可诱导型敲低PICH的MDA-MB-231细胞系的构建及鉴定

目的:构建稳定表达可诱导型polo样激酶1相关检查点解旋酶(PICH)短发夹RNA(shRNA)的三阴乳腺癌细胞系MDA-MB-231,并通过检测加入诱导剂后细胞的增殖评价敲低效果。方法:设计并合成2条特异靶向PICH的shRNA序列,用分子克隆技术构建pLKO.1-tet-on-shPICH-Puromycin质粒,经菌落PCR及基因测序验证;慢病毒包装并感染细胞,通过抗性筛选获得嘌呤霉素抗性的细胞;经强力霉素(DOX)诱导表达后,Western印迹检测PICH的敲低效果,并通过MTT法对细胞增殖进行检测。结果:菌落PCR凝胶电泳及DNA测序结果显示pLKO.1-tet-on-shPICHPuromycin质粒构建成功;Western印迹结果表明,在DOX诱导下,MDA-MB-231细胞中的PICH蛋白质表达下降,表明可诱导型PICH稳定敲低细胞系构建成功;进一步实验结果显示,MDA-MB-231细胞的增殖随PICH的表达下调而受到显著抑制。结论:构建了可诱导稳定敲低PICH的三阴乳腺癌细胞系MDA-MB-231,为进一步研究PICH在三阴乳腺癌中的作用以及具体的分子机制奠定了实验基础。     

慢病毒介导的靶向c-Met可诱导shRNA稳定乳腺癌MDA-MB-231细胞系的构建及生物活性鉴定

目的:探讨适当敲除c-Met后对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响。方法:设计3条针对c-Met基因不同位点的短发夹RNA(shRNA)片段,将其连接到TA载体上,瞬时转染MDA-MB-231细胞,采用RT-PCR、Western印迹检测c-Met mRNA及蛋白表达情况,挑选沉默效率最佳的shRNA。以scramble为阴性对照,MDA-MB-231细胞为空白对照,挑选沉默效率最佳的TA-shRNA,并将其与pSD400慢病毒载体连接,利用293T细胞进行慢病毒组装,收集病毒液并感染MDA-MB-231细胞,将嘌呤霉素与MDA-MB-231细胞共培养,筛选稳定表达shRNA的细胞株。利用多西环素对稳定细胞系进行诱导,Western印迹检测稳定细胞系c-Met蛋白的表达量,MTT法检测敲低c-Met对稳定细胞系增殖的影响。结果:测序结果表明模板序列与设计序列正确,并筛选出沉默效率最高的shRNA为shRNA1,慢病毒包装后筛选出稳定细胞株,适当敲除MDA-MB-231细胞c-Met基因后细胞的增殖明显低于对照组。结论:构建了针对c-Met基因可诱导shRNA的乳腺癌稳定细胞系,为探讨适当敲除c-Met基因后乳腺癌细胞对化疗、放疗敏感性检测奠定了基础。     

慢病毒介导沉默PD-L1基因在乳腺癌细胞中的表达

构建含细胞程序性死亡因子配体1(PD-L1)基因的慢病毒载体三质粒体系,并检测其在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达情况。p MAGic 7.1慢病毒表达载体与质粒△8.91和p VSVG用聚乙烯亚胺(PEI)共转293T包装病毒,感染并筛选获得MDA-MB-231稳转细胞系,检测PD-L1表达情况。(1)MDA-MB-231在3种乳腺癌细胞中PD-L1表达量最高;(2)三质粒转染293T细胞48 h后荧光强度增强,达到90%以上;用病毒感染MDA-MB-231细胞,48 h获得20%左右荧光强度;(3)经筛选的MDA-MB-231稳转细胞系在m RNA水平和蛋白水平低表达PD-L1,其中由p MAGic-sh1包装的病毒干扰能力最强;(4)分别加入病毒后,干扰组细胞增殖能力下降,p MAGic-sh1干扰组细胞在加入病毒7 d后生长速度约为阴性对照的64.77%;(5)混合淋巴实验显示,sh-1干扰组的肿瘤抑制率为35.8%,是正常组的3.06倍,且干扰组的T淋巴细胞活性显著增强。成功通过PEI转染试剂建立了三质粒慢病毒包装体系,该体系获得的慢病毒可有效干扰乳腺癌MDA-MB-231细胞中PD-L1的表达量,所得的干扰细胞株细胞增殖能力下降,可增强T细胞增殖活性及肿瘤细胞杀伤活性。     

