唾液乳杆菌抑制镰孢霉的研究

目的 研究唾液乳杆菌抑制产毒镰孢霉的生物学性能,初步探索抑菌机制.方法 以禾谷镰孢霉和尖孢镰孢霉2种典型霉菌为指示菌,唾液乳杆菌为测试对象,对霉菌孢子萌芽、孢子生长和菌丝体生长3个生理阶段进行抑制效应观察.结果 10%的唾液乳杆菌耗尽上清就能抑制83%的禾谷镰孢霉孢子和50%尖孢镰孢霉孢子萌芽;耗尽上清24 h内能显著抑制镰孢霉孢子的生长;96 h内孢霉菌丝体的生长.结论 唾液乳杆菌产生的有机酸对禾谷镰孢霉和尖孢镰孢霉生长起主要抑制作用.     

玉米赤霉烯酮生物合成和降解的研究进展

介绍了玉米赤霉烯酮及其6个衍生物的分子结构,以及玉米赤霉烯酮的生物合成途径。阐述了玉米赤霉烯酮生物合成的基因序列群以及基因簇的表达方式。论述了玉米赤霉烯酮钝化和降解过程, 探讨了玉米赤霉烯酮水解酶在基因工程中的应用研究, 并为今后玉米赤霉烯酮生物工程降解研究提出了建议。     

鸡舍环境中tri5基因阳性镰孢菌的分离及其产毒特性

【目的】探讨利用tri5-PCR鉴定产毒镰孢菌的可行性以及tri5阳性菌株的产毒特性和产毒条件。评估鸡舍空气和固体基质中镰孢菌分离株中产单端孢霉烯族毒素潜力的发生率。【方法】利用编码单端孢霉烯族毒素合成酶的起始基因(tri5基因)对139株镰孢菌分离株进行PCR检测,并对tri5阳性菌株进行产毒培养,通过免疫亲和柱-高效液相色谱方法来检测培养产物中的T-2毒素和HT-2毒素含量。【结果】共筛选到42株tri5阳性菌株,其中分离自鸡舍空气中的10株tri5阳性菌株经产毒培养后7株菌株产生T-2毒素(1.36-5 ng/mL)或HT-2毒素(6.1-17.1 ng/mL)。在5℃-20℃间隔24 h变温、光照与黑暗间隔24 h交替、前期振荡后期静止的培养条件下培养9 d镰孢菌的产毒量最高;镰孢菌的产毒量与温度和时间显著相关,而与菌丝体干重无显著相关性。【结论】与传统鉴定产毒镰孢菌的方法比较,tri5-PCR更适用于快速、准确地检测大量鸡舍环境样本中的产毒镰孢菌。本研究为养殖环境的产毒镰孢菌的危害预警和控制提供技术支撑和理论依据。     

禾谷镰孢菌高产毒菌株的构建*

为研究禾谷镰孢菌Fusarium graminearum Schw.单端孢霉烯族毒素生物合成基因（产毒基因）在寄主体内的表达,作者构建了带报告基因GUS（(-葡糖苷酸酶基因）的质粒pGUSTRI6P5,并通过对野生型菌株的转化获得禾谷镰孢高产毒菌株。该质粒含有由TRI5（禾谷镰孢单端孢霉二烯合酶基因）启动子（TRI5 Prom）驱动的GUS基因编码区、潮霉素B抗性基因和拟枝孢镰孢F. sporotrichioides的产毒调控基因TRI6（FSTRI6）。用pGUSTRI6P5转化野生型菌株GZ3639后,在含潮霉素 B的培养基上选取抗性菌落,单孢分离获单孢菌株（转化子）。在GYEP（葡萄糖-酵母粉-蛋白胨）液体培养基上,转化子B4-1和B16-1的GUS比活力强,15-AcDON（15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇）产量高,且两者呈正相关（相关系数（r）分别为0.9839和0.9523）。B4-1和B16-1两个转化子可作为研究禾谷镰孢与其寄主相互作用的工具菌株。     

