SK-1基因敲除联合阿霉素抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖和迁移

目的:将乳腺癌MDA-MB-231细胞的SK-1基因敲除,结合阿霉素对细胞增殖和迁移的抑制作用,研究乳腺癌的治疗新方法.方法:将阿霉素分 别感染野生型及SK-1敲除型MDA-MB-231细胞,3H-TdR掺入法分析细胞增殖,RT-PCR检测细 胞内SK-1的mRNA表达量,Western blot 检测SK-1蛋白表达及细胞凋亡相关因子caspase 3的蛋白表达,Transwell法分析细胞迁移. 结果:阿霉素感染MDA-MB-231细胞,抑制细胞增殖和迁移,细胞存活率明 显下降;阿霉素呈浓度依赖性及时间依赖性抑制SK-1 mRNA及蛋白水平表达;将SK-1基因敲 除,细胞迁移率下降,协同阿霉素的作用,迁移率进一步下降,且将导致细胞凋亡.结论: SK-1基因敲除可增强阿霉素对乳腺癌细胞增殖和迁移的抑制作用.     

慢病毒介导的靶向c-Met可诱导shRNA稳定乳腺癌MDA-MB-231细胞系的构建及生物活性鉴定

目的:探讨适当敲除c-Met后对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响。方法:设计3条针对c-Met基因不同位点的短发夹RNA(shRNA)片段,将其连接到TA载体上,瞬时转染MDA-MB-231细胞,采用RT-PCR、Western印迹检测c-Met mRNA及蛋白表达情况,挑选沉默效率最佳的shRNA。以scramble为阴性对照,MDA-MB-231细胞为空白对照,挑选沉默效率最佳的TA-shRNA,并将其与pSD400慢病毒载体连接,利用293T细胞进行慢病毒组装,收集病毒液并感染MDA-MB-231细胞,将嘌呤霉素与MDA-MB-231细胞共培养,筛选稳定表达shRNA的细胞株。利用多西环素对稳定细胞系进行诱导,Western印迹检测稳定细胞系c-Met蛋白的表达量,MTT法检测敲低c-Met对稳定细胞系增殖的影响。结果:测序结果表明模板序列与设计序列正确,并筛选出沉默效率最高的shRNA为shRNA1,慢病毒包装后筛选出稳定细胞株,适当敲除MDA-MB-231细胞c-Met基因后细胞的增殖明显低于对照组。结论:构建了针对c-Met基因可诱导shRNA的乳腺癌稳定细胞系,为探讨适当敲除c-Met基因后乳腺癌细胞对化疗、放疗敏感性检测奠定了基础。     

二十二碳六烯酸增强MDA-MB-231细胞对5-FU敏感性的研究

目的:探讨二十二碳六烯酸(DHA)对5-FU诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖与凋亡的作用及对Wnt/1β-Catenin信号传导通路的影响.方法:采用四甲基偶氮唑蓝(MTT),测定DHA对5-FU诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖活性的作用;应用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率;RT-PCR检测MDA-MB-231细胞β-catenin、GSK-3β基因的表达情况;Western blot检测MDA-MB-231细胞3-catenin、GSK-3β、磷酸化GSK-3β(Ser9)蛋白的表达情况;细胞免疫组化染色观察DHA及DHA联合Licl对3-Catenin蛋白细胞内表达及定位的影响.结果:20 μg/ml、40μg/ml的DHA分别与5-FU联合应用,可增强5-FU对MDA-MB-231细胞增殖抑制作用.DHA(20 μg/ml)能促进5-FU增强MDA-MB-231细胞G0/G1期阻滞作用、降低细胞增殖指数及诱导细胞的凋亡.DHA作用于MDA-MB-231细胞后,β-catenin基因及蛋白表达水平下降(P＜0.05)、GSK-3β的基因及蛋白表达水平无明显变化(P＞0.05),磷酸化GSK-3β(Ser9)蛋白表达水平下降(P＜o.05).结论:DHA能增强5-FU对MDA-MB-231细胞增殖抑制和诱导凋亡,起化疗增敏作用,可能与其通过抑制GSK-3β磷酸化来阻断Wnt/β-Catenin信号通路有关.     