Akt3稳定表达细胞株的建立及其对MDA-MB-231细胞增殖的影响

目的 构建人蛋白激酶Bγ（Akt3）基因编码区序列（cDNA）的真核表达载体、建立其稳定表达细胞株并观察其对MDA-MB-231细胞增殖的影响.方法 从流产胎儿脑组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增Akt3 cDNA的全长序列后克隆入pEGFP-N2质粒中,构建成Akt3基因真核表达载体,然后转染入MDA-MB-231细胞中,新霉素筛选稳定转染细胞克隆,通过MTT实验,研究转染Akt3基因前后细胞增殖的变化.结果 重组载体经酶切鉴定和测序证实目的 基因正确无误.Western印迹检测结果显示AKT3融合蛋白在MDA-MB-231细胞中表达良好,而转染空载体及未转染细胞对照中未见有此融合蛋白质条带;MTT结果显示AKT3表达上调的稳定克隆组,其增殖活性显著高于空载体稳定转染细胞组及未转染亲代细胞组,差异具有统计学意义（P＜0.01）,而后两者差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 Akt3过表达可增强MDA-MB-231细胞的增殖.     

串联亲和标签LOX蛋白慢病毒表达载体的构建及在乳腺癌细胞中的表达

目的:为了研究赖氨酰氧化酶(Lysyl Oxidase,LOX)及其相互作用蛋白质在乳腺癌中的功能,构建带StrepⅡ/FLAG串联亲和标签的重组LOX蛋白慢病毒表达载体并在乳腺癌细胞MDA-MB-231中表达。方法:设计引物通过聚合酶链式反应获得带StrepⅡ/FLAG串联亲和标签的LOX蛋白(LOX-SF)的亲本质粒,双酶切后鉴定测序克隆至GV303表达载体,连同慢病毒包装质粒共同转染293T得到GV303/LOX-SF慢病毒,将其转染MDA-MB-231细胞,使用荧光定量PCR和蛋白质印迹实验对细胞中重组蛋白LOX-SF进行检测。结果:通过串联亲和纯化获得LOX-SF重组蛋白,使用标签抗体成功鉴定到LOX-SF重组蛋白在MDA-MB-231细胞内稳定表达。结论:GV303/LOX-SF的构建,使带StrepⅡ/FLAG融合标签的LOX蛋白在MDA-MB-231中成功表达及纯化,为筛选和研究LOX及其相互作用蛋白在乳腺癌细胞内的功能奠定了实验基础。     

BSP基因RNA干扰对乳腺癌MDA-MB-231BO细胞生物学特性的影响

旨在研究RNA干扰(RNA interference,RNAi)抑制骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein,BSP)基因表达后对人乳腺癌细胞MDA-MB-231BO生物学特性的影响。应用pSilencer5.1-U6Retro构建针对BSP基因的siRNA逆转录病毒重组表达质粒,将重组质粒转染293细胞制备病毒悬液感染MDA-MB-231BO细胞,利用嘌呤霉素筛选抑制BSP表达的乳腺癌细胞。Western blotting检测细胞内BSP蛋白表达,采用MTT法和集落形成试验检测细胞的增殖,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果显示,成功构建BSP基因RNAi稳定转染的231BO-BSP27细胞。231BO-BSP27细胞内BSP蛋白表达抑制率为69.3%,与对照组细胞相比,231BO-BSP27细胞的生长速率和克隆形成率明显降低;S期细胞数量明显减少,G0/G1期细胞增多。由此证实,逆转录病毒介导的RNAi能实现BSP基因稳定沉默,从而抑制MDA-MB-231BO细胞的生长和增殖。     

运用CRISPR/Cas9技术敲除人源黏着斑蛋白基因

目的:建立CRISPR/Cas9n系统,用于敲除人源黏着斑蛋白(VCL)基因。方法:设计一个靶向人源VCL基因第3个外显子的单向导RNA(sgRNA),分别克隆表达载体后,通过慢病毒转入人MDA-MB-231细胞,通过PCR及Western印迹检测细胞株中VCL基因的敲除效果。结果:测序结果显示靶向VCL基因CRISPR/Cas9重组质粒构建成功;PCR产物测序结果表明本次设计的Cas9/sgRNA能够对VCL基因进行编辑敲除;Western印迹显示Cas9-VCL组的MDA-MB-231细胞内VCL表达水平较对照组显著降低。结论:通过CRISPR/Cas9系统获得了靶向VCL基因的重组质粒,构建的重组质粒能有效敲除VCL。     

