Vero细胞无血清培养技术的研究与应用

Vero细胞是世界卫生组织和我国生物制品规程认可的疫苗生产细胞系。随着对疫苗质量和安全性要求的不断提高,用无血清培养基取代含血清培养基培养Vero细胞已成为病毒疫苗生产的一个重要发展趋势。Vero细胞无血清培养的技术关键是研发或选择能支持细胞以贴附培养方式生长的无血清培养基。微载体培养是贴附依赖性细胞系规模化培养和病毒疫苗生产的有效技术途径。我们对Vero细胞无血清培养基的研发、Vero细胞无血清培养及病毒疫苗生产工艺做了讨论,对该领域存在的问题和发展策略进行了展望。     

Vero细胞无血清培养基的研究进展

Vero细胞是世界卫生组织和《中国药典》认可的用于人用疫苗和动物疫苗生产的细胞系,Vero细胞无血清培养生产疫苗已成为当前的主要趋势。无血清培养的关键是设计符合Vero细胞贴壁特性和提高细胞密度的无血清培养基,这也是规模化培养的关键因素之一。Vero细胞无血清培养基的开发与使用一方面减少了对动物血清的依赖,提高了病毒性疫苗的质量安全;另一方面促进了无血清培养技术的发展与应用。现就Vero细胞无血清培养基的研究进展予以综述。     

CHO细胞表达系统研究进展

CHO细胞表达系统是目前重组糖蛋白生产的首选系统。随着无血清悬浮培养技术、基因工程技术和大规模培养技术的应用和不断发展,CHO细胞表达系统已经成为生物技术药物最重要的表达或生产系统,并被广泛应用于抗体、重组蛋白药物和疫苗等产品的研发和生产中。近年来,针对CHO细胞表达系统在某些重组蛋白的表达和大规模生产中存在的不足,研究者们通过利用基因工程技术手段,结合重组蛋白表达机制的研究成果,为优化和应用CHO细胞表达系统做出了不懈努力。从培养基的优化、高产重组CHO细胞株的构建、大规模培养三个方面综述了CHO细胞表达系统的最近研究进展,以期为CHO细胞表达系统的研究与应用提供参考。     

转瓶内部结构对无血清悬浮培养昆虫细胞的影响

以昆虫细胞为宿主进行基因工程产品的开发是动物细胞培养领域十分有吸引力的研究方向[1] 。由于昆虫细胞对营养要求极高 ,且对培养环境非常敏感 ,所以一般是在含有兼具营养及保护功能的胎牛血清的培养基中进行培养。血清一方面因其高额成本而限制了昆虫细胞大规模培养技术的发展 ,另一方面又因其成分复杂、富含蛋白而给外源基因表达产物的后处理带来困难。因此 ,昆虫细胞无血清培养技术的开发一直是细胞培养工程领域的研究热点 ,采用无血清培养技术取代传统的有血清培养技术已成为昆虫细胞 杆状病毒表达系统的发展趋势[2 ] 。然而 ,昆虫细…     

无血清细胞培养在发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒生长中的应用

目的建立无血清培养基培养Vero细胞制备发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus,SFTSV)的工艺。方法分别采用含10%牛血清的MEM(10%MEM培养基)和无血清M2培养基(SF-M2培养基)在方瓶中培养Vero细胞制备SFTSV,比较无血清与含血清培养基培养Vero细胞制备SFTSV在病毒滴度及病毒繁殖曲线之间的差异。在生物反应器里用无血清培养的方式进行工艺放大,收获病毒原液并进行检定。结果无血清培养的Vero细胞能够满足SFTSV培养需求,与含血清细胞培养相比,单位细胞病毒产量没有降低,达到30~60个活病毒/细胞。可以实现在生物反应器的工艺放大,病毒高峰时病毒滴度均在7.0lg PFU/m L以上。结论无血清细胞培养可以应用于SFTSV的培养,有利于降低疫苗生产过程中的纯化难度,提高疫苗安全性。     

