绿色荧光蛋白及其在细胞生物学研究中的应用

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)作为一种新型的标记蛋白,已被广泛的应用.它发出的荧光稳定,检测简单,结果真实可靠.GFP可对活细胞的生理过程进行监控,并且可以用于活细胞中蛋白质分子的定位及动力学研究.其特有的生物化学性质使其在细胞生物学和分子生物学领域有着广泛的应用前景.     

绿色荧光蛋白及其应用

绿色荧光蛋白是在水母中发现的新型报告分子,能在多种生物体内表达并发出荧光。对GFP中一些特定氨基酸进行突变可以产生多种类型的突变体,有利于研究蛋白之间或细胞器之间的相互作用。目前,GFP已经用于基因表达的报告、细胞动态的研究、活细胞内蛋白的定位及westernbloting检测中。GFP美好的应用前景也促进了有关GFP的研究,特别是寻找新的突变体并将之运用到细胞生物学和分子生物学的各个领域。     

绿色荧光蛋白(GFP)在真菌研究中的应用

绿色荧光蛋白(gteen fluorescent protein,GFP)来源于海洋生物水母(Aequorea victoria),由于其具有荧光性质稳定、直观、操作方便和不需添加外源底物就可以在活细胞中直接检测等无可比拟的优点,以GFP为报告基因已经被广泛地应用于真菌的分子生物学研究中。GFP基因通过随机插入真菌基因组的方法,已经被成功地用来研究真菌的生态、生防菌对病原菌的侵染模式及病原菌与其寄主的关系等;GFP基因通过与目标基因融合的方法,则被广泛地用于真菌的基因转录规则、蛋白质及细胞器定位、细胞亚结构和蛋白质功能等研究。     

动态检测活细胞内泛素-蛋白酶体系统活性方法的建立

目的建立一种动态检测活细胞内泛素-蛋白酶体系统活性的方法。方法将表达绿色荧光蛋白（GFP）或红色荧光蛋白（DsRed2）的质粒分别改建为表达带有内泛素-蛋白酶体系统降解信号CL1的GFP或DsRed2的pGFP^u或pDsRed2质粒,然后转染HEK293细胞,通过G418筛选得到稳定表达GFP^u或DsRed2^u的细胞系。在蛋白酶体抑制N—Acetyl—Leu-Leu—Norleu—al（ALLN）处理GFP^u或DsRed2^u细胞后,应用免疫印记技术检测细胞内GFP或DsRed,含量的变化,应用荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜技术观察GFP或DsRed,荧光强度的变化。结果ALLN处理能使GFP“和DsRed2^u细胞内GFP和DsRed。含量明显增加,荧光强度显著增强,并呈现明显的剂量／时间-效应关系。结论本文成功地建立了检测内泛素-蛋白酶体系统活性的方法,该方法能有效地对活细胞的内泛素-蛋白酶体系统活性进行实时动态检测。     

超电荷绿色荧光蛋白(+36GFP):一种新型生物大分子穿膜载体

超电荷绿色荧光蛋白(sc GFP)是一种表面带很高净电荷的新型功能蛋白质。ScGFP具有很强的水溶性和抗蛋白质聚集的能力,在生物技术、医药和材料科学方面有着广泛的应用前景。带正电荷的sc GFP能够穿透细胞膜,具有运载核酸和蛋白质等生物大分子进入哺乳动物细胞内的能力。与传统的转运载体相比,sc GFP有细胞毒性低、转运效率高和具广泛的细胞普适性等优点。带正电荷的sc GFP与带负电荷的核酸分子之间通过静电相互作用形成自组装的多离子复合物,这与生物体中的组蛋白和带负电荷的DNA之间自组装成染色质的行为非常相似。本文以带有36个正电荷的超电荷绿色荧光蛋白(+36GFP)为例,对超电荷蛋白的性质,细胞穿透能力以及其作为生物大分子穿透载体的应用等方面做一综述。     

绿色荧光蛋白及其在植物分子生物学研究中的应用

绿色荧光蛋白(GFP)是海洋生物水母(Aequoria victoria)体内的一种发光蛋白,近十年来成为在生物化学和细胞生物学研究和应用中用得最广泛的蛋白质之一。文章就绿色荧光蛋白的特性及其在植物分子生物学中应用的研究进展作了概述。     