人BRCA1 干涉慢病毒载体的构建与验证

目的:设计合成干涉BRCA1表达的小干扰RNA,并克隆入pLKO.1慢病毒表达载体,为研究基因BRCA1在乳腺癌细胞增殖中的作用提供基础。方法:根据人BRCA1的基因序列,设计合成三对BRCA1干涉片段(序列前后加入酶切位点EcoRI和AgeI),再利用酶切连接反应将其插入到慢病毒载体pLKO.1中,经过酶切鉴定及测序正确后,将重组质粒转染入MCF-7细胞,48h后提取蛋白质和RNA,通过蛋白印迹验证BRCA1的蛋白水平的表达情况,Realtime PCR验证BRCA1的RNA水平的表达变化。结果:重组质粒经酶切鉴定和测序比对完全正确,转染乳腺癌细胞48h后可见BRCA1表达的明显下调。结论:成功构建BRCA1干涉的慢病毒载体,并且转染MCF-7细胞证实其能够下调BRCA1的表达,为后续研究BRCA1在乳腺癌细胞的功能奠定了基础。     

Cas9蛋白对亲骨转移人乳腺癌细胞株生物学性质和超微结构的影响

目的：构建表达Cas9蛋白的亲骨转移人乳腺癌细胞株,并研究Cas9蛋白的表达对细胞生物学性质和超微结构的影响,为利用CRISPR/Cas9技术研究乳腺癌骨转移分子机制提供实验基础。方法：通过慢病毒载体介导Cas9蛋白基因转染亲骨转移人乳腺癌细胞株MDA-MB-231BO,通过G418筛选转染细胞,采用流式细胞术、Western blot、免疫细胞化学验证Cas9基因转染是否成功;运用实时无标记动态细胞分析技术和细胞划痕实验检测Cas9蛋白表达对细胞增殖及迁移的影响;透射电镜观察Cas9蛋白表达对细胞超微结构的影响。结果：成功构建稳定表达Cas9蛋白的亲骨转移人乳腺癌细胞株MDA-MB-231BO-Cas9,Cas9蛋白的表达对细胞的增殖、迁移和超微结构无明显影响。结论：MDA-MB-231BO-Cas9细胞可用于CRISPR/Cas9技术进一步研究。     

SW620细胞RACK1稳定RNA干扰细胞系的构建与鉴定

目的:为研究RACK1在结肠癌发生发展中的作用,构建结肠癌RACK1基因稳定RNA干扰(RNAi)细胞系。方法:根据人Gnb211 c DNA序列,运用干扰原则选择5个干扰位点并合成相应干扰片段,定向克隆入p Lentilox3.7干扰载体鼠U6启动子后并测序验证。用干扰及对照质粒分别转染HEK293T细胞48小时后,RT-PCR鉴定干扰效率,选出干扰效率较高的质粒包装慢病毒感染人结肠癌细胞SW620,流式无菌分选出荧光阳性的细胞扩增培养,RT-PCR及Western blotting鉴定慢病毒干扰效率。使用慢病毒构建的SW620 RACK1稳定RNAi细胞系及对照组进行MTT实验初步研究RACK1对SW620增殖的影响。结果:酶切和测序证实RACK1sh RNA质粒构建正确,产生能同时表达绿色荧光蛋白(EGFP)和RACK1 sh RNA的慢病毒载体质粒。慢病毒转导SW620并流式无菌分选扩增培养后,与空载体组相比,2个RNAi组均不同程度抑制RACK1表达,RACK1sh RNA5抑制作用最明显,RACK1干扰组细胞增殖得到了抑制。结论:SW620细胞RACK1稳定RNAi细胞系构建成功,为深入研究RACK1在结直肠癌发生发展中的作用奠定了基础。     

