索拉非尼联合顺铂对胃癌SGC7901细胞的抑制作用

目的:探讨索拉非尼联合顺铂(DDP)对胃癌SGC7901细胞的抑制作用以及可能的分子机制.方法:选取人胃癌细胞株SGC7901,用索拉非尼和DDP单药或联合作用于细胞,观察最佳抑制效果.MTT法检测索拉非尼、DDP及两药联用对胃癌SGC7901细胞的增殖抑制作用并计算半数抑制浓度(IC50);用流式细胞仪检测细胞凋亡;用Western blot观察ERK及pERK蛋白的表达.结果:MTT检测结果显示胃癌SGC7901细胞经索拉非尼、DDP单独处理以及两者联合处理后,在不同浓度均能出现细胞生长抑制作用,并且其抑制作用呈时间-剂量依赖效应.与单药组相比,联合作用组对细胞的抑制率明显增高,表现为协同作用(P＜0.05).流式细胞仪检测凋亡的结果显示,经药物处理后细胞凋亡率均较空白对照组升高,两药联合作用的凋亡率要明显高于单药组.单药组及联合用药组对SGC7901细胞ERK的表达无明显影响,但是pERK在单用索拉非尼及联合用药组的表达则降低,以联合用药组尤甚.结论:索拉非尼联合顺铂对胃癌SGC7901细胞有增殖抑制及促凋亡的作用,两药联合表现为协同作用,其机制可能与细胞增殖通路Raf/MEK/ERK的机制有关.     

索拉菲尼联合阿霉素对人肝癌细胞株HepG2的抑制作用

目的：探讨索拉非尼（Sorafenib）和阿霉素（adriamycin）联合用药对肝癌细胞株nepG2的作用及可能的机制。方法：以不同浓度索拉非尼和不同浓度阿霉素分别组成单药组和索拉非尼＋阿霉素联合用药组作用于HepG2细胞,MTT法检测增殖抑制率、流式细胞仪分析细胞周期和凋亡率。结果：索拉非尼、阿霉素单药与联用均能抑制HepG2细胞增殖,呈剂量依赖效应,两药联用有协同效应（P〈0.01）。索拉非尼、阿霉素单药与联用均能诱导HepG2细胞凋亡,并以联合组更为明显,与对照组比较有显著的统计学意义（P〈0.01）。索拉非尼及阿霉素单药作用均可使细胞周期阻滞于G0-G1期,联合用药组G0/Gl期细胞比率低于索拉非尼及阿霉素单药组,S期细胞比率高于单药组;阿霉素能抑制HepG2细胞Survivin mRNA表达诱导细胞的凋亡。结论：索拉非尼与阿霉素联合作用于人肝癌HepG2细胞具有协同作用,其机制可能是通过多途径共同抑制HepG2细胞增殖及诱导细胞凋亡。     

针对Mcl-1的shRNA重组质粒体外增强肝癌细胞对化疗敏感性的实验研究

目的构建针对髓细胞白血病基因-1(Mcl-1)的shRNA的重组质粒,探讨该重组质粒对肝癌细胞化疗敏感性的影响。方法设计3对针对Mcl-1基因不同位点的shRNA片段的真核表达载体psiRNA-hH1neo-Mcl,用阳离子脂质体法将重组质粒转染至人肝癌细胞株HepG2中,采用RT-PCR和Western blot方法检测转染后Mcl-1mRNA及蛋白表达情况,筛选Mcl-1基因表达沉默效应最好的重组质粒。用MTT和流式细胞仪分别检测单独使用丝裂霉素(Mitomycin,MMC)、单独使用重组质粒以及联合使用重组质粒与MMC对HepG2细胞的增殖和凋亡的影响。结果成功构建含不同shRNA片段的重组质粒,依次命名为pMclsi-1、pMclsi-2、pMclsi-3。经测序证实,插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致。重组质粒转染HepG2细胞后,Mcl-1基因的mRNA水平及蛋白水平明显下调,其中以pMclsi-1下调效应最强。MTT检测显示,pMclsi-1联合化疗药物MMC对HepG2细胞增殖的抑制活性显著高于单用MMC组或单用pMclsi-1组,流式细胞仪检测显示,pMclsi-1联合化疗药物MMC促进HepG2细胞凋亡的活性显著高于单用MMC组或pMclsi-1组。结论针对Mcl-1基因的siRNA可特异阻断Mcl-1基因的表达,从而明显增强肝癌细胞对化疗药物MMC的敏感性。     

