巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Yu62的质粒及nifHDK基因的定位

对从北京郊区玉米根际分离到的巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilente)Yu 62的质粒进行了分离和检测,发现检测方法不同,得到的质粒数目也不同,用Kado法只发现一个大质粒,以pABm 1表示,其分子量约为1 20 Md;而用改良的Eckhardt方法,则发现有5个大质粒,分别以p&Bm l、pABm 2、pABm 3、pABm 4和pABm 5表示,它们的分子量分别约为120 Md、330 Md、360 Md、480 Md和900 Md,部是巨型质粒,用多种方法检测均未发现小质粒。应用生物素标记的孩酸杂交技术制备了Biotin-nifHDK探针,并对Yu62菌株的质粒及染色体片段进行了Southern印迹杂交和斑点杂交,杂交结果表明nifHDK基因定位于染色体上。     

生物固氮与固氮菌质粒以及大质粒的分离(续)

五、质粒的检测和分离 1、大质粒的处理 采用通常使用于分离肠道细菌中质粒的“清亮裂解物(cleared lysate)法或类似方法从一些根瘤菌(Rhicobium)和兰细菌中获取到一些质粒。然而,它们的功能尚未查明,而且其分子量大都在70Md以下。目前已有可能分离到分子量超过300Md的质粒,而且除根瘤菌外,在固氮菌(Azotobacter)和拜叶林克氏菌(Beijerinckia)亦见到有质     

紫云英根瘤菌共生质粒的鉴定及结瘤功能的诱动转移

紫云英根瘤菌SR72和76531两菌株都有相同的两个质粒,其分子量分别为200 Md和80Md。它们各自的HC Nod~-变株都消失了其中的200 Md质粒,但尚一致地保留着80Md的质粒,紫云英根瘤菌的结瘤功能显然与该200 Md质粒有极为密切的关系。Inc P1组的质粒能以10~(-4)/每个受体细胞的频率转入紫云英根瘤菌,而在紫云英根瘤菌之间的转移频率为10~(-4)—10~(-5)。紫云英根瘤菌的结瘤功能,可以通过P1组的质粒诱动,从野生型Nod~+菌株转移到HC Nod~-受体菌株中,甚至转移到消除了Ti质粒的土壤农杆菌中,能使紫云英结瘤。这些有结瘤能力的Nod~+接合子,其抗药性标记完全与Nod~-受体菌一样,但其质粒电泳图谱,既不同于供体,也不同于受体,缺供体中对应的200 Md大质粒带,比受体的却又多了一40 Md的质粒带。     

杭州市淋病奈瑟菌质粒酶切图谱分析研究

目的 :了解杭州市淋病奈瑟菌质粒携带及质粒谱型分布情况。方法 :采用碱裂解法对门诊 2 0 0 0年 1月～ 2 0 0 1年 10月分离的 2 0 7株淋病奈瑟菌进行了质粒抽提及质粒谱分型研究 ,并对菌株的青霉素耐药现象和耐药性质粒的关系进行探讨。结果 :2 0 7株淋病奈瑟菌中 194株 (93 .7% )检见质粒带 ,其中含一条质粒带的 112株 (5 4.11% ) ,含两条质粒带的 12株 (5 .8% ) ,含三条带的 70株 (3 3 .82 % ) ,尚有 13株(6.2 8% )未检测到质粒。以 E.coli V5 17细菌质粒作分子量标准 ,测得这些分子量分别为 2 .6、4.5、和 2 4.5Md。质粒谱型以 2 .6 4.5 2 4.5 Md(3 3 .82 % )多见。结论 :杭州地区质粒酶切图谱的分析研究有助于淋病的治疗和防治 ,这将对该地区淋病奈瑟菌的分子流行病学调查和淋病监控提供依据     

我国植物青枯菌的内生质粒及其与致病性的关系

检测了来自我国不同地区的龙葵、苎蔗、芝蔗、木蔬黄、油橄榄、桑、烟草、姜、辣椒、茄、蕃茄、甘薯、花生和马铃薯等14种寄主植物的51株野生型青枯菌的内生质粒(1ndigesPlasmid),并对其中20株野生型菌株及其相应的20株“突变型”菌株进行了质粒的比较研究。14株野生型菌株和10株“突变型”菌株含有1或2个质粒,质粒分子量不一,最小的在5Md以下,最大的为120Md。有些野生型菌株(ssl、Snl、E4、Pc2、Tin9、Z2、P3、PoI、P03、Po¨．)和它们的“突变型”菌株均不含质粒;另一些野生型菌株(MS、M6、El、P9．)和它们相应的“突变型”菌株却具有电泳迁移率相同的质粒;这些菌株的致病性与质粒的存在没有关系。但某些野生型菌株(P7、P8。zl、z3、M2、P041．)不含质粒,而它们的“突变型”菌株中却出现了质粒,这些菌株的致病性的丧失与质粒的形成之间可能有关。     

