烟草毛状根诱导及其茄尼醇含量初探

茄尼醇是合成泛醌类药物的重要中间体。以发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)W.T15834感染烟草叶片诱导产生毛状根, 探讨其茄尼醇含量变化。结果显示, 获得的毛状根能在无外源生长调节剂的MS固体和液体培养基上自主生长, 但在液体培养基中培养的毛状根生长更迅速, 也不会形成愈伤组织。甘露碱检测及PCR结果证实, 发根农杆菌Ri质粒的rolB基因已在烟草(Nicotiana tabacum)毛状根基因组中整合并得到表达。用改进的HPLC法测定烟草毛状根中的茄尼醇含量, 其结果为对照根(种子萌发产生的幼苗根)的1.12倍, 但仍比废弃烟叶中茄尼醇含量低43.2％。     

三裂叶野葛毛状根的培养及其葛根素的产生

发根农杆菌ATCC15834感染三裂叶野葛叶片外植体20天后,从其切口叶脉处产生的愈伤组织上产生毛状根。感染35天后约85%的叶片外植体产生毛状根。毛状根能在无外源生长调节剂的MS固体和液体培养基上自主生长,但在液体培养基中培养的毛状根生长更迅速,也不会形成愈伤组织。毛状根线粒体膜电势的荧光染色结果表明,液体培养的毛状根细胞线粒体的膜电势比固体培养的毛状根高11.8倍。PCR结果证实,发根农杆菌Ri质粒的rolB和rolC基因已在三裂叶野葛毛状根基因组中整合并得到表达。HPLC测定结果表明,三裂叶野葛毛状根中的葛根素含量约为对照根(种子萌发产生的幼苗根)的2.5倍,达1.190 mg/g.dry.wt;并比多年生葛根生药片的葛根素含量高6.7%。     

褐脉少花龙葵毛状根的诱导、培养及其澳洲茄胺的产生

利用发根农杆茵的遗传转化和液体培养技术,研究了褐脉少花龙葵(solanum nigrum L.Var.Dauciforum)毛状根的诱导和离体培养及其澳洲茄胺的产生以及液体培养过程中培养基中N源和钙的消耗变化.结果表明.发根农杆菌ATCC15834感染褐脉少花龙葵叶片外植体5 d后产生毛状根.感染25d后,约90%的叶片外植体产生毛状根.毛状根能在无外源生长调节剂的MS固体和体培养基上自主生长.PCR扩增结果显示发根农杆菌Ri质粒的rilB和rolC基因已在少花龙葵毛状根基因组中整合并得到表达.所产生的毛状根能产生药用次生物质澳洲茄胺,其含量约为非转化植株根的1.3倍,达到582.05μg/g干重.少花龙葵毛状根液体培养0-5 d内处于生长迟滞期、5-15 d为快速生长期、15d后进入生长平台期.培养基的硝态氮和铵态氮在毛状根液体培养过程中被逐渐吸收和消耗,至培养15 d时铵态氮被消耗殆尽.而硝态氮仍剩余44.7%;培养基中钙的浓度在培养过程中虽逐渐降低,但在培养25d时仍未被完全消耗,其浓度约为起始浓度的43.5%.该结果为今后设计合适的培养基来规模培养褐脉少花龙葵毛状根生产药用次生物质澳洲茄胺提供了可能性.     

商陆毛状根的诱导、培养及其扼甙的产生

发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）R1601感染商陆叶片外植体1周后,在其切口处产生毛状根,20d后产生毛状根的外植体比例达70%,毛状根可直接从叶片外植体叶脉处或从叶脉处产生的愈伤组织上产生,毛状根能在无激素的MS培养基上自主生长,其呼吸速率比对照根提高85.6%,冠瘿碱检测和PCR扩增结果表明,发根农杆菌RiT-DNA的冠瘿碱合成酶基因及其Ri质粒的rol基因均已在商陆毛状根基因组中得到表达。毛状根中总皂甙含量约为自然根的1.54倍,但其多糖含量则仅为非转化根的70%。     