玉米赤霉烯酮降解酶毕赤酵母表达载体的构建及其表达

目的构建毕赤酵母表达载体pPIC9-ZEN-jjm,筛选高效分泌表达活性目的蛋白的菌株。方法克隆ZEN-jjm基因,经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切连接至pPIC9中,电转化至毕赤酵母GS115。利用RDB培养基和甲醇诱导表达进行筛选。HPLC检测表达蛋白降解玉米赤霉烯酮的活性。结果测序表明ZEN-jjm成功插入pPIC9中,SDS-PAGE表明获得1株高效表达目的蛋白的重组酵母,其分子量约29 kDa。HPLC表明其能有效地降解玉米赤霉烯酮。结论玉米赤霉烯酮降解酶在毕赤酵母中获得了高效分泌表达。     

禾谷镰孢菌高产毒菌株的构建

为研究禾谷镰孢菌Fusarium graminearum Schw.单端孢霉烯族毒素生物合成基因（产毒基因）在寄主体内的表达,作者构建了带报告基因GUS（β-葡糖苷酸酶基因）的质粒pGUSTRI6P5,并通过对野生型菌株的转化获得禾谷镰孢高产毒菌株,该质粒含有由TRI5（禾谷镰隐单端孢霉的二烯合酶基因）启动子（TRI5 Prom)驱动的GUS基因编码区、潮霉素B抗性基因和拟枝孢镰孢F.sporotrichioides的产毒调控基因TRI6（FSTR16）。用pGUSTRI6P5转化野生型菌株GZ3639后,在含潮霉素B的培养基上选取抗性菌落。单孢分离获单孢菌株（转化子）。在GYEP（葡萄糖-酵母粉-蛋白胨）液体培养基上,转化子B4-1和B16-1的GUS比活力强,15-AcDON(15-乙酰脱氧雪腐镰鼠菌烯醇）产量高,且两者呈正相关（相关系数（r)分别为0.9839和0.9523)。B41-1和B16-1两个转化子可作为研究禾谷镰孢与其寄主相互作用的工具菌株。     

青色荧光蛋白标记的禾谷镰孢转化子的构建

【背景】近年来玉米茎腐病在我国大部分玉米产区普遍重度发生,其中镰孢菌茎腐病不仅造成了重大的经济损失,而且镰孢菌产生的毒素给人体和动物的健康也带来严重威胁。【目的】玉米茎腐病的病原组成复杂,禾谷镰孢是其中的主要病原之一,该病原菌侵染寄主导致发病的机制急需深入研究。【方法】以pCAMBIA1300质粒为骨架,利用重叠PCR的方法构建表达青色荧光蛋白的质粒pCAMBIA1300-CFP-Kan,通过农杆菌介导的遗传转化技术,将青色荧光蛋白的编码基因整合到禾谷镰孢基因组中。【结果】经过PCR鉴定和荧光显微观察,确定获得了31株青色荧光标记的禾谷镰孢菌。【结论】侵染试验结果显示,激光共聚焦显微镜下禾谷镰孢在玉米茎秆组织中的定殖位置清晰可见,该结果为进一步研究不同镰孢菌在寄主中的定殖规律奠定了基础。     

来源于Rhinocladiella mackenziei的玉米赤霉烯酮水解酶的表达纯化与酶学性质

【背景】玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是污染最广泛的霉菌毒素之一,对饲料行业和畜牧业造成了巨大的经济损失。目前研究最为广泛的玉米赤霉烯酮降解酶ZHD101因其热稳定性较差,无法满足工业应用上的要求。【目的】为实现玉米赤霉烯酮降解酶在工业上的应用,寻找酶学性质更突出的ZEN降解酶。【方法】基于对Gen Bank数据库的挖掘,发现一个来源于麦氏喙枝孢霉(Rhinocladiella mackenziei CBS 650.93)的Rmzhd基因,构建p ET-46-Rmzhd质粒。利用大肠杆菌表达体系和亲和层析、离子交换纯化体系对蛋白进行表达和纯化,通过高效液相凝胶色谱分析酶学性质。【结果】发现一个新的ZEN水解酶Rm ZHD,RmZHD在pH 8.6和45°C条件下的活性最高,而且具有较高的耐热性。结构分析表明,较高的盐桥数目和溶剂暴露脯氨酸含量可能是造成其高耐热性的原因。【结论】本研究为促进玉米赤霉烯酮降解酶在工业上的应用打下基础。     

