来源于麦氏喙枝孢霉的玉米赤霉烯酮水解酶在毕赤酵母中的高效表达及活性分析

【背景】玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)及其衍生物是一群具有雌激素活性的霉菌毒素,广泛存在于被霉菌污染的谷物中,造成食品业和畜牧业的巨大损失。利用专一性高的水解酶进行生物转化可有效去除玉米赤霉烯酮。【目的】构建高效表达玉米赤霉烯酮水解酶的酵母系统,以促进玉米赤霉烯酮水解酶的研究和工业应用。【方法】将来源于麦氏喙枝孢霉(RhinocladiellamackenzieiCBS650.93)的Rmzhd基因转入毕赤酵母中,筛选获得高效表达菌株,通过高效液相色谱分析发酵液中重组酶的性质。【结果】发酵液中Rm ZHD对ZEN的酶活力为16.67 U/m L,对α-ZOL的酶活力为9.85 U/m L。SDS-PAGE检测表达产物的分子量,与理论值30.7k D符合,且发酵上清液蛋白纯度高。Rm ZHD的最适p H值为9.6,最适温度为45°C,并具有较好的耐热性。【结论】研究结果为玉米赤霉烯酮水解酶的异源表达及其潜在的工业应用提供了一定的指导。     

来源于Rhinocladiella mackenziei的玉米赤霉烯酮水解酶的表达纯化与酶学性质

【背景】玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是污染最广泛的霉菌毒素之一,对饲料行业和畜牧业造成了巨大的经济损失。目前研究最为广泛的玉米赤霉烯酮降解酶ZHD101因其热稳定性较差,无法满足工业应用上的要求。【目的】为实现玉米赤霉烯酮降解酶在工业上的应用,寻找酶学性质更突出的ZEN降解酶。【方法】基于对Gen Bank数据库的挖掘,发现一个来源于麦氏喙枝孢霉(Rhinocladiella mackenziei CBS 650.93)的Rmzhd基因,构建p ET-46-Rmzhd质粒。利用大肠杆菌表达体系和亲和层析、离子交换纯化体系对蛋白进行表达和纯化,通过高效液相凝胶色谱分析酶学性质。【结果】发现一个新的ZEN水解酶Rm ZHD,RmZHD在pH 8.6和45°C条件下的活性最高,而且具有较高的耐热性。结构分析表明,较高的盐桥数目和溶剂暴露脯氨酸含量可能是造成其高耐热性的原因。【结论】本研究为促进玉米赤霉烯酮降解酶在工业上的应用打下基础。     

基于结构改造来源于大阪伊德氏杆菌201-F6的PET水解酶

聚对苯二甲酸乙二酯 (Polyethylene terephthalate,PET) 塑料是由对苯二甲酸 (Terephthalic acid,TPA) 和乙二醇 (Ethylene glycol,EG) 通过酯键聚合而成的高分子聚合物,具有性质稳定、不易分解等特点,目前已成为广泛使用的一种聚酯,然而大量产生的PET废弃物同时也造成严重的环境污染。2016年,一种有效降解PET的PET水解酶在大阪伊德氏杆菌201-F6中被鉴定发现 (命名为IsPETase),且多个IsPETase结构已被解析。为了设计获得PET降解效率更高的IsPETase,针对底物结合位点Ⅱc区的天冬氨酸233 (N233) 残基进行了多种突变测试,酶活性检测实验表明,用丙氨酸替代N233可以提高IsPETase的性能,尤其是结合R280A突变后,IsPETase活性增加更为显著。此外,解析了IsPETase N233A突变体的X射线晶体结构。IsPETase N233A突变体与IsPETase野生型整体结构相似,但丙氨酸取代N233后增加了底物识别位点Ⅱ末端的空间结构,推测因此增加了IsPETase的活性。这些结果为进一步基于结构改造PET水解酶提供了新的线索。     

工业应用导向的蛋白质结构与功能研究进展

在蛋白质工程、绿色生物制造以及合成生物学等研究领域中,对重要催化反应的重塑和合成路径的优化搭建,都依赖于对相关蛋白质结构与功能的深入了解。合成生物技术近年来的飞速发展对关键菌种及生物催化过程中的蛋白质的性能提出了更高要求,相关研究的关键是获得大批量、高纯度目的蛋白,并进行快速、准确的构效关系研究。中国科学院天津工业生物技术研究所建所10年来,在工业蛋白质领域进行了多年的积累,成功搭建成了蛋白质结构生物学平台;并在植物天然产物合成相关萜类合成酶、白色污染降解的聚对苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate, PET)塑料降解酶以及生物质转化利用相关酶等方面获得了一些进展,通过对这些蛋白进行结构和功能的研究,为许多研究工作提供了理论依据。蛋白质结构功能研究相关技术的不断发展,将加速合成生物学的学术和工业应用研究,推动我国生物制造领域的科技创新升级。