24株产不同抗生素的放线菌质粒的分离和鉴定

分离鉴定了中国微生物菌种保藏管理委员会保藏的24株产不同抗生素的放线菌的质粒。按改进的Kado和Liu快速法提取质粒DNA,经电泳、电镜的检测,在24株检测菌中的7株菌里分离出10个质粒,携带质粒的菌株约占检测菌株的29％。质粒DNA的分子量约为1.8—61.6 kb。通过消除质粒试验和致死接合(Ltz)反应,研究了质粒和抗生素产生的关系。     

湖北地区快生型大豆根瘤菌的质粒及结瘤基因的初步定位

从湖北省潜江县和监利县的4个采集点分离纯化了26株快生型大豆根瘤菌。质粒分离分析结果表明:所测快生型大豆根瘤菌中均有1—3条质粒带,分子量范围在50—300 Md之间。从26株快生型大豆根瘤菌中,选出分属两个血清型的5个菌株,依据根瘤菌nodABC基因在所有根瘤菌种中的结构同源性,对快生型大豆根瘤菌的结瘤基因(nod)进行了初步定位,其结果表明:R173、X143、B21、B2,D13菌株的质粒DNA中没有与nod ABC基因同源的片段存在,而R173、X143、B21、D13菌株的总DNA中含有部分no     

吸水链霉菌应城变种的四个内源质粒及其逐个消除的研究

在改良质粒DNA提取方法的基础上,从三种农用抗生素的同一产生菌——吸水链霉菌应城变种中同时发现四个内源质粒,用双向电泳技术确定了它们均为CCC构型,根据分子量从大到小的顺序将它们分别命名为pHZ1、pHZ2、pHZ3和pHZ4,与已知分子量的CCC质粒分子同步电泳估计它们的分子量依次分别为61kb、4.7kb、4.1kb和3.3kb,基于这四个内源质粒中至少部分个体可能为接合性质粒,可在没有某个质粒的衍生菌株的菌坪上形成“麻点”的假设,我们分离和鉴定了三个质粒逐个消除的10-22衍生菌株,并在光学显微镜下确证了二种类型的麻点。     

巴西固氮螺菌巨大质粒的快速检测法

研究了巴西固氮螺菌(Rzosprrrllum brarrlense)巨大质粒的快速检测方法。由于巨大质粒(>1000Md)在提取过程中易于断裂,故用常规的方法不易得到满意的结果。本实验以较温和的Husch原位裂解法为基础,作了相应的改进,在电泳前采用0.05%SDS预洗及冻融处理,电泳时,先反向电泳”分钟,然后再正向电泳。所得结果重现率高,且方法简便易行。     

氨基酸产生菌E_(65)中质粒的分离与鉴定

在棒杆菌与短杆菌中,用微量质粒分离方法筛选到一株含多种质粒的乙酰短杆菌(Brevibacterium actylicum)E_(65)菌株,该菌株具有产氨基酸特性。进一步大量制备其质粒DNA,并进行氧化绝密度梯度超离心纯化,以及电泳分析,电镜观察,并对质粒进行分离与鉴定,从而确定了每种质粒的分子量大小。     

肠毒素质粒的研究III．耐药性产肠毒素大肠杆菌的质粒电泳分析

对20株人源耐药性产肠毒素大肠杆菌所进行的药敏,接合,质粒电泳及肠毒素检测结果表明：目前我省尚未发现天然形成的Ent-R重组质柱。在抗生素的选择压力下,12株多重耐产毒菌株中有8株其R质粒可与Ent质粒共传递给受体菌,使后者获得与供体一样的抗性与产毒性能,并在电泳中显示与供体一样的两条大质粒带,一条为分子量大于F质粒的R质粒带,另一为大小相当于F质粒的EⅡc质粒带。在一多重耐菌株中发现一t~#-T-,多次电泳仅只显示一条大于Ent质粒的质粒带,但兼具供体的抗性与产毒两种性能。此接合子在含药与不含药肉汤中连续传代以及再传递给另一受体菌后,其质柱带及两种性状均保持稳定。据此,我们推测此质粒带系由转座于插入而形成的EⅡt一“质粒重组体。 多重耐药性质粒与肠毒素质粒的共传递及其重组体的形成都将给腹泻的防治带来更大的困难,应予以重视。     