绿色荧光蛋白在蛋白质研究中的应用

绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）自发现以来,由于具有自发荧光等特性,在分子生物学和细胞生物学领域得到广泛应用。GFP作为一种报道分子,在研究蛋白质相互作用和构象变化、检测蛋白质表达、蛋白质和细胞荧光示踪中,起到了重要的作用。该文通过对绿色荧光蛋白特性的分析．介绍其作为荧光标记在蛋白质研究中的应用,并展望进一步的研究前景。     

绿色荧光蛋白在草鱼肾细胞中的表达

应用阳离子脂质体介导法,将含绿色荧光蛋白（GFP）基因的质粒pEGFP-N1转染到培养成单层的草鱼肾细胞（CIK）中,通过荧光倒置显微镜和特异性RT-PCR方法检测GFP的表达.在荧光倒置显微镜下可见CIK细胞的胞质和胞核均呈现绿色荧光,且细胞核的绿色荧光强度强于细胞质.转染细胞中的转录产物经RT-PCR扩增后,凝胶电泳鉴定出与GFP基因片段分子量大小一致的条带,经测序证明其为GFP基因序列.结果表明,GFP基因可以在草鱼CIK细胞内高效率成功表达,为构建以GFP为报告基因的真核重组质粒及研究草鱼出血病DNA疫苗奠定了重要的基础.     

绿色荧光蛋白与Wee1 Hu融合基因的构建及其真核表达

 构建Wee1Hu与增强型绿色荧光蛋白 (GFP)融合基因表达载体 ,并对其在真核细胞的表达及生物学效应进行研究 .应用基因工程技术构建重组载体 ,脂质体转染胰岛 β细胞株 ,流式细胞仪和免疫沉淀 Western印迹检测融合蛋白的表达 ,共聚焦显微镜分析融合蛋白在活细胞内的分布 ,3 D结构模建分析其结构特点 ,并用MTT法检测其生物学活性 .结果显示融合基因在瞬时或稳定转染的真核细胞中均获表达 ,融合蛋白主要分布在胞核区 ,融合蛋白中Wee1Hu的空间构象与天然Wee1Hu完全相同 ,表达融合蛋白的胰岛β细胞可避免其被细胞毒T淋巴细胞 (CTL)杀伤 .结果表明GFP Wee1Hu融合蛋白中 ,可发绿色荧光的分子标签GFP未能影响Wee1Hu的结构及其生物学活性 ;Wee1Hu可通过调控细胞周期而阻断CTL介导的细胞凋亡     

分子信标用于活细胞内源性mRNA 检测的实验研究

目的:观察分子信标(molecular beacons,MB)在活细胞内及在体水平对内源性m RNA检测的可行性。方法:合成增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,e GFP)的MB,模拟体内条件,分别从MB的稳定性、与目标基因结合的特异性和敏感性进行检测,并通过在活细胞和斑马鱼胚胎内的应用来观察其对内外源性m RNA的检测的可行性。结果:MB在37℃条件下在体外48小时内经琼脂糖凝胶电泳鉴定未见降解,熔解曲线结果显示荧光强度差异无统计学意义(P0.05);并且只有在靶序列存在的条件下MB的信号强度显著增强,MB的信号强度与靶基因浓度呈正相关并能基本稳定存在;经e GFP和靶向e GFP的MB共转染的293T细胞能看到荧光表达,靶向e GFP的MB可特异性结合细胞内e GFP的m RNA;在单细胞期斑马鱼胚胎内共注射MB以及目标单链后能观察到荧光表达。结论:结果表明分子信标可用于活细胞内内源性m RNA的检测。     

甲醇固定导致绿色荧光蛋白的荧光消失

发现用甲醇固定转染了绿色荧光蛋白(GFP)基因的细胞会导致GFP的荧光消失,而当用聚甲醛固定时,GFP的荧光就没有失去。因此建议避免用甲醇对有GFP表达的细胞进行免疫组化前的固定。     

