表达T~+Pm保护性抗原的重组猪霍乱沙门氏菌C500株的构建及其生物学特性

【目的】本研究利用Asd+平衡致死系统构建表达巴氏杆菌毒素(Pasteurella multocida toxin,PMT)的重组猪霍乱沙门氏菌株,并对重组菌株的生物学特性进行比较研究。【方法和结果】通过基因克隆的方法构建表达PMT的重组质粒pYA-PmtC,再将其电转化减毒猪霍乱沙门氏菌C500的asd基因缺失株C501,构建口服活疫苗菌株C501(pYA-PmtC)。研究结果表明重组菌株C501(pYA-PmtC)的生化特性、血清型和生长速度与亲本菌株C500一致;在没有选择压力的条件下,C501(pYA-PmtC)能够稳定遗传重组质粒及其外源基因片段,并能稳定、高效、分泌性表达30.5kDa的外源保护性抗原rPmtC。C501(pYA-PmtC)腹腔感染BALB/c小鼠的LD50为8.5×106CFU,毒力稍低于C500(LD50为4.4×106CFU);口服接种C501(pYA-PmtC)和C500的所有仔猪未见任何发病症状,两者没有显著差别。【结论】本研究利用Asd+平衡致死系统的原理构建表达T+Pm保护性抗原重组猪霍乱沙门氏菌弱毒菌株C501(pYA-PmtC),为进一步开发猪萎缩性鼻炎-副伤寒的双价基因工程疫苗奠定基础。     

基于谷氨酸消旋酶基因(murI)构建杀香鱼假单胞菌减毒活疫苗株的染色体-质粒平衡致死表达系统

【目的】构建一种基于谷氨酸消旋酶(MurI)基因的染色体-质粒平衡致死系统,用于杀香鱼假单胞菌减毒活疫苗株(Pseudomonas plecoglossicida ΔtssD-1, Pp ΔtssD-1)中表达外源抗原,为开发多联活疫苗提供新的思路和方法。【方法】利用同源重组技术,将亲本株Pp ΔtssD-1中的murI基因敲除,构建murI基因缺失突变株;将广宿主穿梭质粒pBBR1MCS-2的卡那霉素抗性基因替换为murI基因,构建平衡致死质粒(即无抗性回补质粒);在平衡致死质粒的多克隆位点处插入绿色荧光蛋白以检测外源抗原是否稳定表达,对重组菌株进行生物学特性分析,包括生长曲线、质粒稳定性和外源抗原表达水平。【结果】murI基因缺失株在不含D-谷氨酸的LB培养基上无法生长;无抗性回补株在不含D-谷氨酸的LB培养基上恢复了生长能力,但生长速度低于亲本株;经鉴定外源抗原可在无抗性质粒中稳定表达,并可在荧光显微镜下观察到明显的绿色荧光信号;此外,平衡致死质粒在重组菌株中具有良好的遗传稳定性。【结论】本研究以murI为靶点构建了新型的染色体-质粒平衡致死系统,可在无抗性筛选条件下在Pp ΔtssD-1中表达外源抗原,为开发多联活疫苗提供了新的策略和方法。     

减毒沙门氏菌用作重组口服活疫苗载体的研究

减毒沙门氏菌不仅被用于预防沙门氏菌的感染,还可以作为异源抗原的载体,构建成表达其它病原体保护性抗原的活疫苗,通过口服免疫获得相应局部免疫、体液免疫和细胞免疫反应。本文从其减毒机理、重组菌构建方法等方面进行综述     

新型生长抑素原核表达质粒的构建及表达鉴定

将生长抑素(SS)与乙肝表面抗原(S)融合基因插入平衡致死系统原核表达质粒pYA3493中, 转化至缺失asd基因的减毒猪霍乱沙门氏菌C500, 经酶切、测序筛选得到非抗性的目的克隆, 命名为pYA-SS。应用SDS-PAGE和Western blotting 技术分离并检测融合蛋白在宿主菌中的表达活性。结果表明, 本试验构建的非抗性筛选生长抑素原核表达质粒可以在宿主菌C500中稳定、正确表达。此研究为开发新型、高效、安全的促生长疫苗提供了可靠的研究材料。     