三裂叶野葛毛状根的培养及其葛根素的产生

发根农杆菌ATCC15834感染三裂叶野葛叶片外植体20天后,从其切口叶脉处产生的愈伤组织上产生毛状根。感染35天后约85％的叶片外植体产生毛状根。毛状根能在无外源生长调节剂的MS固体和液体培养基上自主生长,但在液体培养基中培养的毛状根生长更迅速,也不会形成愈伤组织。毛状根线粒体膜电势的荧光染色结果表明,液体培养的毛状根细胞线粒体的膜电势比固体培养的毛状根高11．8倍。PCR结果证实,发根农杆菌Ri质粒的rolB和rolC基因已在三裂叶野葛毛状根基因组中整合并得到表达。HPLC测定结果表明,三裂叶野葛毛状根中的葛根素含量约为对照根(种子萌发产生的幼苗根)的2．5倍,达1．190mg/g．dry．wt;并比多年生葛根生药片的葛根素含量高6．7％。     

地不容毛状根的培养

以Ｒ１０００,１５８３４,１８５５,８１９６等４种发根农杆菌菌株,在不同条件下,感染地不溶,结果在光照条件下,Ｒ１０００诱导植物幼嫩组织产生毛状根。毛状根在ＭＳ液体培养基中生长４２ｄ后,趋于稳定;异喹吉林生物碱含量在第２８ｄ时达到峰值１１０４μｇ／ｇＦＷ。６种培养基中,毛状根生长及异喹啉生物碱含量的差异很大,在在Ｂ５２基中毛状根生长最快,Ｎｉｔｓｃｈ培养基中毛状根异喹啉生物碱含量最讥。Ｂ５培养基中     

三裂叶野葛毛状根的诱导及其固体培养和液体培养

发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）ATCC15834感染三裂叶野葛(Pueraria phaseoloides)叶片外植体20 d后产生毛状根,毛状根可直接从叶片外植体叶脉处或从叶脉处产生的愈伤组织上产生。感染35d后,约85%的叶片外植体产生毛状根。毛状根能在无外源生长调节剂的 MS固体和液体培养基上自主生长。PCR扩增结果表明,发根农杆菌Ri质粒的rolB和rolC基因已在三裂叶野葛毛状根基因组中整合并得到表达。与固体培养的毛状根相比,在液体培养基中培养的毛状根不仅生长迅速,也不会形成愈伤组织。在无外源生长调节剂的液体MS培养基中培养15d的三裂叶野葛毛状根的鲜重、干重、可溶性总糖含量及细胞内活性氧(ROS)含量分别为固体培养毛状根的1.59倍、1.18倍、5.25倍和1.16倍。     

商陆毛状根的诱导、培养及其皂甙的产生

发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）R1601 感染商陆叶片外植体1周后,在其切口处产生毛状根,20d后产生毛状根的外植体比例达70%;毛状根可直接从叶片外植体叶脉处或从叶脉处产生的愈伤组织上产生。毛状根能在无激素的 MS培养基上自主生长,其呼吸速率比对照根提高85.6%。冠瘿碱检测和PCR扩增结果表明,发根农杆菌RiTDNA的冠瘿碱合成酶基因及其Ri质粒的rol 基因均已在商陆毛状根基因组中得到表达。毛状根中总皂甙含量约为自然根的154倍,但其多糖含量则仅为非转化根的70%。     