紫草素逆转埃克替尼对肺癌EGFR-TKI 耐药及其机制的研究

目的:观察紫草素联合埃克替尼对肺腺癌耐药细胞H1975增殖的影响,探讨克服耐药可能的作用机制。方法:应用MTT法检测紫草素(1.25~20μmo/L)、埃克替尼(5~100μmol/L)及两药联合干预对H1975细胞生长的抑制作用;流式细胞术观察紫草素(1.25μmol/L)、埃克替尼(10μmol/L)及联合使用对H1975凋亡作用;Western blot检测不同干预对H1975细胞EGFR、p-EGFR、AKT、p-AKT、ERK、p-ERK和凋亡相关蛋白PARP表达水平的影响。结果:MTT检测结果显示,与单药组相比,联合用药组细胞H1975增殖能力明显减弱,差异有统计学意义(P0.05);流式细胞术结果显示,联合用药组细胞的凋亡率达到(52.45±3.04)%,较紫草素组细胞凋亡率(22±1.17)%和埃克替尼处理组细胞凋亡率(15.35±5.85)%明显提高,差异有统计学意义(P0.05)。Western blot结果显示,单药组下调了p-EGFR、p-Akt蛋白水平的表达,而联合用药组显著抑制了p-ERK、PARP蛋白水平的表达,差异有统计学意义(P0.05),EGFR、AKT、ERK蛋白表达无差异(P0.05)。结论:紫草素联合埃克替尼能明显抑制H1975细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡;抗肿瘤机制可能与调节EGFR信号通路相关蛋白表达有关。     

USP9X低表达通过下调Mcl-1促进肝癌细胞凋亡

研究抑制泛素特异性蛋白酶9X（ubiquitin-specific protease 9X,USP9X）对人肝癌（primary hepatocellular carcinoma,HCC）细胞SMMC7721和HepG2中髓细胞白血病-1（myeloid cell leukemia-1,Mcl-1）蛋白的表达调控及对细胞凋亡和生长活力的影响。实验分为USP9X-siRNA组和阴性对照NC组两组进行分析。通过Western blot技术分别检测USP9X在肝癌细胞SMMC7721、HepG2和正常人肝细胞株L02中的蛋白表达情况;应用化学合成USP9X-siRNA转染肝癌细胞SMMC7721和HepG2,通过Western blot、流式细胞仪和MTT检测转染前后Mcl-1的蛋白表达差异以及细胞凋亡和生长活力变化。结果表明,USP9X在肝癌细胞SMMC7721和HepG2中的蛋白表达水平均高于正常肝细胞L02（t=15.155,P=0.000;t=9.171,P=0.001）;SMMC7721和HepG2细胞中抑制USP9X能明显下调Mcl-1的蛋白表达,并导致细胞凋亡增加和生长活力降低。提示,肝癌细胞SMMC7721和HepG2中USP9X表达上调;USP9X表达降低可能通过下调Mcl-1的蛋白表达进而诱导人肝癌细胞SMMC7721和HepG2的凋亡。     

U0126通过下调p-ERK1/2和GM130的表达对人胃癌细胞MKN-45的影响

探讨ERK1/2通路抑制剂U0126对人胃癌MKN-45细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移能力的影响及机制。首先用CCK-8法测定U0126对MKN-45细胞增殖的影响并筛选药物作用的最适浓度和时间用于后续实验,并将实验分为药物处理组,阴性对照组和空白对照组。然后通过流式细胞术、Transwell迁移实验和Matrigel侵袭实验分别检测细胞凋亡、迁移和侵袭能力,RT-q PCR检测各组GM130的m RNA水平的变化,Western blotting检测ERK1/2、p-ERK1/2、MMP-9、MMP-2、GM-130的蛋白水平的变化。实验发现10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L浓度的U0126均能抑制MKN-45细胞的增殖,其中20μmol/L浓度作用48 h效果最强(p0.05),且该药物作用条件下MKN-45细胞凋亡增加,迁移和侵袭作用减弱(p0.05)。Western blotting结果显示,药物处理组ERK1/2蛋白水平不变,而p-ERK1/2、MMP-9、MMP-2、GM-130的蛋白水平均明显低于阴性对照组和空白对照组(p0.05)。RT-q PCR结果显示,药物处理组GM130的m RNA水平明显低于阴性对照组和空白对照组(p0.05)。以上研究结果均表明U0126可促进MKN-45细胞凋亡,降低细胞体外增殖、迁移和侵袭的能力,其机制可能与p-ERK1/2和GM130的表达被抑制有关。     