单个活细胞中生物分子动态行为的FRET实时检测

分别采用两种不同绿色荧光蛋白(green fluorescent prote in,GFP)突变体作为荧光共振能量转移(fluo-rescence resonance energy transfer,FRET)对的供体和受体,并利用分子生物学技术将供体和受体分子分别与特定的生物分子融合,这种技术已经成为在单个活细胞中实时长时间检测蛋白质间的动态相互作用的主要技术。主要介绍了基于GFPs的FRET技术在单个活细胞中实时长时间研究生物分子动态行为的应用。     

甲醛固定对GFP发光特性的影响

绿色荧光蛋白(GFP)能够作为报告分子对活体细胞中特定基因的时空表达进行实时追踪,因此广泛应用于生物学研究领域。在用GFP对细胞活动进行追踪的实验中,常有无法在取样后及时对样品进行荧光观察的情况,此时需要先将样品进行固定以便对其进行观测。然而,不恰当的细胞固定方法会导致胞内GFP荧光信号强度减弱、位置改变等后果。甲醛是最常用的细胞固定剂,也常被用于固定表达GFP蛋白的细胞样品。但对甲醛固定GFP样品的报道多是针对于真核细胞,且固定效果也存在较大差异。文章系统地探索了甲醛浓度、固定时间、固定缓冲液种类对两种细菌(E.coli及鱼腥蓝细菌Anabaena PCC7120)胞内GFP信号的影响。结果显示,较低浓度(≤1%)的甲醛处理2h后,细胞的荧光强度在1d后仍可保持80%以上,胞内荧光点无弥散现象发生。具有相近pH的几种常见缓冲液对荧光强度的影响无显著差异。随着甲醛浓度的增加、固定时间的延长、溶液pH的增加(中性至偏碱性),细胞中的荧光强度会逐渐降低。     

Kozak序列+4G提高绿色荧光蛋白在HEK293细胞中的表达

构建含不同Kozak序列的绿色荧光蛋白(GFP)基因真核表达载体, 并检测它们在HEK293细胞中的表达差异。 通过设计突变的PCR引物改变目的基因GFP的Kozak序列, +4 位碱基分别为A和G, 且不改变氨基酸编码, 将PCR扩增的GFP片段与载体pcDNA3.1进行酶切、连接、转化、鉴定。成功构建的pHGFP-A, pHGFP-G质粒采用脂质体法转染HEK293细胞, 荧光显微镜下观察绿色荧光表达, 流式细胞术检测目的蛋白GFP的荧光表达阳性率, Western blot检测目的蛋白GFP的表达。构建的两质粒均能有效转染 HEK293细胞, 其中流式细胞术分析显示: pHGFP-A组GFP阳性率约为15%, pHGFP-G组GFP阳性率约为45%; Western blot 显示pHGFP-G的GFP表达量约为pHGFP-A的GFP表达量3.87倍。结果表明, Kozak序列+4G(?3位为嘌呤碱基时)在蛋白表达中发挥重要作用, 可以使绿色荧光蛋白GFP在HEK293细胞中的表达量提高约4倍。     

Kozak序列+4G提高绿色荧光蛋白在HEK293细胞中的表达

构建含不同Kozak序列的绿色荧光蛋白(GFP)基因真核表达载体, 并检测它们在HEK293细胞中的表达差异。 通过设计突变的PCR引物改变目的基因GFP的Kozak序列, +4 位碱基分别为A和G, 且不改变氨基酸编码, 将PCR扩增的GFP片段与载体pcDNA3.1进行酶切、连接、转化、鉴定。成功构建的pHGFP-A, pHGFP-G质粒采用脂质体法转染HEK293细胞, 荧光显微镜下观察绿色荧光表达, 流式细胞术检测目的蛋白GFP的荧光表达阳性率, Western blot检测目的蛋白GFP的表达。构建的两质粒均能有效转染 HEK293细胞, 其中流式细胞术分析显示: pHGFP-A组GFP阳性率约为15%, pHGFP-G组GFP阳性率约为45%; Western blot 显示pHGFP-G的GFP表达量约为pHGFP-A的GFP表达量3.87倍。结果表明, Kozak序列+4G(?3位为嘌呤碱基时)在蛋白表达中发挥重要作用, 可以使绿色荧光蛋白GFP在HEK293细胞中的表达量提高约4倍。     