来源于麦氏喙枝孢霉的玉米赤霉烯酮水解酶在毕赤酵母中的高效表达及活性分析

【背景】玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)及其衍生物是一群具有雌激素活性的霉菌毒素,广泛存在于被霉菌污染的谷物中,造成食品业和畜牧业的巨大损失。利用专一性高的水解酶进行生物转化可有效去除玉米赤霉烯酮。【目的】构建高效表达玉米赤霉烯酮水解酶的酵母系统,以促进玉米赤霉烯酮水解酶的研究和工业应用。【方法】将来源于麦氏喙枝孢霉(RhinocladiellamackenzieiCBS650.93)的Rmzhd基因转入毕赤酵母中,筛选获得高效表达菌株,通过高效液相色谱分析发酵液中重组酶的性质。【结果】发酵液中Rm ZHD对ZEN的酶活力为16.67 U/m L,对α-ZOL的酶活力为9.85 U/m L。SDS-PAGE检测表达产物的分子量,与理论值30.7k D符合,且发酵上清液蛋白纯度高。Rm ZHD的最适p H值为9.6,最适温度为45°C,并具有较好的耐热性。【结论】研究结果为玉米赤霉烯酮水解酶的异源表达及其潜在的工业应用提供了一定的指导。     

单端孢霉烯族毒素的产生及分子调控机制

禾谷镰刀菌复合种(Fusarium graminearum species complex,FGSC)引起的赤霉病是小麦生产上危害最为严重的病害之一。赤霉病除了造成减产外,感病籽粒中含有多种镰刀菌毒素,如单端孢霉烯族的呕吐毒素,可引起人畜中毒和重大疾病,给食品安全构成严重威胁。过去20年,随着禾谷镰刀菌全基因组序列的公布和遗传转化体系的成熟,禾谷镰刀菌Fusarium graminearum的功能基因组学的研究取得了较大进展,单端孢霉烯族毒素的产生、调控机制及网络研究成为热点。本文综述国内外单端孢霉烯族毒素的生物合成和分子调控机制,包括合成基因簇及决定不同产毒化学型的基因、产毒调控元件、环境因子调控产毒的分子机制,可为小麦抗赤霉病的育种提供新思路,为新型药剂的研发提供分子靶标,为赤霉病的持续防控和毒素污染的有效治理提供理论依据。     

Screening of zearalenone-producing Fusarium species in Egypt and chemically defined medium for production of the toxin

296 isolates of Fusarium spp. from 100 samples of cereale grains were examined for their ability to produce zearalenone on liquid culture medium. Thin layer Chromatographic analysis revealed that the mycotoxin was detected from 45 isolates, (F. oxysporum, 36; F. moniliforme, 8; and F. equiseti, one isolate). A suitable liquid medium and some optimal conditions for the biosynthesis of zearalenone were reported. Glutamine and riboflavin stimulated the production of the toxin. The maximum amount of zearalenone appeared at pH 7, after 12 days of incubation at 20 °C.     