Vero细胞微载体培养的化学成分明确无血清培养基的设计

目的：设计适用于Vero细胞微载体培养的化学成分明确无血清培养基。方法：以商品化的DMEM／F12合成培养基为基础培养基,应用Plackett—Burman实验设计和响应面分析法设计支持Vero细胞微载体培养的化学成分明确无血清培养基。结果：以细胞密度为评价指标,在单因素实验的基础上采用Plackett-Burman实验设计考察10种培养基添加成分对Vero细胞生长的影响,确定了3种对Vero细胞生长起明显促进作用的培养基添加成分,为胰岛素、血清素和腐胺。继而利用响应面法分析了这3种添加成分的最佳水平范围,设计了一种支持Vero细胞贴附培养的无血清培养基（VERO—SFM—A）。在Bellco搅拌式培养瓶中采用VERO-SFM．A和Cytodex1微载体培养Vero细胞,细胞密度由接种时的4×10^5cells／ml增加到培养6d后的22．3×10^cells／ml,细胞活力保持在96％以上。结论：VERO—SFM—A能够有效地支持Vero细胞在微载体表面固定化生长并达到较高的细胞密度,具有实际应用于Vero细胞微载体规模化培养的应用潜力。     

类弹性蛋白多肽的从头设计、非色谱纯化及盐效应

近年来,因病毒侵害人类每年都要蒙受巨大的经济损失和社会损失。犬肾细胞MDCK以其具有的培养容易、增殖快、流感病毒感染效率高等特点,成为适用于流感病毒疫苗生产的重要细胞系之一。以MDCK细胞为研究对象,在自制无血清培养基中成功实现了MDCK细胞从有血清培养到无血清培养的驯化;并通过单细胞悬浮培养驯化过程实现了MDCK细胞的无血清单细胞悬浮培养,获得了适于无血清单细胞悬浮生长的ssf-MDCK细胞株,无血清单细胞悬浮批培养最大活细胞密度可达3.81×106 cells/mL,最大比生长速率可达0.056 h?     

转基因诱导永生化鸡细胞系的建立

传统上从鸡胚中分离病毒用于疫苗的生产常常不能满足需求,研究从体外培养的细胞中分离病毒的途径成为当前疫苗生产领域的迫切需要。本研究利用体细胞诱导重编程技术建立永生化细胞系,为应用于疫苗制备等研究和生产奠定基础。通过慢病毒载体转染转录调控因子(NANOG, LIN28和C-MYC)重编程鸡成纤维细胞,并稳定培养至100代,获得永生化的细胞,而后逐步去除细胞因子、血清等添加物,优化细胞系培养体系,并对细胞驯化实现悬浮生长,以获得单位体积最大密度的细胞。研究结果表明:通过转基因将NANOG,LIN28和C-MYC 3个因子整合入细胞中表达,细胞系对碱性磷酸酶染色呈阳性反应,端粒逆转录酶(cTERT)基因在细胞系中显著上调,并稳定培养至100代,使得这些细胞具有自我更新特性和永生化的潜能。确定了培养基中的血清替代物KSR浓度为20%,并撤除了培养基中bFGF等生长因子,为细胞大规模培养应用提供了可能。永生细胞实现悬浮生长,细胞生长倍增时间为21.71 h,最大密度为1.3×106 cells/m L。因此,我们通过重编程技术建立了一株稳定的永生化细胞系,并且使它能在低浓度KSR中悬浮培养,这为疫苗制备等研究和生产提供科学依据。     

动物细胞无血清培养基的应用及研究进展

使用无血清培养基除了避免生产批间差异、不利于目的蛋白的分离纯化和产业化时难以建立SOP以外;优化的无血清培养基可通过延长细胞的G1期或迫使细胞处于G0期而使较长时间地维持细胞高密度培养,高效地生产目的产物;还可以避免衰老死亡细胞释放的蛋白酶降解目的产物。应用CHO细胞无血清悬浮培养技术,使活细胞密度达到1×107cell/m1水平以上,与传统的批式培养相比产物浓度提高5—10倍,相对应的培养基成本明显下降。     

蛋白水解物在动物细胞培养中的应用研究进展

蛋白水解物是蛋白质经水解得到的混合物,其主要成分为肽类。蛋白水解物可优化动物细胞培养基的组成,并且其中所含部分肽段可作为外部分子信号对细胞代谢、生物合成、生长、凋亡及产物表达等生命活动产生特殊的调控作用,因而被广泛应用于动物细胞培养领域,以生产单克隆抗体、疫苗、干扰素等生物制品。其作为无血清或低血清培养基的营养成分,可消除或降低血清带来的病毒微生物污染。随着蛋白水解物生产工艺的改进及优质产品的问世,其必将在细胞培养等生物技术领域发挥越来越重要的作用。     