香蜂草苷诱导人肝癌细胞株HepG2凋亡及其作用机制

为了研究香蜂草苷对肝癌细胞株HepG2凋亡的影响,并探讨其作用机制,利用MTT法检测香蜂草苷对HepG2细胞增殖的抑制作用,流式细胞术检测细胞凋亡率,试剂盒检测caspase-3和caspase-9活性,Western blot检测Bcl-2、Bax、RKIP、ERK、p-ERK蛋白表达。实验结果表明香蜂草苷可抑制HepG2细胞增殖并诱导其凋亡,其机制可能与提高caspase-3和caspase-9活性,上调Bax和下调Bcl-2表达有关。此外,我们的研究显示香蜂草苷诱导HepG2细胞凋亡可能还与其增加RKIP表达,抑制ERK/MAPK信号通路有关。     

Mcl-1在胆盐（GCDA）诱导的肝癌细胞耐药中的作用

目的：探讨抗凋亡蛋白Mcl-1在GCDA诱导的肝癌细胞耐药中的作用及其机制。方法：培养3种肝癌细胞系,用免疫荧光法和Western blot技术检测Mcl-1的表达;GCDA±CYC处理HepG2细胞,采用Western blot技术检测Mcl-1的半衰期变化;用抗癌药物Irinotecan与GCDA对HepG2细胞进行处理,采用MTT法和Western blot技术分别检测细胞增殖抑制率和Mcl-1的表达变化;用RNA干扰技术下调Mcl-1,检测化疗药物对HepG2细胞的敏感性。结果：Mcl-1在肝癌细胞中广泛表达;GCDA能延长Mcl-1的半衰期至6h以上,并明显减弱化疗药物对抗凋亡蛋白Mcl-1的抑制作用,降低癌细胞的药物敏感性;RNA干扰下调Mcl-1能增加癌细胞的药物敏感性。结论：胆盐（GCDA）能诱导HepG2细胞产生耐药性,其作用机制可能是通过延长Mcl-1半衰期增加其蛋白稳定性和抗凋亡作用来促使肝癌细胞抗药的。     

SPARCL1通过MEK/ERK信号通路调节非小细胞肺癌细胞的增殖、凋亡和侵袭

摘要 目的：分析富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白类似蛋白1（SPARCL1）对非小细胞肺癌（NSCLC）细胞增殖、凋亡、侵袭的影响,并探讨分裂原活化抑制剂（MEK）/细胞外调节蛋白激酶（ERK）通路在其中发挥的作用。方法：收集2019年9月~2021年6月期间本院接受手术治疗的84例NSCLC患者癌组织与相应癌旁组织,实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）法测定并比较各组织以及正常肺上皮细胞HBEpiC、NSCLC细胞A549、HCC827、H1299、H292中SPARCL1 信使RNA（mRNA）表达水平,选取A549、HCC827培养并分组,分为对照组、NC siRNA组、SPARCL1 siRNA组、U0126组（MEK/ERK特异性抑制剂）、SPARCL1 siRNA加U0126组,细胞计数法（CCK8）以及平板克隆法测定A549、HCC827细胞增殖,流式细胞仪测定A549、HCC827细胞凋亡,Transwell小室法测定A549、HCC827细胞侵袭能力,蛋白质印迹法（western blot）检测SPARCL1、p-MEK、MEK、p-ERK1/2、ERK1/2蛋白表达。结果：SPARCL1在NSCLC组织中mRNA表达水平低于癌旁组织（P＜0.05）;与HBEpiC细胞相比,NSCLC细胞A549、HCC827、H1299、H292细胞中SPARCL1 mRNA表达水平降低（P＜0.05）;与对照组相比,SPARCL1 siRNA组A549、HCC827细胞SPARCL1 mRNA表达水平与蛋白表达、凋亡率降低（P＜0.05）,OD₄₅₀、克隆形成数、侵袭细胞数、p-MEK/MEK、p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表达升高（P＜0.05）,U0126组A549、HCC827细胞SPARCL1 mRNA表达水平与蛋白表达、凋亡率升高（P＜0.05）,OD₄₅₀、克隆形成数、侵袭细胞数、p-MEK/MEK、p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表达降低（P＜0.05）;与SPARCL1 siRNA组相比,SPARCL1 siRNA加U0126组A549、HCC827细胞SPARCL1 mRNA表达水平与蛋白表达、凋亡率升高（P＜0.05）,OD₄₅₀、克隆形成数、侵袭细胞数、p-MEK/MEK、p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表达降低（P＜0.05）。结论：SPARCL1可能通过调控MEK/ERK通路影响NSCLC A549、HCC827细胞增殖、侵袭与凋亡。     