长爪栘[木衣]叶绿体基因组特征系统发育及密码子偏好性分析

长爪栘[木衣](Docynia longiunguis Q. Luo&J. L. Liu)是我国特有的栘[木衣]属植物,具有较高的食药用价值。对其叶绿体基因组进行分析,有助于阐明栘[木衣]属内的系统发育关系,为长爪栘[木衣]资源的开发利用及进一步研究奠定基础。结合其近缘种云南栘[木衣]叶绿体基因组数据,在进行全序列比对后,对其系统发育、密码子偏好性等进行分析。长爪栘[木衣]叶绿体基因组序列总长为158914bp(GenBank登录号为MW367027),总GC含量为36.7%,其中大的单拷贝区(large single-copy, LSC)长度为87 020 bp,小的单拷贝区(small single-copy, SSC)长度为19 156 bp,反向重复区(inverted repeats, IRs)长度为26 369 bp。共注释了102个功能性基因,包括72个蛋白编码基因、26个编码tRNA基因和4个编码rRNA基因。构建系统发育树的最佳模型为TVM+F+R2。系统发育分析结果表明,长爪栘[木衣]与栘[木衣](Docynia indica (Wall.) Dcne.)聚为一支,栘[木衣]属物种与苹果属(Malus)聚为一支。对长爪栘[木衣]及近缘种叶绿体基因组序列进行比对分析,trnY (GUA)-psbD、ndhC-trnV (UAC)、accD-psaI、psbZ-trnFM (CAU)和ndhF-trnL等区域的变异较大,核酸多样性分析则表明有11处Pi值>0.01的高变区域,且都位于LSC区及SSC区。除长爪栘[木衣]外,其他序列中均有trnH基因位于IRs/LSC区交界处且都没有越过边界。密码子偏好分析显示,长爪栘[木衣]叶绿体基因中异亮氨酸的密码子编码数量最多,达到了1 205个。长爪栘[木衣]与山荆子(Malusbaccata(L.)Borkh.)、三叶海棠(Malussieboldii(Regel)Rehd.)、湖北海棠(Malus hupehensis (Pamp.) Rehd.)及木瓜(Chaenomeles sinensis (Thouin) Koehne)的亲缘关系最近;其叶绿体基因密码子更偏好于使用A/T结尾;长爪栘[木衣]叶绿体基因组与其他蔷薇科植物叶绿体基因组在4个边界区域基因分布显示出较大差异,与同属的云南栘[木衣]及栘[木衣]叶绿体基因组差异相对较小。长爪栘[木衣]叶绿体基因组的组装注释、系统发育分析及序列比对分析,为该物种的资源鉴定、开发和利用提供了理论依据。     

白花刺续断野生居群的叶绿体全基因组特征解析

白花刺续断在中国西藏是一种常用的药用植物,但其叶绿体全基因组的相关研究较少。为揭示该物种叶绿体全基因组的基本特征并探讨其谱系遗传结构,该研究利用Illumina测序平台对来自5个野生居群的10个白花刺续断个体进行二代测序,经组装、注释,得到10条完整的叶绿体全基因组序列,并对它们的基因组特征和居群间的谱系进化关系进行了初步研究。结果表明:(1)白花刺续断的叶绿体全基因组大小为155 335～156 266 bp,共注释113个基因,包括72个蛋白编码基因、30个tRNA基因和4个rRNA基因,其叶绿体基因组的大小、结构、GC含量及基因组成等方面在种内高度保守。(2)基因组比较分析表明,白花刺续断变异较大的片段均位于单拷贝区,且IR边界未出现明显的扩张和收缩。(3)群体遗传分析发现,白花刺续断的野生居群具有明显的地理遗传结构,不同居群间在遗传距离与地理距离上具有一定的相关性。研究认为,白花刺续断叶绿体基因组在种内居群水平上比较保守,且叶绿体基因组可在居群水平上揭示物种的地理遗传结构。这为后续开展刺续断属物种群体遗传学和系统发育基因组学研究奠定了基础。     

基于Pacbio第三代测序技术的厚朴基因组测序分析

厚朴为著名的传统药用植物,归于木兰科、木兰属,于我国广泛种植,其树皮、根皮、枝皮、叶片、花、果实均能入药或食用。为获取厚朴全基因组序列信息,该文以厚朴叶片DNA为材料,采用Pacbio Sequel第三代测序技术构建厚朴全基因组数据库,并利用生物信息学方法对获得的核苷酸序列进行组装、功能注释以及进化分析研究。结果表明:(1)原始测序数据过滤后获得140.91 Gb三代数据,Read N50约为13 784bp,经过组装得到厚朴基因组大小为1.68 Gb,Contig N50约为222 069 bp,单拷贝基因完整性为81.0%。(2)组装后的序列通过与NR、KOG、KEGG等功能数据库比对,共有98.40%的基因得到了功能注释,其中KOG功能注释结果发现厚朴的蛋白功能主要集中在一般功能预测、翻译后修饰、蛋白质转换、伴侣以及信号转导机制; GO功能分类表明厚朴的基因集中在细胞组分及生物学过程; KEGG分析发现厚朴参与代谢通路的基因占主要地位。(3)通过与葡萄、拟南芥、水稻、杨树、银杏、无油樟、茶树及牛樟基因组的比对分析,发现厚朴23 424个基因中有20 801个基因可以分类到12 129个家族,其中有515个基因家族为厚朴所特有,而厚朴与牛樟(樟科)亲缘关系较近,两者的分化时间约在122.5百万年前(mya)。该研究首次利用第三代测序技术对厚朴全基因组解析,有利于对其进一步进行深入的开发与利用,也为研究其他药用植物全基因组奠定了基础。     