靶向下调FOXM1 基因表达对乳腺癌MDA-MB-231 细胞增殖的影响

目的：探讨靶向抑制FOXM1 对乳腺癌细胞增殖能力的影响,为乳腺癌的个性化靶向治疗提供理论依据。方法：利用重组真 核转录载体pSilencer1.0-U6-FOXM1-shRNA,脂质体法转染乳腺癌细胞株MDA-MB-231,下调其FOXM1基因表达。采用四甲基 偶氮唑盐(MTT) 比色法、平板克隆形成实验观察细胞增值曲线以及克隆形成能力;采用实时定量- 聚合酶链反应(Real-time qPCR)、蛋白免疫印迹法（Western blot）分别检测FOXM1 基因在mRNA、蛋白水平的表达变化。结果：重组载体pSilencer1. 0-U6-FOXM1-shRNA转染MDA-MB-231细胞后,与对照组相比,增殖速率明显下降（P<0.05）,平板克隆形成显著减少（P<0.05）, 重组载体转染后显著抑制MDA-MB-231 细胞中FOXM1 基因在mRNA、蛋白水平的表达。结论：沉默FOXM1 基因对乳腺癌细胞 株MDA-MB-231 生长具有抑制作用,为阐明乳腺癌发病机制提供了新的切入点,也为临床抑制肿瘤生长提供了新的作用靶点。     

沉默FBI-1基因对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和凋亡的影响

本研究旨在观察短发夹状RNA (short hairpin RNA, shRNA)介导的人类免疫缺陷病毒短转录诱导物连接因子1 (FBI-1)基因沉默对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和凋亡的影响。用qRT-PCR和Western blot分别检测FBI-1、Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase3和Survivin的mRNA和/或蛋白的表达水平;采用shRNA干扰技术沉默MDA-MB-231细胞中FBI-1基因的表达;用CCK-8法以及克隆形成实验检测细胞增殖;用流式细胞术检测细胞凋亡;用裸鼠皮下成瘤实验检测细胞的成瘤能力。结果显示,MDA-MB-231细胞的FBI-1 mRNA和蛋白的表达水平明显高于正常乳腺上皮细胞MCF-10A;经shRNA靶向沉默FBI-1基因表达后,细胞增殖能力明显降低,细胞凋亡率显著增高,伴随Bcl-2和Survivin蛋白表达明显下调、Bax蛋白表达显著上调和Caspase 3活化,MDA-MB-231细胞的裸鼠皮下成瘤能力受抑制。以上结果提示,靶向沉默FBI-1基因表达可以抑制MDA-MB-231细胞增殖,诱导细胞凋亡并抑制细胞的裸鼠皮下成瘤能力。     

桑叶茶抑制MDA-MB-231细胞增殖及凋亡抑制蛋白的表达

为了研究桑叶茶对MDA-MB-231细胞增殖、凋亡、线粒体膜电位、细胞周期和对肿瘤细胞凋亡抑制蛋白Survivin的作用,探讨其作用机制。本实验采用体外培养MDA-MB-231细胞,采用CCK8法检测桑叶茶对细胞增殖的影响,利用荧光倒置显微镜观察细胞凋亡及线粒体膜电位,采用流式细胞仪分析桑叶茶对MDA-MB-231细胞细胞周期的改变,采用Western Blot印迹法检测桑叶茶对Survivin蛋白表达的影响。研究发现,桑叶茶使MDA-MB-231细胞增殖受到抑制,细胞的凋亡明显增加,线粒体膜电位丧失,细胞周期改变,同时桑叶茶实验组中的Survivin蛋白表达相对于对照组而言,表达量均有所下降,且表达量随着桑叶液浓度的升高而降低。本实验研究表明,桑叶茶能够抑制MDA-MB-231细胞的增殖,促进细胞凋亡,改变细胞周期,同时能够降低凋亡抑制蛋白Survivin表达。     

沉默CXCL1基因抑制三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移、侵袭的研究

为探讨CXCL1基因对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移、侵袭作用的影响,该研究设计针对CXCL1基因的小干扰RNA,用实时荧光定量PCR和酶联免疫吸附测定试验分别在RNA和蛋白质水平上检测干扰效率;采用流式细胞术学技术检测细胞的周期和凋亡情况;采用transwell迁移和侵袭试验分别检测细胞的迁移及侵袭能力。结果显示,与siRNA-NC组细胞相比,siCXCL1-1、siCXCL1-2、siCXCL1-3细胞中CXCL1基因的mRNA和蛋白表达均下调,且si CXCL1-3干扰效率最高,mRNA及蛋白表达水平分别降低了75%(p<0.01)和46%(p<0.01)。细胞凋亡试验和细胞周期试验结果显示,沉默CXCL1基因后对三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞的凋亡和周期无明显影响,差异无统计学意义(p>0.05)。transwell小室迁移和侵袭试验显示,沉默CXCL1基因能够显著抑制三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移和侵袭能力(p<0.01)。研究成果为临床乳腺癌中以CXCL1基因为靶点的分子治疗提供了理论依据。     