二氯乙酸钠和氯喹联合整合素亚单位的shRNA的协同抗肿瘤作用

目的:探究二氯乙酸钠、氯喹和表达整合素β3、β5亚单位的shRNA的重组病毒协同抗肿瘤作用。方法:探究二氯乙酸钠、氯喹和表达整合素β3、β5亚单位的shRNA的重组病毒对肝癌细胞株HepG2皮下异种移植瘤生长的影响,通过免疫组化试验检测药物对肿瘤血管生成、肿瘤细胞凋亡、增殖的影响。结果:在小鼠HepG2皮下移植瘤体内试验中可见单用氯喹对肿瘤生长抑制作用明显弱于单用二氯乙酸钠或两者合用,两药联合使用对肝癌细胞株HepG2产生的小鼠皮下移植瘤具有良好的抑制生长作用,并且使得小鼠能够很好地耐受氯喹,荷瘤所致的小鼠体重下降也得到缓解。单用表达整合素β3、β5亚单位的shRNA腺病毒对肿瘤抑制作用弱,合用两个化合物和表达整合素β3、β5亚单位的shRNA腺病毒则对小鼠HepG2移植瘤生长产生持续抑制作用,并减少单用表达整合素β3、β5亚单位的shRNA腺病毒对体重的影响。HE染色结果显示,给药后各组细胞结构被破坏,CD31和Ki67染色显示用药各组同步减少,TUNEL染色显示用药后各组细胞凋亡增加,其中二氯乙酸钠/氯喹/整合素β5和β3 shRNA腺病毒组最为明显,结果表明二氯乙酸钠/氯喹/整合素β5和β3 shRNA腺病毒联用具有显著的抗肿瘤生长作用,其机制是降低肿瘤的微血管密度、抑制肿瘤细胞的增殖和增加肿瘤细胞凋亡。结论:二氯乙酸钠、氯喹和表达整合素亚单位的shRNA的重组病毒进行组合具有协同抗肿瘤作用,为联合用药的设计及应用提供了参考。     

Mcl-1-dependent activation of Beclin 1 mediates autophagic cell death induced by sorafenib and SC-59 in hepatocellular carcinoma cells

We investigated the molecular mechanisms underlying the effect of sorafenib and SC-59, a novel sorafenib derivative, on hepatocellular carcinoma (HCC). Sorafenib activated autophagy in a dose- and time-dependent manner in the HCC cell lines PLC5, Sk-Hep1, HepG2 and Hep3B. Sorafenib downregulated phospho-STAT3 (P-STAT3) and subsequently reduced the expression of myeloid cell leukemia-1 (Mcl-1). Inhibition of Mcl-1 by sorafenib resulted in disruption of the Beclin 1-Mcl-1 complex; however, sorafenib did not affect the amount of Beclin 1, suggesting that sorafenib treatment released Beclin 1 from binding with Mcl-1. Silencing of SHP-1 by small interference RNA (siRNA) reduced the effect of sorafenib on P-STAT3 and autophagy. Ectopic expression of Mcl-1 abolished the effect of sorafenib on autophagy. Knockdown of Beclin 1 by siRNA protected the cells from sorafenib-induced autophagy. Moreover, SC-59, a sorafenib derivative, had a more potent effect on cancer cell viability than sorafenib. SC-59 downregulated P-STAT3 and induced autophagy in all tested HCC cell lines. Furthermore, our in vivo data showed that both sorafenib and SC-59 inhibited tumor growth, downregulated P-STAT3, enhanced the activity of SHP-1 and induced autophagy in PLC5 tumors, suggesting that sorafenib and SC-59 activate autophagy in HCC. In conclusion, sorafenib and SC-59 induce autophagy in HCC through a SHP-1-STAT3-Mcl-1-Beclin 1 pathway.     