MDCK细胞微载体悬浮培养放大工艺研究

MDCK细胞对各种流感病毒具有高度敏感性,广泛应用于流感病毒的分离和疫苗制备.通过探索培养基中促进细胞贴壁的关键组分,并筛选水解物,开发了适合MDCK细胞生长的低血清培养基.发现钙、镁离子是细胞贴壁不可缺少的物质,麦麸水解物可以部分代替培养基中的血清.利用该低血清培养基,经过消化转移将MDCK细胞从5L反应器放大至25 L反应器,微载体上细胞贴附均匀、生长旺盛,25 L反应器中培养48 h细胞密度可达30.5×105 cells/ml.研究结果为工业规模反应器微载体悬浮培养MDCK细胞生产流感病毒奠定了基础.     

无血清培养基的成分改进及应用现状

无血清培养基因其组成成分相对清楚,制备过程简单,与天然培养基、合成培养基相比有着无可比拟的优势,因而在生命科学基础研究和生物医药等领域日益得到了重视和广泛应用。主要对无血清培养基的发展过程、成分及改进、应用及开发方面进行了论述。     

大规模动物细胞培养技术研究进展

利用动物细胞大规模培养技术可生产多种生物制品,为提高细胞活力和表达水平及有利于表达产物的纯化,采用有多种添加成分的无血清培养基培养细胞,选择更有利于细胞生长又可提高培养细胞密度的微载体和条件温和、易操作、气体交换速度快的生物反应器,在线监控细胞生存环境和生理活动,减少培养过程培养基中的抑制因素,可创造更适合细胞生存的环境,提高表达水平,向细胞中导入抗凋亡基因,可提高细胞活性和蛋白产量。利用多也微载体以球转球方式大规模培养动物细胞有很好的发展前景。     

CHO工程细胞 (11G-S) 悬浮培养的无血清培养基的设计

以悬浮适应的表达重组尿激酶原 (Pro-urokinase,pro-UK) CHO工程细胞系11G-S为对象,采用Plackett-Burman实验设计及响应面分析法,设计支持CHO工程细胞 (11G-S) 悬浮生长的无血清培养基。以细胞密度为评价指标,在单因素实验的基础上采用Plackett-Burman实验设计对影响细胞生长的培养基添加成分进行考察,确定了3种对细胞生长明显促进作用的培养基添加成分：胰岛素、转铁蛋白及腐胺。继而利用响应面法分析了这3种添加成分的最佳水平范围,设计了一种适用于CHO工程细胞 (11G-S) 悬浮培养的无血清培养基SFM-CHO-S。11G-S细胞在SFM-CHO-S批次悬浮培养的细胞最大生长密度达到4.12×106 cells/mL,pro-UK的最大累积活性达到5 614 IU/mL,培养效果优于商品化的同类无血清培养基。     

动物细胞无血清培养基的研究与设计方法

随着哺乳动物细胞培养规模的扩大和生物药物需求的增长,基于细胞及产品特性的无血清培养基的研制已成为细胞工程领域的重要课题。运用统计学实验方法,可科学有效地考察细胞培养基中多因素、多水平间的交互作用。应用新型蛋白质组分析技术及生物芯片技术定位胞浆信号通路相关蛋白、膜表面的生长因子受体、激素受体、细胞因子受体、粘附分子等,用于确定细胞培养基中调控分子的添加组合。本文系统概述了目前无血清培养基几种新型及常用的研究和设计方法,并对其应用特点做了分析,希望为动物细胞无血清培养基的研制提供可借鉴的思路。     

适于无血清贴壁培养的抗凋亡宿主细胞系CHO-IVB2的构建

应用无血清培养基培养CHO细胞时,由于没有血清提供各种贴壁因子,细胞以悬浮的方式生长。在实际的大规模细胞培养中,CHO细胞往往以贴壁方式培养,要么贴壁于悬浮的微载体中,要么贴壁于固定的聚酯盘状介质或中空纤维中,而很少直接悬浮于培养基中。在无血清培养基中,Vitronectin单一组分可以促使CHO细胞的贴壁和扩增。通过双表达lgf-1和Bcl-2基因,已经构建了可以在无蛋白培养基IMEM中抗凋亡生长的细胞株CHO-IB3。在此基础上,构建了可以同时表达Igf-1、Vitronectin和Bcl-2三个蛋白的三顺反子表达载体pCI—NII—IVB。将该载体转染于CHO—dhfr^-细胞中,构建了一个细胞株CHO—IVB2。该细胞株可以在无蛋白培养基中抗凋亡生长,适于以贴壁的方式大规模培养,用于大量生产外源目的蛋白。     

