表达SLTEC保护性抗原的重组猪霍乱沙门氏菌C500株的构建及生物学特性

摘要:【目的】 利用平衡致死系统构建表达产类志贺氏毒素大肠杆菌(Shiga-like toxin Escherichia coli , SLTEC)保护性抗原的减毒猪霍乱沙门氏菌。【方法】 构建表达SLT-IIeB－FedF的重组质粒 ,再将其电转入终宿主菌减毒猪霍乱沙门氏菌ΔasdC500株中构建成口服活疫苗株 ,经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SLT-IIeB－FedF融合蛋白的表达情况,并观察重组菌体外培养的稳定性。【结果】 　利用宿主-载体平衡致死系统构建了表达SLTEC保护性抗原的重组减毒猪霍乱沙门氏菌     

血清7型胸膜肺炎放线杆菌apxⅡC-/apxⅠA+基因缺失重组菌株的构建与鉴定

通过接合转移和SacB负向筛选方法,成功构建了一株apxⅡC缺失的血清7型胸膜肺炎放线杆菌重组菌株。首先构建重组转移质粒pEHA1。将pEHA1转化供体菌大肠杆菌(E.coliβ2155),并将其与野生型APP血清7型亲本菌混合培养约5h,然后涂到含氯霉素抗性的培养基培养,挑取阳性克隆,接种到无抗性液体培养基,培养后涂于含有蔗糖的的固体培养基,培养一定时间后挑取蔗糖抗性的克隆,即可得到目的突变株。通过PCR、遗传稳定性、外毒素分泌、重组位点序列分析证明重组菌构建成功。通过对重组菌生物学特性进行初步研究,表明突变株生长能力未受影响,对小鼠毒力显著降低。该突变株构建体系的建立为猪传染性胸膜肺炎减毒活疫苗的开发及对胸膜肺炎放线杆菌新基因的功能研究奠定了良好基础。     

猪霍乱沙门氏菌C500株△crp△asd缺失株平衡致死载体系统的构建及鉴定

猪霍乱沙门氏菌C500株是用化学方法致弱、用于预防仔猪副伤寒的弱毒疫苗株,虽具有较好的免疫原性,但仍有一定的残余毒力。为了研制更加安全并保持C500株良好免疫原性的弱毒株,及将C500开发为适于粘膜免疫的疫苗活载体,本文构建了猪霍乱沙门氏菌C500株△crp△asd双缺失株平衡致死载体系统。首先构建含缺失320bp的crp（cAMP受体蛋白）基因与蔗糖敏感基因（sacB）的重组自杀性质粒,与C500接合转移,两步法筛选无抗性的△crp缺失株,用PCR证实基因组crp基因的缺失突变。用同样方法在crp缺失株基础上构建asd（天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶）基因缺失株。该缺失株生长必需外源DAP（二氨基庚二酸）。进一步鉴定△crp缺失株的表型、生长特性、毒力等,结果表明△crp△asd缺失株构建成功。△crp△asd缺失株可以用来作为宿主载体平衡致死系统来高效表达外源基因,为深入研究以C500株为载体的口服多价疫苗奠定了基础。     

伪狂犬病病毒Ea株gE基因主要抗原区在巴斯德毕赤酵母中的表达

伪狂犬病病毒gE蛋白是一种重要的诊断抗原,可用于伪狂犬病根除计划中的鉴别诊断。为了获得大量的抗原,将编码gE主要抗原区域的基因片段插入毕赤酵母表达载体中,得到的重组表达载体转化GS115酵母,通过G418抗性筛选得到一株多拷贝的重组酵母,经甲醇诱导表达了截短的gE蛋白,并分泌到胞外。Western blotting分析显示表达的蛋白大小为33kD。ELISA结果表明表达蛋白具有良好的抗原性,重组酵母的诱导培养上清不需纯化可直接作为抗原检测gE的抗体,这为研制质优价廉的鉴别诊断试剂盒奠定了基础。     

猪霍乱沙门氏菌C500株△crp△asd缺失株平衡致死载体系统的构建及鉴定

猪霍乱沙门氏菌C500株是用化学方法致弱、用于预防仔猪副伤寒的弱毒疫苗株,虽具有较好的免疫原性,但仍有一定的残余毒力。为了研制更加安全并保持C500株良好免疫原性的弱毒株,及将C500开发为适于粘膜免疫的疫苗活载体,本文构建了猪霍乱沙门氏菌C500株△crp△asd双缺失株平衡致死载体系统。首先构建含缺失320bp的crp(cAMP受体蛋白)基因与蔗糖敏感基因(sacB)的重组自杀性质粒,与C500接合转移,两步法筛选无抗性的△crp缺失株,用PCR证实基因组crp基因的缺失突变。用同样方法在crp缺失株基础上构建asd(天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶)基因缺失株。该缺失株生长必需外源DAP(二氨基庚二酸)。进一步鉴定△crp缺失株的表型、生长特性、毒力等,结果表明△crp△asd缺失株构建成功。△crp△asd缺失株可以用来作为宿主载体平衡致死系统来高效表达外源基因,为深入研究以C500株为载体的口服多价疫苗奠定了基础。     

