗的构建及免疫评价

本研究选择幽门螺杆菌尿素酶B和热休克蛋白A为候选抗原,通过PCR扩增基因,克隆至真核表达质粒pCD-NA3.1(-)His-Myc上,构建成DNA疫苗,通过小鼠免疫效果的评价,获得两株具有免疫源性DNA疫苗。     

乳腺炎小鼠肠道菌群改变 及与炎性因子的相关性分析

目的采用高通量测序技术分析乳腺炎小鼠肠道菌群的丰度特征与组织炎性因子的关系。方法选用24只泌乳10 d的昆明雌鼠,随机分成4组(每组6只):健康对照组、低剂量攻菌组(含金黄色葡萄球菌10~3 CFU/25μL)、中剂量攻菌组(含金黄色葡萄球菌10~4 CFU/25μL)和高剂量攻菌组(含金黄色葡萄球菌10~5 CFU/25μL)。用非损伤方法经乳头管分别注入不同浓度的金黄色葡萄球菌悬浊液于小鼠的第4对(腹部)乳腺内。观察小鼠、组织病理学变化以及乳腺组织中TNF-α和Cav-1含量变化;收集小鼠粪便,采用高通量测序技术对小鼠粪便菌群进行分析。结果 (1)与健康对照组小鼠相比,高剂量攻菌组乳腺组织呈明显的炎性病理变化,TNF-α表达明显升高(P0.05),Cav-1表达明显降低(P0.05);(2)不同组小鼠肠道菌群物种丰度不同,对照组肠道菌群以拟杆菌门和厚壁菌门为主;与对照组相比,高剂量攻菌组乳腺炎模型小鼠厚壁菌门丰度增高,拟杆菌门、疣微菌门丰度降低,变形菌门无显著差异;进一步比较后发现,从属以上水平看,后者拟杆菌属、另枝菌属、普雷沃菌属丰度相对较低。结论提示乳腺炎发生和进展与肠道菌群的平衡有密切的关系,结果为研究乳腺炎的免疫学、病理学提供实验依据。     

强化玉米饮食对小鼠肠道菌群结构和功能的影响

【目的】采用高通量测序方法研究强化玉米饮食对小鼠肠道菌群结构的影响以及可提高宿主糖代谢相关菌群功能基因的分析。【方法】分别给予两组小鼠(各10只)常规饮食和强化玉米饮食(1/4的玉米粉加3/4的常规饮食成分),喂养10周,之后采集小鼠粪便样本,提取DNA,使用高通量测序仪进行宏基因组测序分析,比较两组小鼠肠道菌群和功能基因的差异。【结果】两组小鼠的终末体重没有明显差异。各样本DNA的测序有效率足够,肠道菌群的多样性存在一定差异。属放线菌门(Actinobacteria)的双歧杆菌(Bifidobacteriales)-B.pseudolongum分支和Coriobacteriia-Collinsella/Enterorhabdus分支的丰度在强化玉米饮食组的小鼠中显著升高,相应的宏基因组中涉及糖酵解和胆汁酸合成的一些酶和功能单元的含量也在强化玉米饮食组显著升高。【结论】强化玉米饮食可以提高肠道菌群中双歧杆菌等益生菌的丰度,增加宏基因组糖脂代谢相关基因和通路的含量,从而可能促进宿主的糖代谢功能。     

重组酿酒酵母表达幽门螺杆菌VacA蛋白及其免疫原性分析*

目的:利用酿酒酵母表面展示技术筛选幽门螺杆菌候选疫苗,并分析其免疫原性。方法:以幽门螺杆菌的空泡型细胞毒素A(vacA)基因作为研究对象,构建重组S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA,通过Western blot、免疫荧光标记和流式细胞仪对S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA进行体外表达分析。以PBS和S.cerevisiae EBY100/pYD1为对照组,S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA为实验组,口服免疫SPF级BALB/c小鼠。通过ELISA分析检测口服免疫后小鼠抗VacA特异性IgG及分泌型IgA效价。结果:VacA抗原蛋白被成功地展示在S.cerevisiae EBY100表面。小鼠经口服免疫S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA后可诱导产生较高的VacA特异性抗体。结论:表面展示型酿酒酵母可以作为幽门螺杆菌候选疫苗的递送载体,与此同时,这也为开发其他细菌或病毒疫苗提供新思路。     