烟草毛状根多倍体诱导及其植株再生

为了提高烟草的烟碱含量,采用发根农杆菌遗传转化和人工染色体加倍技术,进行了烟草毛状根及其多倍体诱导、植株再生及其烟碱含量测定。结果表明,发根农杆菌ATCC15834感染烟草叶片外植体8 d后产生白色毛状根,15 d后所有叶片外植体产生毛状根。毛状根能在无外源激素的MS固体和液体培养基上自主生长。PCR扩增结果显示发根农杆菌Ri质粒的rol B和rol C基因以及冠瘿碱合成酶基因已在烟草毛状根基因组中整合并得到表达。烟草毛状根多倍体诱导的最适条件为0.1%的秋水仙素溶液处理36 h,其多倍体诱导率为64.71%。经秋水仙素加倍的烟草毛状根多倍体植株再生的最适宜培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA0.2 mg/L。与对照(二倍体非转化植株)相比,烟草二倍体毛状根再生植株的顶端优势减弱,腋芽增多,叶片变窄;而烟草毛状根多倍体再生植株茎更粗,节间变短,叶色更深,叶片的宽度和厚度均较对照明显增大。根尖细胞染色体压片观察证实,所获得的烟草毛状根多倍体再生植株为四倍体,其根尖细胞染色体数约为4n=96。盆栽实验表明,烟草二倍体毛状根植株和多倍体毛状根再生植株比对照植株延迟约21 d开花。GC-MS检测表明,烟草毛状根多倍体再生植株的烟碱含量比对照及二倍体毛状根再生植株显著提高,分别约为对照及二倍体毛状根再生植株的6.90倍和4.57倍。     

外植体龄和蔗糖浓度对黄瓜子叶产生毛状根的影响

研究了外植体龄和蔗糖浓度对发根农杆菌 R160 1介导黄瓜子叶产生毛状根的影响。结果表明 :以 10 d龄子叶外植体产生毛状根的能力最强 ,外植体的毛状根诱导率为 88.89% ;2 0 d龄子叶外植体的毛状根诱导率比 10 d龄子叶外植体降低 52 .86% ;30 d龄子叶外植体感染发根农杆菌R160 1后不产生毛状根。感染发根农杆菌 R160 1的黄瓜子叶外植体在不加或加 1%蔗糖的 MS培养基上的毛状根诱导率极低 ,子叶外植体逐渐变黄 ,腐烂 ;而培养基中添加 2 % ,3%或 4 %的蔗糖可显著提高子叶外植体的毛状根诱导率。黄瓜毛状根能在无外源植物激素的 MS液体培养基中自主生长。冠瘿碱的高压纸电泳检测表明毛状根已被 Ri T- DNA转化     

蔗糖对发根农杆菌C58C1诱导烟草毛状根生长的影响北大核心CSCD

毛状根良好的生长状况是建立毛状根-AM真菌双重培养体系的关键,为优化毛状根培养基成分,确定适宜毛状根生长的蔗糖浓度,改善烟草毛状根的生长状况,该研究以发根农杆菌菌株C58C1诱导2个烟草品种NC82和Va116叶片产生毛状根,经PCR检测证实后,用含有不同蔗糖浓度的1/2MS培养基分别进行固体和液体优化培养,通过测定毛状根的分枝数、鲜重(FW)与干重(DW),研究蔗糖对2个品种烟草毛状根生长的影响。结果表明:(1)C58C1均能诱导两种烟草叶片产生毛状根,但诱导率不同,NC82(87.3%)的诱导率更高,是Va116(38.6%)的2.26倍。(2)培养基蔗糖浓度显著影响毛状根生长,因烟草品种和起始分枝数而异。(3)固体培养基优化培养NC82和Va116的毛状根,分枝数增长的抑制蔗糖浓度分别为25 g·L^(-1)和15 g·L^(-1);液体培养基优化培养分别在25 g·L^(-1)和15 g·L^(-1)时F(D)W达到最大,分别为0.541 g(0.055 g)、0.474 g(0.050 g)。(4)综合分枝数、F(D)W、毛状根生长势考虑,C58C1诱导NC82毛状根最适培养基蔗糖浓度为25 g·L^(-1),Va116毛状根为15 g·L^(-1)。该文优化了烟草毛状根培养基组成的适宜蔗糖浓度及培养方法,为后续毛状根大量扩繁奠定基础,建立了毛状根-AM真菌双重培养体系,解决了关键的寄主生长不良的问题。     

新疆紫草毛状根总糖及多糖含量分析

采用超声提取法,对新疆紫草固体培养毛状根、液体培养毛状根以及2～3年野生根中的总糖和多糖进行了提取测定.结果表明:毛状根中水溶性总糖含量为25.573%,是野生根总糖含量的3.4倍;固体培养的毛状根多糖含量最高,达4.289%,是液体培养毛状根的3.37倍,是野生根的4倍.稳定性试验和重复性试验表明,该研究结果可靠性强,重复性好且稳定.研究发现,新疆紫草毛状根中水溶性总糖和多糖的含量高于野生根.     