牡丹根部内生细菌的分离鉴定及脂肽类物质的拮抗活性研究

【目的】从牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)根部组织中分离鉴定内生细菌,测定拮抗菌株脂肽类活性物质的体外抑菌活性。【方法】采用平板对峙法筛选出对牡丹灰霉病菌(Botrytis paeoniae Oadem)、牡丹炭疽病菌(Gloeosporium sp.)、牡丹黑斑病菌(Altenaria sp.)、牡丹黄斑病菌(Phyllosticta commonsii)有拮抗作用的内生细菌。基于形态特征、生理生化特性和16S rRNA基因序列同源性鉴定拮抗菌株。根据脂肽类抗菌物质合成相关基因序列对拮抗菌株进行基因扩增检测,采用酸沉淀法提取拮抗菌株的脂肽类物质,平板对峙法测定脂肽类物质的体外抑菌活性。【结果】从牡丹根部组织中共分离获得62株内生细菌,其中菌株Md31和Md33对4种病原菌均有较明显的抑制作用。Md31和Md33被鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。通过对菌株Md31和Md33进行5个脂肽类合成功能基因bmyB、fenD、ituC、srfAA和srfAB的检测,序列同源性分析,表明两个菌株具有合成脂肽类物质的能力。菌株Md31和Md33的脂肽类粗提物对所测试的牡丹病原真菌均具有不同程度的抑制作用。【结论】获得了2株对牡丹病原菌有良好抑制效果的解淀粉芽孢杆菌Md31和Md33,两个菌株的脂肽类粗提物也具有较强的体外抑菌活性,该研究为牡丹内生细菌的进一步开发应用奠定了基础。     

氧化硫硫杆菌质粒的分离

用碱法对分离到的7株氧化硫硫杆菌进行质粒检测,在6株中分离到了18个质粒,质粒DNA的分子量为1.3×10~4-98×10~6。     

海南快生根瘤菌蛋白,多位点酶及质粒电泳

在本室以前的研究中,海南快生根瘤菌具有分类上的多型性。其一部分归于已知各根瘤菌种,另有一部分菌株构成独立的表观群及相应的ＤＮＡ同源群（亚群Ⅱ和Ⅳ）。本文采用不同的电泳方法,分析了海南快生根瘤菌和已知根瘤菌种的代表共５５个菌株的全细胞蛋白、酯酶、过氧化物酶及质粒组成。结果表明：同一亚群的菌株间有相似的蛋白图谱,种群之间有较明显的差异,根瘤菌中普遍存在酯酶,酶带的数量和迁移率具有菌株专一性,更适合于苗株的鉴别。过氧化物酶只在部分菌株中观察到,亚群Ⅱ与亚群Ⅳ的菌株均显示一条酶带,但二者之间的相对迁移率有明显差别。质粒电泳中,大多数海南快生菌中存在着大质粒,分子量范围是２０－４０００Ｋｂ,同一亚群中的不同菌株间具有一定相似性,这些结果为海南快生型根瘤菌的分类提供了一些辅助证据。     

转座子Tn233(CH)分子量的测定

转座子Tn233(CH)带有str sul抗性基因,最早是在痢疾杆菌的抗药质粒DR233(Tc~r Cm~r Sm~r Su~r)中发现的。现在通过菌株间的配对,将插入了Tn233(CH)转座子的质粒R144drd3::Tn233(CH)转移到E·coli C600/pBR322(Ap~r、Tc~r)细胞中,组成两种质粒共存的菌株。从此菌株中提取出质粒DNA,用转化方法使它转移到E.coli C600菌株,再从所得到的转化子中用复印方法筛选出Tn233(CH)转座到pBR322质粒的转化子E.coli C600/pBR322::Tn233(CH),然后提出此质粒DNA,经限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、PstⅠ、HindⅢ与PvuⅡ等酶切后,在琼脂糖凝胶平板与聚丙烯酰胺凝胶柱上进行电泳分析,分别以BamHⅠ与EcoRⅠ双重酶解的λDNA、HindⅢ酶解的T5DNA、HaeⅢ酶解的M13 DNA与HaeⅢ酶解的pBR322 DNA作为泳动的标记,计算出质粒酶解片段的分子量,用此方法算出各片段分子量的总和为15.93×10~6道尔顿,此即为所求的pBR322::Tn233(CH)分子量,将此值减去pBR322的分子置2.87×10~6道尔顿,得到Tn233(CH)的分子量为13.06×10~6道尔顿。电泳结果还表明在Tn233(CH)DNA分子上,BamHⅠ、EcoRⅠ、PstⅠ、HindⅢ与PvuⅡ分别有5、9、1、6、2个切点数。     