新型生长抑素原核表达质粒的构建及表达鉴定

将生长抑素(SS)与乙肝表面抗原(S)融合基因插入平衡致死系统原核表达质粒pYA3493中, 转化至缺失asd基因的减毒猪霍乱沙门氏菌C500, 经酶切、测序筛选得到非抗性的目的克隆, 命名为pYA-SS。应用SDS-PAGE和Western blotting 技术分离并检测融合蛋白在宿主菌中的表达活性。结果表明, 本试验构建的非抗性筛选生长抑素原核表达质粒可以在宿主菌C500中稳定、正确表达。此研究为开发新型、高效、安全的促生长疫苗提供了可靠的研究材料。     

宋内Ⅰ相抗原和霍乱CT-B共表达的免疫保护效果观察

将编码宋内氏痢疾菌(Shigella sonnei)I相O抗原的基因和霍乱弧菌(Vibrio choler-ae)的CT-B基因克隆至带asd基因的质粒PYA248,得重组质粒PMGL105。将该重组质粒转入asd基因缺失的减毒伤寒沙门氏菌X4072,构成了一个不带抗药性基因的载体-宿主平衡致死系统。一系列实验表明,该重组菌X4072(PMGL105)能稳定地表达宋内I相O抗原和霍乱弧菌的CT-B抗原。小鼠免疫保护实验表明,该重组菌对有毒的宋内氏I相痢疾杆菌及霍乱弧菌的攻击均具有良好保护作用。     

携带TGEV DNA疫苗减毒沙门氏菌的构建及安全性与免疫性分析

【目的】探讨以减毒沙门氏菌为载体,进行TGEV DNA疫苗口服免疫可行性。【方法】通过RT-PCR扩增TGEV四川株（SC-H）S基因5’端约2.1 kb的主要抗原位点片段,将其插入真核表达载体pVAX1,构建重组质粒pVAX-S,体外转染COS7细胞,间接免疫荧光检测S基因表达。通过电转化将pVAX-S转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,构建SL7207（pVAX-S）重组菌,并在体外感染小鼠腹腔巨噬细胞,以RT-PCR、间接免疫荧光检测细胞内S基因的转录与表达情况。将SL7207（pVAX-S）重组菌以5×108、1×109、2×109CFU剂量口服接种BALB/c小鼠,分析其安全性,并以1×109CFU剂量的重组菌3次免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA检测免疫小鼠的血清IgG与肠道粘膜IgA抗体。【结果】成功构建重组质粒pVAX-S,且重组质粒能在COS7细胞中表达。重组菌SL7207（pVAX-S）感染巨噬细胞后检测到目的基因的转录、表达。小鼠口服接种不同剂量重组菌,具有良好的安全性。免疫小鼠于二免后两周可检测到针对TGEV S蛋白的特异性血清IgG与肠道粘膜IgA抗体,且三免后两周与SL7207（pVAX1）空载体免疫组间分别存在显著性差异（P<0.05）和极显著性差异（P<0.01）。【结论】携带TGEV DNA疫苗的减毒沙门氏菌小鼠试验显示了良好的免疫原性与安全性。     

表达大肠杆菌LT—B抗原的减毒鼠伤寒沙门氏菌株的构建

采用无毒的鼠伤寒沙门氏菌sR一1l△Cya,△Crp,△asd菌株作为宿主菌,选择相应的asd+表达载体构建了含大肠杆菌肠毒素B亚基基因(toxB)的重组质粒,并通过两次转化引入宿主菌,构成了平衡致死的重组体。特异性的测定表明,这种无抗药性的杂合菌株能较高水平地表达LT—B抗原,可望成为预防ETEC腹泻和相应的沙门氏菌病双价口服活疫苗的研究基础。     