Numb在三阴乳腺癌中抑制HDM2泛素化降解p53

目的:探究Numb蛋白在三阴乳腺癌患者中的表达降低情况,及Numb蛋白在三阴乳腺癌中对抑癌因子p53蛋白水平的影响及调控机制,进一步研究Numb蛋白的降低与三阴乳腺癌发生发展的相关性,从而为缺乏有效治疗方法的三阴乳腺癌提供一个潜在的治疗新靶点。方法:40例三阴乳腺癌患者病理组织切片取自重庆医科大学临床病理诊断中心,采用免疫组化法检测Numb蛋白在三阴乳腺癌患者中的表达情况。MCF-10A细胞株和MDA-MB-231细胞株均为ATCC来源,采用qPCR和Western blot法检测对比Numb、HDM2、p53三者的转录水平和蛋白质水平在以上两个细胞株中差异。采用增强型绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,EGFP)质粒转染的方法在MDA-MB-231细胞中重表达Numb,采用q PCR和Western blot法验证Numb、HDM2、p53三者表达的变化。结果:转染NUMB-EGFP后MDA-MB-231细胞中Numb的mRNA和蛋白质水平均明显上调,HDM2无显著改变,p53在转录水平无明显变化,但在蛋白质水平显著升高。在231细胞中上调Numb蛋白可以在转录后水平调节p53水平,使p53蛋白随之显著升高。结论:Numb蛋白在三阴乳腺癌患者中表达降低的比列很高,为55%,且Numb蛋白在三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231中可以调控抑癌因子p53蛋白水平,Numb蛋白水平与p53蛋白水平呈正相关。     

Noggin抑制乳腺癌溶骨性骨转移的作用研究

该文主要研究头蛋白(Noggin)抑制乳腺癌溶骨性骨转移的可能作用机制。通过体外慢病毒感染的方法,将Noggin慢病毒感染乳腺癌MDA-MB-231细胞, Western blot检测Noggin表达情况,利用CCK8和流式细胞术检测细胞增殖和周期改变, Western blot检测BMPs/SMAD信号通路变化和PI3K/Akt/mTOR关键分子Akt和m TOR总的蛋白和磷酸化蛋白的改变,裸鼠胫骨贴骨注射乳腺癌细胞复制骨转移动物模型,通过X片检测Noggin对乳腺癌溶骨性骨缺损的影响,免疫组化检测乳腺癌骨转移组织中Akt总的蛋白、磷酸化蛋白以及细胞核增殖抗原PCNA的改变。Noggin组的Noggin蛋白表达明显升高, Noggin慢病毒感染MDA-MB-231细胞第3天, CCK8检测其吸光度值为(0.452±0.059),显著低于RFP组(0.683±0.064),并且将细胞周期阻滞在G1期; Western blot显示Akt和mTOR总的蛋白未发生改变、磷酸化蛋白表达明显降低;乳腺癌溶骨性骨转移动物模型中Noggin组的溶骨性缺损明显低于RFP组,免疫组化结果显示PI3K/Akt/mTOR中关键分子Akt磷酸化蛋白、PCNA表达明显降低。Noggin可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路的激活来抑制乳腺癌的溶骨性骨转移。     

鞘氨醇激酶1参与依托泊苷抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移的研究

目的利用抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞中SK-1基因表达,结合依托泊苷对细胞增殖的影响,研究乳腺癌的治疗新方法。方法将依托泊苷分别处理野生型及SK-1敲除型MDA-MB-231细胞,^3H-TdR掺入法分析细胞增殖,Transwell法分析细胞迁移,Western印迹检测SK-1蛋白表达及细胞周期检验点相关信号因子的蛋白表达,RT-PCR检测细胞内SK-1的mRNA表达量。结果依托泊苷在较高剂量时,MDA-MB-231细胞存活率明显下降,但依托泊苷却呈浓度依赖性促进乳腺癌细胞SK-1 mRNA及蛋白水平表达,将SK-1敲除,细胞迁移率下降,而且可以增强G1期各抑癌基因的激活或高表达,使细胞周期阻滞。结论SK-1基因敲除有效增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。     

沉默FBI-1基因对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和凋亡的影响

本研究旨在观察短发夹状RNA (short hairpin RNA, shRNA)介导的人类免疫缺陷病毒短转录诱导物连接因子1 (FBI-1)基因沉默对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和凋亡的影响。用qRT-PCR和Western blot分别检测FBI-1、Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase3和Survivin的mRNA和/或蛋白的表达水平;采用shRNA干扰技术沉默MDA-MB-231细胞中FBI-1基因的表达;用CCK-8法以及克隆形成实验检测细胞增殖;用流式细胞术检测细胞凋亡;用裸鼠皮下成瘤实验检测细胞的成瘤能力。结果显示,MDA-MB-231细胞的FBI-1 mRNA和蛋白的表达水平明显高于正常乳腺上皮细胞MCF-10A;经shRNA靶向沉默FBI-1基因表达后,细胞增殖能力明显降低,细胞凋亡率显著增高,伴随Bcl-2和Survivin蛋白表达明显下调、Bax蛋白表达显著上调和Caspase 3活化,MDA-MB-231细胞的裸鼠皮下成瘤能力受抑制。以上结果提示,靶向沉默FBI-1基因表达可以抑制MDA-MB-231细胞增殖,诱导细胞凋亡并抑制细胞的裸鼠皮下成瘤能力。     