Effect of delayed harvest on contamination of pearl millet grain with mycotoxin-producing fungi and mycotoxins

The response to delayed harvest of fungal and mycotoxin contamination of grain of the pearl millet hybrid HGM 100 was examined in 1992 and 1993. Samples of grain were assayed from seven plantings at locations near Tifton, Georgia, USA. Grain was harvested at 30, 40, and 50 days after anthesis and evaluated for infection byFusarium species andAspergillus flavus, and mycotoxin contamination. Mean isolation frequencies ofF. semitectum (35.6%) andF. chlamydosporum (17.2%) increased linearly with delayed harvest.Fusarium moniliforme andF. equisiti were infrequently isolated (<0.5%) and did not increase in the grain when harvest was delayed. Low mean concentrations of zearalenone (0.17 ppm), nivalenol (0.42 ppm), and deoxynivalenol (0.01 ppm) were detected but were not affected by delayed harvest. Isolation frequencies ofF. chlamydosporum andF. equiseti were correlated (P=0.07) with levels of nivalenol.Aspergillus flavus was not isolated from the grain, and aflatoxin concentrations averaged 1.9 ppb.     

Pathogenicity of Fusarium Isolates from Wheat, Rye and Triticale Towards Seedlings and their Ability to Produce Trichothecenes and Zearalenone

37 Fusarium isolates (F. culmorum 20, F. graminearum 4, F. avenaceum 3, F. solani 4, and F. equiseti 6 from wheat, rye and triticale) were examined for pathogenicity and tested for zearalenone (F-2) and trichothecenes production in vitro. Strong pathogens (F. culmorum and F. graminearum) produced deoxynivalenol and 3-acetyl-deoxynivalenol and zearalenone in considerable quantities.     

Polymorphism of mycotoxin biosynthetic genes among <Emphasis Type="Italic">Fusarium equiseti</Emphasis> isolates from Italy and Poland

Fusarium equiseti (Corda) Saccardo is a soil saprophyte and a weak pathogen, associated with several diseases of fruit and other crops in subtropical and tropical areas, but also in countries with temperate climate. A wide range of secondary metabolites has been identified among natural F. equiseti populations, with zearalenone (ZEA), fusarochromanone and fusarenon-X being the most common. In present study, the genetic diversity of strains from two populations (from Italy and Poland) was evaluated by analysing the translation elongation factor 1α (tef-1α) sequences, two polyketide synthases from the ZEA biosynthetic pathway (PKS13 and PKS4) and the TRI5 gene from the trichothecene biosynthetic pathway. ZEA was produced in rice cultures by 20 of the 27 tested isolates in concentrations ranging from 1.34 ng/g to 34,000 ng/g). The ability to produce enniatins and trichothecenes was evaluated in all strains by identifying esyn1, TRI13 and TRI4 genes. The presence of PKS4 and PKS13 genes was confirmed by polymerase chain reaction (PCR) in only some ZEA-producing isolates. Similarly, the TRI5 gene was found in 14 of the 27 isolates tested. This is likely to have been caused by the divergence of those genes between F. equiseti and F. graminearum (the latter species was used for the primers design) and can be exploited in phylogenetic studies. The analysis of the mycotoxin biosynthetic gene sequences can be used to differentiate the studied genotypes even more precisely than the analysis of the non-coding regions (like tef-1α).     