肠毒素大肠杆菌定居因子CFA/Ⅰ和CS6在减毒福氏志贺氏菌中的共表达

定居因子CFA/I和CS6是肠毒素大肠杆菌 (ETEC)中重要的两种优势抗原 ,是ETEC疫苗研制的首选组分。采用基因重组技术将二者构建在以asd基因为选择标记的重组质粒上 ,与asd基因缺失突变型减毒福氏志贺氏菌FWL0 1构成宿主 载体平衡致死系统。实验结果表明 ,重组疫苗候选株能够稳定表达CFA/I和CS6抗原 ,并可在菌体表面形成相应菌毛。重组菌口服免疫BALB/c小鼠后 ,可诱生相应的抗CFA/I和CS6的特异性血清抗体IgG和分泌型抗体sIgA ,说明以志贺氏菌为载体 ,可以构建同时表达多个定居因子抗原的ETEC多价菌苗     

肠毒素大肠杆菌定居因子CFA／I和CS6在减毒福氏志贺氏菌中的共表达

定居因子CFA／I和CS6是肠毒素大肠杆菌(ETEC)中重要的两种优势抗原,是ETEC疫苗研制的首选组分。采用基因重组技术将二者构建在asd基因为选择标记的重组质粒上,与asd基因缺失突变型减毒福氏志贺氏菌FWL01构成宿主．载体平衡致死系统,实验结果表明,重组疫苗候选株能够稳定表达CFA／I和CS6抗原,并可在菌体表面形成相应菌毛。重组菌口服免疫BALB／c小鼠后,可诱生相应的抗CFA／I和CS6的特异性血清抗体IsG和分泌型抗体sIgA．说明以志贺氏菌为载体．可以构建同时表达多个定居因子抗原的ETEC多价菌苗。     

表达猪肺炎支原体免疫原性基因的重组猪霍乱沙门氏菌对小鼠的免疫原性

【目的】构建表达猪肺炎支原体免疫原性基因的重组猪霍乱沙门氏菌,对重组菌株的生物学特性以及对小鼠的免疫原性进行研究。【方法】分别将猪肺炎支原体的免疫原性基因p36、p46、p65和p97R1-Nrdf克隆到pYA3493,得到重组质粒pYA-36、pYA-46、pYA-65和pYA-97R1-Nrdf。重组质粒和空质粒pYA3493分别电转asd基因缺失株C500ˉ,获得重组菌株C36(pYA-36)、C46(pYA-46)、C65(pYA-65)、C97R1-Nrdf(pYA-97R1-Nrdf)和空质粒菌株CpYA(pYA3493)。研究重组菌株的生物学特性,并以小鼠为动物模型评价重组菌株在口服、肌注两种不同免疫途径下的免疫原性。【结果】成功构建表达猪肺炎支原体免疫原性基因的重组猪霍乱沙门氏菌,重组菌株能表达外源蛋白,生化和生长特性未发生改变,插入的外源基因亦稳定存在。小鼠的免疫原性结果显示:口服C36+C46+C65+C97R1-Nrdf组的猪肺炎支原体抗体极显著高于口服C36+C46+C65组和肌注商品疫苗组(P<0.01),但与肌注C36+C46+C65组无显著性差异(P>0.05);IFN-γ为肌注C36+C46+C65组显著高于肌注商品疫苗组(P<0.05),而与口服C36+C46+C65或C36+C46+C65+C97R1-Nrdf组差异均不显著(P>0.05);IL-4水平为口服C36+C46+C65组>口服C36+C46+C65+C97R1-Nrdf组>肌注商品疫苗组>肌注C36+C46+C65组,但各组之间差异均不显著(P>0.05)。对照组的猪肺炎支原体抗体、IFN-γ以及IL-4均与试验组差异极显著(P<0.01)。【结论】构建的表达猪肺炎支原体免疫原性基因的重组猪霍乱沙门氏菌,采用肌注免疫时具有较好的免疫原性,有望发展为猪肺炎支原体的基因工程疫苗。     