鼠伤寒沙门菌外膜蛋白与耐药性关系的分析

目的分析鼠伤寒沙门菌外膜蛋白(OMP)与耐药性的关系。方法用消除剂丫啶橙消除耐药性,盲传测其遗传稳定性,采用超声波物理裂解法制备鼠伤寒沙门菌外膜蛋白标本,用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDA-PAGE)检测外膜蛋白,用紫外分光光度计测其吸光值,计算浓度。结果抗性消除表型能稳定遗传,耐药鼠伤寒沙门菌与敏感鼠伤寒沙门菌都含有6条主要的外膜蛋白条带,两者相比,发现耐药菌的外膜蛋白在约57、53、30 kDa处减弱或缺失,总的蛋白浓度也低于后者。结论鼠伤寒沙门菌耐药性与外膜蛋白的减弱或缺失有关。     

猪霍乱沙门氏菌ΔasdC500株的生物学特性及作为活疫苗表达载体的应用

为了评价猪霍乱沙门氏菌ΔasdC500株作为沙门氏菌Asd+平衡表达系统的可行性,对ΔasdC500株和其亲本菌株C500的生物表型,生长特性、毒力、生物安全性、表达特性等进行比较研究.结果表明:AasdC500缺失株的生化特性和血清型与亲本菌株C500一致,符合猪霍乱沙门氏茵的表型特征;携带平衡表达质粒pYA3493的重组菌株ΔasdC500(pYA3493)与C500的生长速度没有明显差别;根据Reed-Muench法,测定ΔasdC500(pYA3493)腹腔感染BALB/c小鼠的LD50为1.1 x 107CFU,毒力稍低于C500;口服接种AasdC500(pYA3493)和C500的所有仔猪未见任何发病症状,两者没有显著差别;携带重组质粒pYA-F1P2(含有支气管败血波氏杆菌抗原基因fhaB的Type I 区域和prn的R2区域)的重组菌株ΔasdC500(pYA-FIP2)能够稳定遗传重组质粒及其外源基因片段,并能稳定、高效、分泌性表达外源保护性抗原.由此表明,ΔasdC500保留了亲本菌株C500的一系列生物学特征,并可高效表达外源抗原,可作为沙门氏茵Asd+平衡表达系统开发基因工程重组疫苗.     

血清7型胸膜肺炎放线杆菌apxⅡC-/apxⅠA+基因缺失重组菌株的构建与鉴定

通过接合转移和SacB负向筛选方法,成功构建了一株apxⅡC缺失的血清7型胸膜肺炎放线杆菌重组菌株。首先构建重组转移质粒pEHA1。将pEHA1转化供体菌大肠杆菌(E.coliβ2155),并将其与野生型APP血清7型亲本菌混合培养约5h,然后涂到含氯霉素抗性的培养基培养,挑取阳性克隆,接种到无抗性液体培养基,培养后涂于含有蔗糖的的固体培养基,培养一定时间后挑取蔗糖抗性的克隆,即可得到目的突变株。通过PCR、遗传稳定性、外毒素分泌、重组位点序列分析证明重组菌构建成功。通过对重组菌生物学特性进行初步研究,表明突变株生长能力未受影响,对小鼠毒力显著降低。该突变株构建体系的建立为猪传染性胸膜肺炎减毒活疫苗的开发及对胸膜肺炎放线杆菌新基因的功能研究奠定了良好基础。     

猪霍乱沙门氏菌DasdC500株的生物学特性及作为活疫苗表达载体的应用

为了评价猪霍乱沙门氏菌DasdC500株作为沙门氏菌Asd+平衡表达系统的可行性, 对DasdC500株和其亲本菌株C500的生物表型、生长特性、毒力、生物安全性、表达特性等进行比较研究。结果表明: DasdC500缺失株的生化特性和血清型与亲本菌株C500一致, 符合猪霍乱沙门氏菌的表型特征; 携带平衡表达质粒pYA3493的重组菌株DasdC500(pYA3493)与C500的生长速度没有明显差别; 根据Reed-Muench法, 测定DasdC500(pYA3493)腹腔感染BALB/c小鼠的LD50为1.1×107 CFU, 毒力稍低于C500; 口服接种ΔasdC500(pYA3493)和C500的所有仔猪未见任何发病症状, 两者没有显著差别; 携带重组质粒pYA-F1P2 (含有支气管败血波氏杆菌抗原基因fhaB的Type I区域和prn的R2区域)的重组菌株DasdC500(pYA-F1P2)能够稳定遗传重组质粒及其外源基因片段, 并能稳定、高效、分泌性表达外源保护性抗原。由此表明, DasdC500保留了亲本菌株C500的一系列生物学特征, 并可高效表达外源抗原, 可作为沙门氏菌Asd+平衡表达系统开发基因工程重组疫苗。