大黄酸调节Ras/ERK信号通路对肝细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

摘要 目的：探讨大黄酸调节大鼠肉瘤蛋白（Ras）/胞外信号调控激酶（ERK）信号通路对肝细胞癌（HCC）细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法：使用不同浓度（0、12.50、25、50、100、150、200 mol/L）大黄酸处理HepG2细胞,检测细胞活性,筛选最佳大黄酸浓度。将细胞分为对照组、大黄酸低、中、高浓度组、大黄酸高浓度+Ras/ERK激活剂组（大黄酸高浓度+ML-099组）,分别检测各组细胞集落形成数、划痕愈合率、细胞侵袭数和Ras、p-ERK、ERK蛋白表达。结果：大黄酸以浓度和时间依赖性降低HepG2细胞活性（P<0.05）,选用25、50、100 mol/L处理HepG2细胞24 h用于后续实验;与对照组比较,大黄酸低、中、高浓度组细胞集落形成数、G0/G1细胞比例、细胞划痕愈合率、细胞侵袭数和原癌基因（c-Myc）、细胞周期蛋白D1（CyclinD1）、Ras、p-ERK/ERK蛋白表达呈浓度依赖性降低,S期和G2/M细胞比例、p53蛋白表达呈浓度依赖性增加（P<0.05）;与大黄酸高浓度组比较,大黄酸高浓度+ML-099组细胞集落形成数、G0/G1细胞比例、细胞划痕愈合率、细胞侵袭数和c-Myc、CyclinD1、Ras、p-ERK/ERK蛋白表达显著增加,S期和G2/M细胞比例、p53蛋白表达显著降低（P<0.05）。结论：大黄酸可能通过抑制Ras/ERK信号通路抑制HCC细胞增殖、迁移和侵袭。     

PEGylated trimethylchitosan emulsomes conjugated to octreotide for targeted delivery of sorafenib to hepatocellular carcinoma cells of HepG2

Abstract

The current study aimed to develop PEGylated trimethyl chitosan (TMC) coated emulsomes (EMs) conjugated with octreotide for targeted delivery of sorafenib to hepatocellular carcinoma cells (HCC) of HepG2. Sorafenib loaded TMC coated EMs were prepared by the emulsion evaporation method and characterized concerning particle size, zeta potential, drug encapsulation efficiency, and in vitro drug release. Synthesized EMs were then conjugated to octreotide. The cytotoxicity of the targeted and non-targeted EMs was determined by cellular uptake and MTT assay on HepG2 cell. Cell cycle assay was also studied using flow cytometry. The results showed the optimized EMs had the particle size of 127?nm, zeta potential of ?5.41?mV, loading efficiency of 95%, and drug release efficiency of 62% within 52?h. Octreotide was attached efficiently to the surface of EMs as much as 71%. MTT assay and cellular uptake studies showed that targeted EMs had more cytotoxicity than free sorafenib and non-targeted EMs. Cell cycle analyses revealed that there was a significant more accumulation of targeted EMs treated HepG2 cells in the G1 phase than free sorafenib and non-targeted EMs. The results indicate that designed EMs may be promising for the treatment of hepatocellular carcinoma.     

RNA干扰Mcl-1基因表达对淋巴瘤Raji细胞增殖和凋亡的机制研究

目的:探讨抑制Mcl-1基因表达对淋巴瘤Raji细胞增殖和凋亡的影响及机制。方法:NC-siRNA、Mcl-1-siRNA转染Raji细胞,以不作任何处理的细胞作为空白对照组,48h后Western blot检测各组细胞中Mcl-1的蛋白表达;CCK8实验和流式细胞仪分别检测细胞的增殖和凋亡情况;Western blot检测Cleaved caspase3、Notch1、Hes1蛋白表达。结果:转染Mcl-1-siRNA后Mcl-1的蛋白表达显著降低;与对照组及NC-siRNA组比较,Mcl-1-siRNA组细胞存活率显著降低,细胞凋亡率显著升高,Cleaved caspase3蛋白显著上调表达,Notch1和Hes1蛋白显著下调表达。结论:RNA干扰抑制Mcl-1基因表达可显著降低Raji细胞增殖及诱导细胞凋亡,其机制与抑制Notch1信号通路有关。     

Mcl-1参与非小细胞肺癌对吉非替尼耐药的实验研究

目的:探究人髓细胞白血病基因-1(myeloid cell leukemia-1,Mcl-1)是否参与非小细胞肺癌对吉非替尼的耐药。方法:应用Western blot检测Mcl-1在吉非替尼敏感细胞PC-9和耐药细胞H1975表达差异;梯度浓度的吉非替尼作用于PC-9细胞后,Western blot实验检测B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)家族中抗凋亡蛋白的表达变化;应用Western blot实验检测Mcl-1在PC-9和H1975细胞内降解速度差异。结果:Mcl-1在PC-9细胞内的表达明显低于H1975细胞,差异有统计学意义(P0.05),并且随着吉非替尼作用浓度的升高,Mcl-1表达逐渐降低,而Bcl-2和Bcl-x L表达基本不变,并且PC-9细胞内Mcl-1降解更迅速,半衰期明显缩短。结论:非小细胞肺癌对吉非替尼耐药可能与Mcl-1的表达量上调,降解速度减慢,半衰期延长有关。