一种通过GFP结合蛋白强化三分子荧光互补方法的建立

[目的]将改造后的GFP(super-fold GFP,简写为sf GFP)作为三分子荧光互补技术的基础,通过应用多种GFP结合蛋白(GFP binding protein,GBP),筛选并验证可强化荧光互补作用的GFP结合蛋白。[方法]将sf GFP拆分为三部分(GFP1-9,GFP10和GFP11),建立GFP三分子荧光互补技术体系,利用多种GFP结合蛋白对GFP三分子荧光互补技术进行试验,通过观察荧光变化筛选可强化荧光互补作用的GFP结合蛋白。[结果]发现DARPin-GFP、GFP-enhancer和Nbsf GFP这三种GFP结合蛋白能够与GFP共定位并对GFP三分子重组装有增强效果,其中GFP-enhancer与Nbsf GFP增强效果约为原荧光强度4倍,DARPin-GFP约为2倍。[结论]GFP结合蛋白可作为一种新手段,使以GFP三分子荧光互补技术为基础的蛋白质-蛋白质相互作用研究的检测效率和灵敏度得到提高。     

绿色荧光蛋白的首次应用者——查尔菲

绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）是20世纪60年代发现的一种在紫外线下可发出绿色荧光的蛋白,进入20世纪90年代后开始被广泛应用于生命科学和环境检测等研究领域。1994年,查尔菲首次成功将GFP转入细胞内并观察到绿色荧光,从而开创了GFP应用的先河,为随后GFP的广泛应用和深入研究奠定了基础。查尔菲是一位线虫触觉机理研究领域的专家,但在GFP应用方面的贡献却使他于2008年分享了诺贝尔化学奖。     

绿色荧光蛋白作为分子标记物在微生物学中的应用

荧光染料在微生物学中的应用受到广泛的关注。近年来 ,来源于发光性生物的荧光蛋白进一步丰富了微生物学的研究手段。其中绿色荧光蛋白 (Greenfluorescentprotein ,GFP ,来源于水母 )具有独特的应用价值。在活体研究中 ,GFP相对于其它报告蛋白 (如 β 半乳糖苷酶 )在原位、实时的微生物生理生化研究中有很多优越性。对GFP作为分子标记物在微生物学中的应用进行回顾 ,对GFP在微生物与宿主相互作用、生物膜(biofilm)、生物降解、细菌与原生动物相互作用、基因转导、基因表达、蛋白质定位以及生物传感器等领域的应用进行讨论 ,并扼要介绍了一些应用于荧光观察和定量分析的方法。     

绿色荧光蛋白基因在昆虫细胞中的克隆与表达

将绿色荧光蛋白(GFP)基因亚克隆到转移载体pVLneo的多角体蛋白基因(ocu)启动子下游,与杆状病素AcNPV DNA共转染昆虫细胞,通过同源重组和G418筛选,构建了整合有GFP基因的重组病毒。在昆虫细胞中表达的GFP,MW为30kDa,在荧光显微镜下呈现美丽的绿色,荧光光谱表明其激发波长395nm,发射波长509nm。Southern blot杂交证明,重组病毒的1kb EcoRI片段与GFP cDNA探针有很强的杂交信号,这是GFP基因在杆状病毒基因组中整合的直接证据。     

RNA干扰技术抑制内源性绿色荧光蛋白的表达

目的建立稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的细胞株;构建短发夹RNA(shRNA)表达质粒并观察其对内源性GFP的抑制作用。方法转染pEGFP-N1至HepG2细胞,利用G418筛选获得稳定表达GFP的细胞株(HepG2.GFP);设计合成针对GFP基因的siRNA对应的DNA片段,插入转录载体pTZU6 1,构建shRNA表达载体pSHGFP,转染HepG2.GFP,荧光显微镜观察细胞荧光强度,以western blot检测GFP蛋白水平,以RT-PCR检测mRNA水平。结果利用PCR方法从HepG2.GFP细胞基因组DNA中检测到GFP基因;pSHGFP能够显著抑制该细胞中GFP的表达。结论GFP基因成功整合至HepG2细胞基因组中,pSHGFP能够显著抑制内源性GFP的表达,该系统能够用于RNA干扰机制等研究中。