苏云金芽胞杆菌4.0718菌株中杀虫晶体蛋白基因的定位及鉴定

[目的]对苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)4.0718菌株中的杀虫晶体蛋白基因(insecticidal crystal protein gene,简称cry基因)进行定位和鉴定,系统分析高毒力Bt4.0718菌株的杀虫基因背景.[方法]采用脉冲电泳(PFGE)分离Bt 4.0718菌株的基因组DNA,确定该菌株的PFGE图谱和质粒图谱;采用Southern杂交分析该菌株中cry基因的定位,并使用PCR及PCR产物限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)方法鉴定该菌株染色体和质粒上含有的cry基因类型.[结果]确定了Bt 4.0718菌株的PFGE图谱和质粒图潜,鉴定到Bt4.0718菌株的染色体和质粒上均定位有cry基因,且分别包含crylAa、crylAc、cry2Aa和cry2Ab 4种基因成分.但染色体上含有的cry基因可能不如质粒上含有的cry基因具有完整的开放阅渎框.[结论]首次在Bt 4.0718菌株的染色体上发现有丰富的cry基因,且与质粒上含有的cry基因类型一致.     

尼泊尔马桑根瘤内生菌纯培养物的质粒检测

采用胶内裂解法快速检测了21株马桑根瘤内生菌纯培养物和4株弗兰克氏菌参考菌株的质粒,其中有5株马桑分离菌株和1株参考菌株含有质粒。除马桑菌株和参考菌株各有1株携带2个质粒外,其它菌株均只含有1个质粒。这些质粒的分子量约为13～20kb。根据所含质粒的大小和数目,将21株马桑分离菌株划分成4个质粒类群。实验还对菌丝体生长,细胞酶解和裂解等条件对质粒检测效果的影响进行了探讨。     

水稻植物内生链霉菌中线型和环型质粒的检测

以广东番禺和五山地区水稻植株中分离到的内生链霉菌为对象,调查可能存在的内源质粒.利用脉冲电泳技术从8个菌株中检测到大小在60 kb～410 kb的线型质粒,其中4个菌株的线型质粒可能有保守的端粒复制基因.该结果与土壤链霉菌中检测到线型质粒和具有保守端粒复制基因的比例相似,表明水稻植物组织内部的独特环境不会造成链霉菌线型质粒的多样性分布产生大的变化.此外,从13个菌株中检测到6 kb～60 kb的环型质粒.     

一株可提供分子量参照物的含多质粒不动杆菌

作者研究了一株有10种质粒的不动杆菌(Acinetobacter),其质粒的分子量分别为1．6、2．3、2．6、3．I、3．7、4．2、4．5、6．0、7．2和14．0Md．这套质粒在宿主中相当稳定,井能用简单方法提取,可以用作琼脂糖凝胶电泳中cccDNA的分子量参照物,其性能优于目前常用的E．Coli V517的质粒。     

K88抗原基因的克隆与表达I．K88抗原工程菌的研制

由产肠毒素大肠杆菌引起的仔猪黄痢病是在世界各地广泛流行的一种仔猪急性腹泻病。已经表明K88伞毛抗原在这类致病菌定居在仔猪小肠上起着重要的作用。质粒Ptk82是从国内流行的仔猪黄痢病致病菌——肠杆菌青3菌株中分离出来的。它是一个分子量约为50×10‘道尔顿的非接台型质粒,并含有K88ac抗原基因的决定子。在电子显微镜下可以观察到带有Ptk82的大肠杆菌C₆₀₀的细胞表面存在有K88伞毛。此质粒DNA经限制性内切酶HindI酶解后,使DNA片段连接到同样经内切酶酶解过的的Pbr322 DNA上,得到了一株能产生K88抗原的转化子,经鉴定后,此重组质粒定名为Ptk63。Ptk63dna经Ec0R I都分酶解,然后重新连接起来,得到分子量较小但仍台K88基因的重组质粒Ptk90。免疫学分析的结果表明,带有重组质粒Ptk90的大肠杆菌C₆₀₀所产生的伞毛抗原的性质,与带有Ptk82质粒的大肠杆菌C₆₀₀菌株或大肠杆菌青3菌株所产生的伞毛是相同的,大肠杆菌C₆₀₀／pTK82和大肠杆菌C600／pTK90菌株都是不带肠毒素基因的菌株,初步试验表明用它们制成的菌苗可以有效地预防仔猪黄痢病的发生。