猪霍乱沙门菌载体介导猪瘟病毒DNA免疫研究

构建了猪瘟病毒(CSFV)主要保护性抗原E2基因的真核表达质粒pVAXE2。将其电转化猪霍乱沙门氏菌C500疫苗株,得到了携带pVAXE2质粒的猪霍乱沙门氏菌工程菌株S.C500/pVAXE2,对该菌株的特征、培养特性和生化特性进行了鉴定。分别用1×10⁸CFU、2×10⁹CFU S.C500/pVAXE2经口服或肌肉注射免疫小鼠和家兔,间接ELISA检测免疫动物的特异性抗体,在第三次免疫后2周用20ID50猪瘟兔化弱毒和致死量猪霍乱沙门氏菌强毒株对免疫兔进行攻击。结果表明,S.C500/pVAXE2保持了猪霍乱沙门氏菌原有形态特征、培养特性和生化特性,免疫鼠和兔都产生了抗CSFV和猪霍乱沙门菌的ELISA抗体,免疫家兔能抵抗猪瘟兔化弱毒株和猪霍乱沙门氏菌强毒株的攻击。显示了以S.C500为DNA运输载体构建二联或多联猪用疫苗的可行性。     

减毒鼠伤寒沙门氏菌全长hpaA基因工程菌的构建

为构建表达HpaA蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌 ,并探讨以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体构建H .pylori疫苗株的意义 ,应用PCR法从H .pylori基因组DNA中扩增 783bp的hpaA基因 ,经酶切 连接反应将其克隆入原核表达质粒pTrc99A的NcoⅠ SalⅠ位点 ,并进行了核苷酸序列测定。重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3 2 6 1 ,提取重组菌质粒 ,PCR和酶切鉴定 ,筛选阳性克隆。用SDS PAGE电泳和Westernblot进行HpaA表达分析和鉴定 ,用薄层扫描分析HpaA含量。重组菌C5 7BL 6小鼠喂灌 ,分批两d和 1 0d后处死小鼠 ,取脾和末段回肠进行细菌培养 ,挑菌落提质粒鉴定。结果表明 ,经PCR和酶切证实 ,构建了含 783bphpaA基因的重组原核表达质粒 ,并将后者成功转化了减毒鼠伤寒沙门氏菌。重组菌能表达约3 0kDHpaA蛋白 ,重组HpaA量约占全菌体蛋白量的 3 8 9% ,Westernblot证实其有免疫反应性。小鼠重组菌喂灌两d或 1 0d后 ,脾和末段回肠均发现携目的基因的菌落。这些结果提示 ,构建了表达H .pyloriHpaA的重组减毒…     

鸡白痢沙门菌ipaJ基因的克隆与鉴定

摘要：【目的】从鸡白痢沙门菌C79-13中克隆ipaJ基因,体外表达该蛋白后进行免疫原性分析。【方法】鸡白痢沙门菌C79-13与肠炎沙门菌50041进行抑制差减杂交后获得的片段PEA2、PE31和PE44与猪霍乱沙门菌C500疫苗株pSFD10质粒上ipaJ基因高度同源,拼接后获得了鸡白痢沙门菌完整的ipaJ基因序列。从鸡白痢沙门菌中克隆出ipaJ基因并将其构建到原核表达载体pET-30a(+)上,Western-blot检测体外表达蛋白的免疫原性,同时检测了该基因在鸡白痢沙门菌分离株中的分布。【结果】从鸡白痢沙门菌中克隆了大小为840 bp的ipaJ基因序列,并获得了体外原核表达的大小为37 kDa融合蛋白。该蛋白可与鸡白痢沙门菌阳性血清反应。PCR结果显示该基因广泛存在于鸡白痢沙门菌菌株中。 【结论】本文首次报道和克隆了鸡白痢沙门菌ipaJ基因,并证明了IpaJ蛋白具有免疫原性。     