流感病毒感染对小鼠肠道菌群的影响及桑叶的调节作用

【摘 要】 目的 探讨流感病毒对肠道菌群的影响以及桑叶提取物在治疗小鼠流感时对肠道菌群的调节作用。方法 将36只小鼠随机分为4组,正常对照组滴鼻生理盐水,其余以流感病毒鼠肺适应株FM1滴鼻3 d,建立流感小鼠模型后,正常对照组和病毒对照组灌胃生理盐水,另2组分别以高剂量(500 mg/kg)和低剂量(100 mg/kg)灌胃桑叶提取物,连续5 d。每天检测小鼠体重,并于病毒感染前、感染后及灌胃处理后3次无菌收集小鼠粪便,培养并计数小鼠粪便中肠杆菌、肠球菌、乳酸杆菌和双歧杆菌。结果 小鼠在感染病毒后体重明显降低,桑叶提取物治疗后体重降低的趋势有所减缓。小鼠肠道菌群在感染流感后有明显的变化,但桑叶提取物治疗后肠道菌群的恢复不明显。结论 流感病毒感染能引起小鼠肠道菌群的失调,桑叶不显示调节肠道菌群的效果,表明其对流感的治疗不通过调节肠道菌群平衡来发挥作用。     

幽门螺杆菌HspA融合蛋白口服疫苗的构建

构建表达幽门螺杆菌的保护性抗原分热休克蛋白A亚单位(HspA）和霍乱毒素B亚单位（CtxB）的重组融合蛋白的生物工程菌株,以此制备幽门螺杆菌的口服疫苗。用PCR方法扩增hspA和ctxB两个目的的基因片段,将它们分别克隆至pSK（＋）质粒上,然后插入含T7启动子ET－22b（＋）的表达载体中,构建嗓基因的表达质量pET－hct,转化E.coliBL21(DE3）,经IPTG诱导表达融合蛋白HCT。经测序,hspA-ctxB(hct)融合基因片段由726bp组成,可以编码242个氨基酸残基的多肽。经SDS－PAGE和免疫印迹分析检测发现,融合基因表达的蛋白质相对分子质量约为30kD。融合蛋白经镍离子柱纯化、复性后,和HspA共同标记同位素^125I,然后给小鼠灌胃,结果观察到HCT组小鼠血清中的^125I的放射量要明显高于HspA组（P＜0．001）,且吸收峰值时间明显提前。融合蛋白中的CtxB可明显促进小鼠对HspA的吸收,HCT融合蛋白可以作为预防和治疗幽门螺杆菌感染的侯选口服疫苗。     

高脂饮食中添加短链菊粉对小鼠肠道菌群的影响

目的:探究高脂饮食中添加短链菊粉对小鼠肠道菌群的影响。方法:选择8周龄雄性小鼠,5只喂食高脂饲料,5只喂食10%菊粉复合型高脂饲料,喂食8周后收集小鼠粪便,检测小鼠粪便中三种主要的短链脂肪酸。同时,提取小鼠粪便中的细菌基因组,对菌群基因组16S rRNA基因V4高变区进行测序,对数据进行PCoA分析、Alpha多样性分析、LEfSe分析和16S功能预测。结果:菊粉添加后,小鼠粪便中含有的细菌DNA量增多,短链脂肪酸增加。菊粉组和对照组PCoA图可以看到明显聚类。菊粉组物种多样性低于对照组。菊粉组小鼠粪便中S24_7菌科丰度上升;Lachnospiraceae(毛螺菌科),Ruminococcaceae(瘤胃菌科)和Deferribacteraceae(脱铁杆菌科)丰度下降。16S基因功能预测发现22个第二层级的KEGG通路发生变化。结论:高脂饮食情况下短链菊粉的添加会改变小鼠肠道菌群,继而影响肠道菌群的功能。     

PCR-DGGE技术评价抗生素诱导的肠道菌群失调

目的 利用PCR-DGGE技术结合活菌计数评价抗生素引起的肠道菌群失调.方法 SPF级BALB/c雌性小鼠连续4 d灌胃头孢曲松溶液125 mg/ml,0.4 ml/d,运用基于细菌16S DNA的PCR-DGGE技术结合活菌计数分析小鼠肠道菌群变化.结果 活菌计数结果与PCR-DGGE图谱显示,头孢曲松处理3 d后小鼠肠道菌群出现严重失调.结论 PCR-DGGE技术可直观而灵敏地显示抗生素处理过程中肠道菌群的动态变化,适用于评价抗生素引起的肠道菌群失调.