慢病毒介导沉默PD-L1基因在乳腺癌细胞中的表达

构建含细胞程序性死亡因子配体1(PD-L1)基因的慢病毒载体三质粒体系,并检测其在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达情况。p MAGic 7.1慢病毒表达载体与质粒△8.91和p VSVG用聚乙烯亚胺(PEI)共转293T包装病毒,感染并筛选获得MDA-MB-231稳转细胞系,检测PD-L1表达情况。(1)MDA-MB-231在3种乳腺癌细胞中PD-L1表达量最高;(2)三质粒转染293T细胞48 h后荧光强度增强,达到90%以上;用病毒感染MDA-MB-231细胞,48 h获得20%左右荧光强度;(3)经筛选的MDA-MB-231稳转细胞系在m RNA水平和蛋白水平低表达PD-L1,其中由p MAGic-sh1包装的病毒干扰能力最强;(4)分别加入病毒后,干扰组细胞增殖能力下降,p MAGic-sh1干扰组细胞在加入病毒7 d后生长速度约为阴性对照的64.77%;(5)混合淋巴实验显示,sh-1干扰组的肿瘤抑制率为35.8%,是正常组的3.06倍,且干扰组的T淋巴细胞活性显著增强。成功通过PEI转染试剂建立了三质粒慢病毒包装体系,该体系获得的慢病毒可有效干扰乳腺癌MDA-MB-231细胞中PD-L1的表达量,所得的干扰细胞株细胞增殖能力下降,可增强T细胞增殖活性及肿瘤细胞杀伤活性。     

靶向下调FOXM1基因表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响

目的：探讨靶向抑制FOXM1对乳腺癌细胞增殖能力的影响,为乳腺癌的个性化靶向治疗提供理论依据。方法：利用重组真核转录载体pSilencer1．0-U6-FOXMI—shRNA,脂质体法转染乳腺癌细胞株MDA-MB-231,下调其FOXM1基因表达。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法、平板克隆形成实验观察细胞增值曲线以及克隆形成能力;采用实时定量·聚合酶链反应（Real—timeqPCR）、蛋白免疫印迹法（Westemblot）分别检测FOXMl基因在mRNA、蛋白水平的表达变化。结果：重组载体pSileneerl．0-U6-FOXMl-shRNA转染MDA-MB-231细胞后,与对照组相比,增殖速率明显下降（P〈0．05）,平板克隆形成显著减少（P〈0．05）,重组载体转染后显著抑制MDA—MB-231细胞中FOXM1基因在mRNA、蛋白水平的表达。结论：沉默FOXMI基因对乳腺癌细胞株MDA—MB-231生长具有抑制作用,为阐明乳腺癌发病机制提供了新的切入点,也为临床抑制肿瘤生长提供了新的作用靶点。     

BSP基因RNA干扰对乳腺癌MDA-MB-231BO细胞生物学特性的影响

旨在研究RNA干扰(RNA interference,RNAi)抑制骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein,BSP)基因表达后对人乳腺癌细胞MDA-MB-231BO生物学特性的影响。应用pSilencer5.1-U6Retro构建针对BSP基因的siRNA逆转录病毒重组表达质粒,将重组质粒转染293细胞制备病毒悬液感染MDA-MB-231BO细胞,利用嘌呤霉素筛选抑制BSP表达的乳腺癌细胞。Western blotting检测细胞内BSP蛋白表达,采用MTT法和集落形成试验检测细胞的增殖,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果显示,成功构建BSP基因RNAi稳定转染的231BO-BSP27细胞。231BO-BSP27细胞内BSP蛋白表达抑制率为69.3%,与对照组细胞相比,231BO-BSP27细胞的生长速率和克隆形成率明显降低;S期细胞数量明显减少,G0/G1期细胞增多。由此证实,逆转录病毒介导的RNAi能实现BSP基因稳定沉默,从而抑制MDA-MB-231BO细胞的生长和增殖。     