人参发根的诱导及其适宜培养条件的研究

利用发根农杆菌A₄菌株在人参根外植体上直接诱导产生发根。在1/2MS固体培养基上建立起发根离体培养系,经连续多代的培养,发根仍保持旺盛生长状态。PCR扩增结果表明,发根农杆菌R_I质粒的rolC基因已在人参发根基因组中整合并得到表达。液体培养基中发根生长速度约为固体培养的2倍。经对发根中人参皂苷含量及比生长速率的测定,筛选出高产发根系R9923。利用HPLC法测定了R9923发根系中单体皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2和Rd的含量,人参总皂苷含量达15.2mg/g。确定1/2MS培养液（30g/L蔗糖）、摇床转速110r/min、每２周更换一次培养液、继代培养时间4周,为人参发根生长适宜条件。探讨了培养容积、发根初始接种量以及分级放大培养工艺对发根大规模生产过程中生物产量和皂苷含量的影响。     

美洲商陆毛状根诱导及其离体培养的影响因素

为了探讨利用美洲商陆毛状根生产其药用成分的可能性,研究了美洲商陆毛状根诱导及其离体培养的影响因素。结果表明,美洲商陆叶片外植体被发根农杆菌ATCC 15834感染约18 d后,从其叶片外植体形态学下端叶脉切口处产生毛状根,其中以预培养1 d,农杆菌感染20 min,共培养4 d时的毛状根诱导率最高,达到70%。PCR扩增和硅胶薄层层析结果显示,发根农杆菌Ri质粒的rol C基因以及冠瘿碱合成酶基因已在美洲商陆毛状根基因组中整合和表达。所获得的美洲商陆毛状根系都能在无外源激素的MS固体培养基上快速自主生长;其中以毛状根根系2的生长速度最快、分生侧根能力最强和根表面的根毛密度最高;毛状根根表面呈紫红色或呈白色。在供试的MS、1/2MS、B5和6,7-V液体培养基中,以无外源激素的MS培养基最适合美洲商陆毛状根根系生长。与无外源激素的MS培养基相比,6,7-V培养基更有利于毛状根中商陆皂苷甲的合成与积累。本文所建立的美洲商陆毛状根诱导及其离体培养的适宜条件为今后利用其毛状根株系的规模培养来生产其药用有效成分商陆皂苷甲奠定了实验和技术基础。     

滇黄芩毛状根的诱导及其黄芩苷含量测定

本文利用发根农杆菌A grobacterizum rhizogenes1.2556感染滇黄芩再生苗的茎段和叶片,建立了毛状根培养及其植株再生体系。毛状根可直接从受伤的茎、叶外植体表面产生,在无外源激素的MS固体和液体培养基上自主生长,表现出典型的发根特征。毛状根茎段的诱导率较叶片高,最高可达到14.44%;经rolB基因PCR分析和甘露碱纸电泳检测,证明Ri质粒T-DNA已整合到滇黄芩基因组中并表达;毛状根在附加6-BA2mg/L和NAA0.2mg/L的MS固体培养基上直接诱导不定芽,并在MS培养基上生根,形成再生植株。获得的毛状根系经MS液体培养基培养30d后通过HPLC都能检测到黄芩苷,其中1个转化系黄芩苷含量为2.59%,是药材黄芩的0.20倍,而从3年单位时间黄芩苷生成量计算,毛状根是药材黄芩的7.18倍。本研究建立的毛状根培养体系,将对滇黄芩转基因技术的完善和利用毛状根生产黄芩苷的生物转化提供了实验基础。