SOX7基因启动子甲基化水平对乳腺癌MDA-MB-231细胞株体外迁移和侵袭的影响

目的:探讨乳腺癌MDA-MB-231细胞中,Y性别决定区基因7(SOX7)基因启动子甲基化水平对细胞的体外迁移和侵袭的影响。方法:脂质体转染pcDNA3.0-DNA甲基转移酶3a(DNMT3a)质粒至MDA-MB-231细胞中,并于24h、48h及72h后,采用蛋白质免疫印迹实验(WB)检测细胞内DNMT3a蛋白表达水平;甲基化特异性定量PCR(Q-MSP)检测DNMT3a处理组、5-aza-C处理组及对照(Control)组MDA-MB-231细胞中的SOX7基因启动子DNA甲基化水平;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及WB实验检测各组MDA-MB-231细胞中的SOX7 m RNA和蛋白表达水平;细胞划痕实验及细胞侵袭实验检测各组MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力。结果:pcDNA3.0-DNMT3a质粒转染MDA-MB-231细胞24h时,细胞内的DNMT3a蛋白表达水平最高。DNMT3a能够显著提高SOX7基因启动子DNA甲基化水平,而5-aza-C则抑制了SOX7基因启动子DNA甲基化水平(P0.05)。与Control组相比,DNMT3a处理组的MDA-MB-231细胞中,SOX7的m RNA及蛋白表达水平均明显下降,而5-aza-C处理组SOX7的m RNA及蛋白表达水平均明显增加(P0.05)。与Control组相比,DNMT3a处理组的MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力均显著增强(P0.05),而5-aza-C处理组的MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力变化不大(P0.05)。结论:在恶性肿瘤中,SOX7低表达表受其基因启动子高甲基化调节,且乳腺癌MDA-MB-231细胞中低表达的SOX7能够影响细胞的外迁移和侵袭能力。     

敲低CXCR4表达抑制胃癌细胞HGC27的增殖

目的:初步探索CXCR4与胃癌细胞HGC27增殖的关系。方法:构建携带CXCR4短发夹RNA(shRNA)的慢病毒载体质粒,并转染至293T细胞中,48 h后收集上清感染HGC27细胞,用Western印迹鉴定其干扰CXCR4蛋白表达的效果,采用CCK8实验检测敲低CXCR4表达对HGC27细胞增殖的影响。结果:双酶切鉴定和基因测序表明敲低CXCR4慢病毒载体质粒构建成功;慢病毒感染后有效抑制HGC27细胞中CXCR4蛋白水平,敲低CXCR4表达对HGC27细胞增殖有显著的抑制作用。结论:CXCR4参与了胃癌细胞HGC27的增殖,提示CXCR4有望成为一个新的胃癌治疗靶点。     