MiR-5047在乳腺癌细胞增殖迁移中的作用及表达调控*

探讨miR-5047在乳腺癌细胞中的表达及其在乳腺癌细胞增殖和迁移中的作用,并明确地西他滨在miR-5047表达调控中的作用。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测人乳腺癌细胞系和正常乳腺上皮细胞MCF10A中miR-5047的表达水平;将miR-5047模拟物(mimic),阴性对照(NC)分别转染至MDA-MB-231和MCF7细胞,经平板克隆实验、MTT实验、划痕愈合实验检测乳腺癌细胞的增殖和迁移能力,通过qRT-PCR和Western blot检测相关基因表达及蛋白水平。使用浓度5 μmol/L和10 μmol/L的地西他滨分别处理MDA-MB-231和MCF-7细胞,经qRT-PCR检测不同浓度和处理时间条件下地西他滨对miR-5047表达的影响。同时,通过形态观察和Western blot检测地西他滨对乳腺癌细胞上皮间质转化的影响。与正常乳腺上皮细胞MCF-10A相比,miR-5047在乳腺癌细胞中表达均显著下调。miR-5047过表达可显著抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移,促进上皮细胞标志物E-cadherin的表达,抑制间质细胞标志物Vimentin的表达。不同浓度地西他滨处理MDA-MB-231和MCF7细胞后,miR-5047表达均增强,且10 μmol/L作用48 h效果最显著。地西他滨可诱导MDA-MB-231细胞向上皮样转变。miR-5047在乳腺癌细胞系中表达显著下调,过表达miR-5047可抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移,地西他滨可促进乳腺癌细胞中miR-5047的表达,并诱导细胞向上皮样转变。     

二氢杨梅素抑制人乳腺癌细胞侵袭和下调MMP-2/-9蛋白表达研究

藤茶活性成分二氢杨梅素(3, 5, 7, 3′, 4′, 5′-六羟基-2, 3-二氢黄酮醇,DMY)体外对几种癌细胞具有抗增殖作用,但机制尚未完全清楚．本文研究DMY对人高转移型乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭的影响,并探讨可能的机制．用MTT法检测DMY对MDA-MB-231细胞的增殖抑制率;明胶酶谱分析明胶酶活力;基质金属蛋白酶(MMP-2/-9)的基因表达水平和蛋白质表达水平分别利用实时定量PCR和Western blot分析进行检测．Transwell模型检测DMY对肿瘤细胞侵袭的影响．结果显示,DMY以剂量依赖方式抑制MDA-MB-231细胞的增殖,作用48 h的IC50为73.6 mg/L．DMY显著抑制明胶酶活性和MMP-2/-9蛋白表达,并抑制MMP-2/-9 的mRNA表达水平．此外,DMY不依赖细胞毒作用和以剂量依赖方式抑制MDA- MB-231细胞的侵袭．这些结果提示：DMY能显著抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭和增殖, 其侵袭抑制的机制可能与其下调MMP-2/-9蛋白表达水平相关．     

Specific expression of the human voltage-gated proton channel Hv1 in highly metastatic breast cancer cells, promotes tumor progression and metastasis

The newly discovered human voltage-gated proton channel Hv1 is essential for proton transfer, which contains a voltage sensor domain (VSD) without a pore domain. We report here for the first time that Hv1 is specifically expressed in the highly metastatic human breast tumor tissues, but not in poorly metastatic breast cancer tissues, detected by immunohistochemistry. Meanwhile, real-time RT-PCR and immunocytochemistry showed that the expression levels of Hv1 have significant differences among breast cancer cell lines, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-453, T-47D and SK-BR-3, in which Hv1 is expressed at a high level in highly metastatic human breast cancer cell line MDA-MB-231, but at a very low level in poorly metastatic human breast cancer cell line MCF-7. Inhibition of Hv1 expression in the highly metastatic MDA-MB-231 cells by small interfering RNA (siRNA) significantly decreases the invasion and migration of the cells. The intracellular pH of MDA-MB-231 cells down-regulated Hv1 expression by siRNA is obviously decreased compared with MDA-MB-231 with the scrambled siRNA. The expression of matrix metalloproteinase-2 and gelatinase activity in MDA-MB-231 cells suppressed Hv1 by siRNA were reduced. Our results strongly suggest that Hv1 regulates breast cancer intracellular pH and exacerbates the migratory ability of metastatic cells.     

The monoamine oxidase-A inhibitor clorgyline promotes a mesenchymal-to-epithelial transition in the MDA-MB-231 breast cancer cell line