猪霍乱沙门氏菌C500株△crp△asd缺失株平衡致死载体系统的构建及鉴定

猪霍乱沙门氏菌C500株是用化学方法致弱、用于预防仔猪副伤寒的弱毒疫苗株,虽具有较好的免疫原性,但仍有一定的残余毒力。为了研制更加安全并保持C500株良好免疫原性的弱毒株,及将C500开发为适于粘膜免疫的疫苗活载体,本文构建了猪霍乱沙门氏菌C500株△crp△asd双缺失株平衡致死载体系统。首先构建含缺失320bp的crp(cAMP受体蛋白)基因与蔗糖敏感基因(sacB)的重组自杀性质粒,与C500接合转移,两步法筛选无抗性的△crp缺失株,用PCR证实基因组crp基因的缺失突变。用同样方法在crp缺失株基础上构建asd(天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶)基因缺失株。该缺失株生长必需外源DAP(二氨基庚二酸)。进一步鉴定△crp缺失株的表型、生长特性、毒力等,结果表明△crp△asd缺失株构建成功。△crp△asd缺失株可以用来作为宿主载体平衡致死系统来高效表达外源基因,为深入研究以C500株为载体的口服多价疫苗奠定了基础。     

猪霍乱沙门氏菌递送的双启动子表达载体的构建

猪霍乱沙门氏菌C500株不仅可以作为预防猪沙门氏菌病的活疫苗,还可作为运送其他DNA疫苗的优良载体,并通过粘膜免疫诱导产生针对特定抗原的各种免疫应答。为增强其携带的DNA疫苗的免疫效力,本研究以真核表达载体pEGFP-C1为基础,将其真核启动子CMVie与原核启动子Ptrc串联,并在其多克隆位点MCS下游引入rrnbT1T2转录终止序列,构建了真、原核双启动子表达载体pEGFPPtrcR。用1×TSS法将其转化C500,得到工程菌C500/pEGFPPtrcR,通过SDS-PAGE和Westernblotting鉴定了报告基因EGFP的原核表达,该菌在荧光显微镜下能发出强烈绿色荧光,被证明在体外至少能稳定遗传20代;采用脂质体介导法将pEGFPPtrcR转染Vero细胞,EGFP在胞核和胞浆内表达,24h后观察可到明显绿色荧光。结果表明,双启动子表达载体pEGFPPtrcR构建成功,预示其携带的外源基因既可在C500中表达,又可在体细胞中表达,为研制以C500为载体的新型DNA疫苗的发展开辟了一个新的途径。     

大肠杆菌Ee株SLT-IIeB与FedF基因的融合表达及表达产物的免疫原性研究

根据猪水肿病大肠杆菌Ee株主要免疫原性片段SLT-IIeB和FedF的基因序列,利用PCR技术克隆目的片段,将SLT-IIeB和FedF基因依序串联于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)表达系统的GST下游,在大肠杆菌中成功获得了大小约为63kDa融合蛋白GST-SF,Western blot检测证实表达的融合蛋白具有良好的生物学活性。以纯化的融合蛋白为抗原免疫新西兰兔制备血清,体外活性试验表明,所制备的抗血清能中和Ee株水肿毒素对Vero细胞的病变效应;黏附抑制试验证实抗血清能抑制Ee株对猪小肠刷状缘细胞的黏附。将融合蛋白免疫小鼠,结果表明,GST-SF能够诱发较好的免疫反应,并能提供对Ee株5LD50致死剂量的70%保护率。研究表明GST-SF融合蛋白具有良好的免疫原性,具有良好的应用前景。