2016-2017年宁夏地区牛源金黄色葡萄球菌的全基因组分析

[目的] 了解宁夏地区奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,SA）代表菌株的基因组序列基本特征,进一步探究其耐药基因型、毒力及进化关系,为兽医临床防治提供理论依据。[方法] 采用纸片法对97株金黄色葡萄球菌临床分离株进行抗菌药物敏感性试验,同时进行葡萄球菌蛋白A（Staphylococcus aureus protein A,spa）分型、多位点序列分型（multilocus sequence typing,MLST）,根据分型结果选取16株代表菌株进行全基因组测序,并对获得的测序序列进行处理分析。[结果] 药敏试验结果显示97株分离株对18种抗菌药物存在不同程度的耐药,其中9株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus,MRSA）对青霉素、氨苄西林、苯唑西林、头孢噻呋、磺胺异噁唑、红霉素、庆大霉素和克林霉素等8种抗菌药物完全耐药,甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（methicillin-sensitiveStaphylococcus aureus,MSSA）菌株对青霉素、氨苄西林、磺胺异噁唑耐药率较高。耐药基因数据库（antibiotic resistance genes database,ARDB）注释分析显示16株代表菌株共携带21种耐药基因,其中norA、tet38、bacA、mepA的携带率较高,与药敏试验结果具有一定的相关性。毒力基因数据库（virulence factors of pathogenic bacteria,VFDB）注释分析显示所有菌株携带多种与粘附、宿主免疫逃逸、分泌、胞外酶编码、铁摄取等疾病相关的毒力基因,MRSA菌株均携带较多毒力因子,MSSA菌株携带毒力因子数目不等。基因岛预测结果显示16株代表菌株存在不同数量的基因岛且MRSA菌株携带基因岛数目及毒力基因岛较多,但耐药基因岛数目与MSSA差异不明显。SNP分析结果显示部分分离株同源性较高,同源性较高的两株MRSA的全基因组基本序列特征差异较小,携带的耐药、毒力基因情况相似。[结论] 宁夏地区牛源SA分离株耐药性情况严重且具有较高的毒力水平,本研究为家畜相关MRSA（livestock-associated MRSA,LA-MRSA）与MSSA基因组序列信息的比较分析及宁夏地区SA感染的临床防控提供参考依据。     

森林草莓SUN基因家族的鉴定及其对逆境的响应

SUN基因是调控植物生长发育的关键基因。本研究鉴定了二倍体森林草莓(Fragaria vesca)的SUN基因家族,并对各成员的理化性质、基因结构、系统进化以及基因表达进行了分析。结果表明,森林草莓有31个FvSUN基因,其编码蛋白可聚类为7个组,同一组内成员具有高度相似的基因结构与编码蛋白保守域;FvSUNs蛋白的亚细胞定位主要在细胞核中。共线性分析表明森林草莓FvSUNs基因家族主要通过染色体片段复制产生,拟南芥与森林草莓存在23对直系同源基因。利用森林草莓的转录组数据,对FvSUNs基因的组织表达特征进行分析,发现主要可归为3类：各组织均表达、组织中几乎不表达、组织特异性表达,并通过实时荧光定量PCR (quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)进一步验证结果。此外,还对森林草莓进行不同的逆境胁迫处理,qRT-PCR分析了31个FvSUNs基因的表达情况,发现大部分基因均在不同程度上受低温、高盐或干旱胁迫的诱导表达。这些研究结果为深入揭示草莓SUN基因的生物学功能及其分子机制奠定了基础。     

金针菇几丁质合成酶基因家族鉴定及其表达分析

【背景】几丁质是真菌细胞壁的重要成分,由几丁质合成酶（chitin synthase,CS）催化合成。几丁质合成酶编码基因在大型食用真菌金针菇中的数量及表达规律尚不明确。【目的】探究几丁质合成酶基因在金针菇中存在的数量及其在子实体不同发育时期的表达规律,为其在大型真菌子实体生长发育过程中的功能研究提供基础。【方法】基于已有的金针菇菌株L11基因组数据,结合NCBI其他真菌CS序列鉴定金针菇中几丁质合成酶编码基因的数量,并对其进行生物信息学分析。进一步根据金针菇F19转录组数据以及实时荧光定量PCR （RT-qPCR）技术分析金针菇CS基因家族的表达规律。【结果】在金针菇单核体菌株L11的基因组中鉴定到9个几丁质合成酶基因,系统发育分析表明它们在子实体发育过程中的表达模式可分为4类（皮尔森相关系数=0.85）。【结论】金针菇CS基因家族表达模式在金针菇不同生长发育时期均存在差异,可能参与了子实体发育不同时期和组织的形态建成。