无牛血清IgG细胞培养基（—GFCS培养基）的制备及其在杂交瘤细胞体外培养中的应用

为了制备不含牛血清IgG的细胞培养基（－GFCS培养基）,并研究其在杂交瘤细胞体外培养中的应用,采用蛋白G亲和层析的方法,将含有血清的细胞培养基中的牛血清IgG去除,以制备无IgG的培养基。使用该培养基体外培养杂交瘤细胞后,监测细胞生长和上清抗体浓度。对培养上清中的IgG类单克隆抗体可以采用蛋白G亲和层析进行纯化。与示去除牛血清IgG的培养基相比,－GFCS培养基培养的杂交瘤细胞的生长状况及上清抗体浓度均无明显变化;从－GFCS培养上清中成功纯化出不被血清IgG污染的IgG类单克隆抗体,本文结果表明,采用－GFCS培养基体外培养分泌IgG类单抗的杂交瘤细胞,可以简化上清抗体的纯化工艺。     

分泌重组抗体的CHO细胞体外培养条件的优化

目的：对生物反应器细胞培养时培养时培养基组成进行优化。方法：以稳定转染了抗CD3人源化抗体的CHO细胞为模型,以无血清培养基经生物反应器高密度细胞培养后分子量小于50kDR的超滤液为基础培养基,在细胞培养板中考察添加氨基酸、丁酸钠、柠檬酸铁等多种成分对细胞生长状态和蛋白表达量的影响、结果：2mmol/L丁酸钠可以有效地诱导蛋白的表达,丁酸钠和柠檬酸铁对于促蛋白表达有协同作用,适量添加培养过程中消耗较快的氨基酸可提高细胞数和蛋白的表达量。结论：利用所述方法可快速优化培养基成分,显著提高生物反应器中细胞的蛋白表达量。     

适于无血清贴壁培养的抗凋亡宿主细胞系CHO-IVB2的构建

应用无血清培养基培养CHO细胞时 ,由于没有血清提供各种贴壁因子 ,细胞以悬浮的方式生长。在实际的大规模细胞培养中 ,CHO细胞往往以贴壁方式培养 ,要么贴壁于悬浮的微载体中 ,要么贴壁于固定的聚酯盘状介质或中空纤维中 ,而很少直接悬浮于培养基中。在无血清培养基中 ,Vitronectin单一组分可以促使CHO细胞的贴壁和扩增。通过双表达Igf_1和Bcl_2基因 ,已经构建了可以在无蛋白培养基IMEM中抗凋亡生长的细胞株CHO_IB3。在此基础上 ,构建了可以同时表达Igf-1、Vitronectin和Bcl-2三个蛋白的三顺反子表达载体pCI-NII-IVB。将该载体转染于CHO-dhfr^- 细胞中 ,构建了一个细胞株CHO-IVB2。该细胞株可以在无蛋白培养基中抗凋亡生长 ,适于以贴壁的方式大规模培养 ,用于大量生产外源目的蛋白.     

Mixture与响应面法结合开发BHK-21细胞无血清悬浮培养基

采用Mixture与响应面实验设计相结合的方法开发BHK-21细胞无血清悬浮培养基。在实验室已知配方的6种培养基A-F的基础上,通过Mixture实验筛选出BHK-21细胞无血清培养基的最优组合为A∶B∶C∶D∶E∶F=0∶0∶11∶0∶9∶0。利用响应面法针对培养基中的几种关键组分进行浓度优化,确定谷氨酰胺、酪氨酸、牛血清白蛋白和钙离子的最优浓度分别为3 mmol/L、2.5 g/L、0 g/L和0 mmol/L。该无血清悬浮培养基能很好地支持BHK细胞悬浮生长,培养时细胞最大活细胞密度可达140.21×105个/m L,比商业培养基提高了1.95倍。采用Mixture试验设计和响应面分析法能够在较短的时间内开发出适合BHK-21细胞生长的无血清悬浮培养基,为采用BHK-21细胞大规模工业化生产口蹄疫疫苗奠定了基础。