PRMT5调控三阴性乳腺癌对多西他赛敏感性的研究

目的:探讨蛋白质精氨酸甲基转移酶5(protein arginine methyltransferase 5,PRMT5)对三阴性乳腺癌对多西他赛敏感性的影响,为三阴性乳腺癌的治疗提供新的思路。方法:通过包装慢病毒构建PRMT5过表达稳转细胞系和PRMT5敲除细胞系。采用平板克隆测定不同浓度下多西他赛对于MDA-MB-231细胞和PRMT5过表达细胞增殖的影响。采用流式周期和凋亡检测不同浓度多西他赛对PRMT5过表达和PRMT5敲除以及MDA-MB-231亲本细胞的周期以及凋亡的影响。采用Western Blot方法检测PARP以及p21、p27及LC3等表达。结果:成功构建PRMT5过表达及敲除稳转系。与对应对照组(MDA-MB-231细胞)比较,4nM和8nM的多西他赛处理的PRMT5过表达细胞系(MDA-MB-231-PRMT5细胞)形成克隆率明显降低(P0.05),细胞凋亡率明显增加(P0.05),细胞周期p21分子表达增多(P0.05),但未随浓度增加增高(P0.05),cycling D1、PARP剪切体、LC3-Ⅱ的表达均明显增加(P0.05)。4nM和8nM的多西他赛处理的PRMT5敲除稳转系(MDA-MB-231-sh PRMT5)细胞凋亡率、p21、p27、cyclin D1、LC3-Ⅱ的表达均较对应对照组(MDA-MB-231细胞)明显降低(P0.05),LC3-Ⅱ表达水平较亲本低(P0.05)。结论:PRMT5高表达可增加MDA-MB-231细胞对多西他赛的敏感性,PRMT5有望成为多西他赛临床治疗敏感性预测和方案选择的关键分子,并有望成为调控多西他赛等化疗药物耐药的新靶点。     

人CCAAT增强子结合蛋白β抑制骨肉瘤细胞增殖

目的:构建带Myc标签的CCAAT增强子结合蛋白β(C/EBPβ)的真核表达载体,并检测其对骨肉瘤细胞增殖的影响。方法:应用PCR技术从人乳腺文库中扩增C/EBPβ全长编码区基因,并克隆到pXJ-40载体中;将重组质粒转染人胚胎肾293T细胞,采用SDS-PAGE和Western印迹鉴定蛋白表达;另将重组C/EBPβ质粒转染入骨肉瘤细胞系U20S,生长实验检测其对肿瘤细胞增殖的影响。结果:基因测序和双酶切鉴定表明,Myc-C/EBPβ真核表达质粒构建成功;SDS-PAGE和Western印迹结果显示,Myc-C/EBPβ转染人胚胎肾293T细胞后获得表达;生长实验证明C/EBPβ具有抑制骨肉瘤细胞增殖的功能。结论:构建了Myc-C/EBPβ的真核表达载体,为全面了解C/EBPβ的生物学功能及调控机理奠定了基础。     

RNA干扰对MDA-MB-231细胞中CaSR基因表达的影响

目的:运用RNA干扰技术,观察siRNA表达载体在乳腺癌细胞MDA-MB-231中对CaSR基因表达的影响。方法:构建靶向CaSR基因的RNA干扰表达载体,用脂质体转染乳腺癌细胞株MDA-MB-231,运用Real-Time荧光定量PCR,Westernblot技术分别从mRNA以及蛋白表达水平检测CaSR基因表达的变化。结果:所构建的质粒载体成功的在MDA-MB-231细胞中抑制了CaSR mRNA及其蛋白的表达。与对照组相比,psiRNA-CaSR载体对CaSR mRNA的抑制率达到65%,对CaSR蛋白抑制率约为70%。结论:实验证明所设计的shRNA片段可以有效地抑制CaSR基因的表达,为下一步研究工作奠定了基础。     

Slug慢病毒表达载体的构建及对ZR75-1细胞上皮间质转化的影响

目的:构建锌指蛋白Slug基因的慢病毒真核表达载体,研究Slug对ZR75-1乳腺癌细胞上皮间质转化及迁移的影响。方法:以乳腺文库为模板,PCR扩增Slug全长编码序列,将其插入pCDH表达载体,构建pCDH-Slug真核表达载体,转染293T细胞,Western印迹检测Slug的表达;将重组质粒包装慢病毒感染ZR75-1细胞,用嘌呤霉素筛选得到稳定表达Slug的ZR75-1乳腺癌细胞,Western印迹和免疫荧光检测Slug对E-钙黏蛋白表达的影响,采用划痕实验检测Slug在ZR75-1乳腺癌细胞中对细胞迁移的影响。结果:双酶切实验证明Slug慢病毒表达载体构建成功;Western印迹表明Slug在293T细胞内表达成功;稳定表达Slug的ZR75-1乳腺癌细胞株构建成功;镜下观察发现,稳定表达Slug的ZR75-1乳腺癌细胞形态变为梭形;Slug在ZR75-1乳腺癌细胞中可以抑制E-钙黏蛋白的表达;划痕实验发现Slug在ZR75-1乳腺癌细胞中可以促进细胞迁移。结论:构建了Slug慢病毒真核表达载体,Slug可以促进上皮间质转化,并通过调控E-钙黏蛋白表达促进细胞迁移。