Monoamine oxidase-A (MAO-A) dysfunction has been historically associated with depression. Recently, depression as well as altered MAO-A expression have both been associated with a poor prognosis in cancers, although the mechanism involved remains ambiguous. For example, MAO-A mRNA is repressed across cancers, yet MAO-A protein and levels of serotonin, a substrate of MAO-A implicated in depression, are paradoxically increased in malignancies, including breast cancer.The effect of clorgyline (CLG), a selective inhibitor of MAO-A, on malignant behaviour, expression of transitional markers, and biochemical correlates was examined in two human breast carcinoma cell lines, i.e. the epithelial, oestrogen receptor (ER)-positive MCF-7 cell line and the post-EMT (mesenchymal), ER-negative MDA-MB-231 cell line.CLG exerted little effect on malignant behaviour in MCF-7 cells, but inhibited proliferation and anchorage-independent growth, and increased invasiveness and active migration of MDA-MB-231 cells. CLG induced the expression of the mesenchymal marker vimentin in MCF-7 cells, but not in MDA-MB-231 cells. In contrast, CLG induced the epithelial protein marker E-cadherin in both cell lines, with a more robust effect in MDA-MB-231 cells (where a nuclear E-cadherin signal was also detected). This effect appears to be independent of any canonical Snai1-mediated regulation of E-cadherin mRNA expression. CLG interfered with the β-catenin/[phospho]GSK-3β complex as well as the E-cadherin/β-catenin complex in both cell lines cells, but, again, the effect was more robust in MDA-MB-231 cells. Parallel studies revealed a general lack of effect of CLG on the ER-negative, epithelial Au565 breast cancer cell line. Thus, any effect of CLG on metastatic behaviours appears to rely on the cell's EMT status rather than on the cell's ER status.These data suggest that inactivation of MAO-A triggers a mesenchymal-to-epithelial transition in MDA-MB-231 cells via a non-canonical mechanism. This potentially implicates an MAO-A-sensitive step in advanced breast cancer and should be borne in mind when considering pharmacological treatment options for co-morbid depression in breast cancer patients.     

Cas9蛋白对亲骨转移人乳腺癌细胞株生物学性质和超微结构的影响

目的：构建表达Cas9蛋白的亲骨转移人乳腺癌细胞株,并研究Cas9蛋白的表达对细胞生物学性质和超微结构的影响,为利用CRISPR/Cas9技术研究乳腺癌骨转移分子机制提供实验基础。方法：通过慢病毒载体介导Cas9蛋白基因转染亲骨转移人乳腺癌细胞株MDA-MB-231BO,通过G418筛选转染细胞,采用流式细胞术、Western blot、免疫细胞化学验证Cas9基因转染是否成功;运用实时无标记动态细胞分析技术和细胞划痕实验检测Cas9蛋白表达对细胞增殖及迁移的影响;透射电镜观察Cas9蛋白表达对细胞超微结构的影响。结果：成功构建稳定表达Cas9蛋白的亲骨转移人乳腺癌细胞株MDA-MB-231BO-Cas9,Cas9蛋白的表达对细胞的增殖、迁移和超微结构无明显影响。结论：MDA-MB-231BO-Cas9细胞可用于CRISPR/Cas9技术进一步研究。     

表没食子儿茶素没食子酸酯抑制乳腺癌细胞增殖和迁移

表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate, EGCG）是茶叶活性物质主要成分.EGCG可预防或治疗多种肿瘤.本文旨在探讨EGCG对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、凋亡及迁移力的作用及其机制. 经EGCG处理后,通过流式细胞术及噻唑蓝（MTT）法发现,EGCG使MDA-MB-231细胞周期阻滞,细胞凋亡数量上升,明显抑制乳腺癌细胞的存活率. EGCG处理后,MDA-MB-231细胞的形态由正常的纤维状变为鹅卵石状. 免疫荧光染色及免疫印迹结果表明,其上皮细胞标志物表达量增加,而间质标志物表达量下降. 通过划痕实验发现,EGCG明显抑制了细胞迁移能力. 本文揭示了EGCG通过抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞周期进程,促进间质-上皮转化,抑制乳腺癌细胞增殖和迁移.     

Biological and Clinical Significance of MAD2L1 and BUB1, Genes Frequently Appearing in Expression Signatures for Breast Cancer Prognosis

To investigate the biologic relevance and clinical implication of genes involved in multiple gene expression signatures for breast cancer prognosis, we identified 16 published gene expression signatures, and selected two genes, MAD2L1 and BUB1. These genes appeared in 5 signatures and were involved in cell-cycle regulation. We analyzed the expression of these genes in relation to tumor features and disease outcomes. In vitro experiments were also performed in two breast cancer cell lines, MDA-MB-231 and MDA-MB-468, to assess cell proliferation, migration and invasion after knocking down the expression of these genes. High expression of these genes was found to be associated with aggressive tumors and poor disease-free survival of 203 breast cancer patients in our study, and the association with survival was confirmed in an online database consisting of 914 patients. In vitro experiments demonstrated that lowering the expression of these genes by siRNAs reduced tumor cell growth and inhibited cell migration and invasion. Our investigation suggests that MAD2L1 and BUB1 may play important roles in breast cancer progression, and measuring the expression of these genes may assist the prediction of breast cancer prognosis.