人胃癌细胞系中p53抑癌基因变异的检测及其序列分析

ｐ５３抑癌基因由于点突变,缺失或易位等方式而丧失活性是多种肿瘤发生发展的重要机理之一。本文应用聚合酶链式反应─—单链构象多态性分析（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）方法,对四种人胃癌细胞系ＭＧＣ８０３,ＢＧＣ８２３,ＧＣ７９０１和ＰＡＭＣ－８２中ｐ５３基因的第５、６、７、８四个外显子进行检测,结果发现,ＰＡＭＣ－８２的第５和第８外显子,ＧＣ７９０１的第６外显子存在突变。ＰＣＲ－直接测序证明,它们分别在１７４位、２８０位、２０４位密码子发生缺失Ｇ,ＧＣ→ＣＧ,ＡＴ→ＣＧ转变,因而可使其编码的ｐ５３蛋白分别发生移码突变,Ａｒｇ→Ｔｈｒ,Ｇｌｕ→Ａｌａ,而丧失肿瘤抑制功能。实验结果表明,ｐ５３基因在胃癌发生发展过程中,尤其是较晚阶段具有重要作用。     

非同位素PCR－SSCP方法的初步临床应用

单链构象多态性检测法（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）是近年发展起来的一项检测人类基因组突变的新技术。然而,在该技术中需要使用放射性同位素标记的核苷酸或引物,从而限制了其广泛临床研究及诊断方面的应用。本文报告一种改进的ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法,该方法不用同位素标记引物,而直接在溴乙啶染色的聚丙烯酰胺凝胶上显示ＳＳＣＰ。用该方法对５５例平滑肌肉瘤ｐ５３基因第７外显子突变的检测表明,３８％的瘤组织ＤＮＡ存在异常的ＳＳＣＰ。其中１０例有ＨａｅⅢ和ＭｓｐＩ酶切位点的突变（１８％）,１９例有突变型ｐ５３蛋白的过度表达（９例同时有异常ＳＳＣＰ改变）。而ｐ５３质粒ＤＮＡ,平滑肌瘤及Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病患者基因组ＤＮＡ无ｐ５３基因第７外显子扩增片段的异常ＳＳＣＰ改变。同时,还使用该方法对临床诊断的２０例Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病患者和８例健康对照进行了β－淀粉样蛋白前体基因第１６和１７外显子的扩增及分析,均未发现有异常ＳＳＣＰ改变及ＥｃｏＲＩ,ＢｃｌＩ酶切位点的突变。本研究结果提示,该非同位素ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法可靠、敏感、简便、快速,具有潜在的推广价值。     

人胃癌细胞系中P53抑癌基因变异的检测及其序列分析

Ｐ５３抑癌基因由于点突变,缺失或易位等方式而丧失活性是多种瘤发生发展的重要机理之一。本文应用聚合酶链式反应－－单链构锡多态性分析（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）方法,对四种人胃癌细胞系ＭＧＣ８０３,ＢＧＣ８２３,ＧＣ７９０１和ＰＡＭＣ－８２中Ｐ５３基因的第５、６、７、８四个外显子进行检测,结果发现,ＰＡＭＣ－８２的第５第第８外显子,ＧＣ７９０１的第６外显子存在突变,ＰＣＲ－直接测序证明,它们分别在１７４位、２     

利用脊髓灰质炎病毒5‘NCR和RNA聚合酶基因可提高外源基因表达

将含脊髓灰质炎病毒（ＰＶ）ＲＮＡ聚合酶的不同长度基因片段克隆到载体ｐＳＧ５质粒上,分别构建了４个表达ＲＮＡ聚合酶的质粒。体外转录实验证明,ｐＳＧ５－ＰＯＬ１．９９和ｐＳＧ５－ＰＯＬ２．０３质粒转染细胞的提取物促进了特异的ＲＮＡ转录,表明两质闰可表达ＲＮＡ聚合酶。将ＰＶ的５’ＮＣＲ序列插在载体ｐＧＲＥＥＮ ＬＡＮＴＥＲＮ－１的ＣＭＶ启动子下游,构建了ｐＧＲＥＥＮ ＬＡＮＴＥＲＮ－１－５’ＮＣＲ质粒;     

人促红细胞生成素基因组基因和cDNA的克隆及其在COS－7细胞中的表达

利用ＰＣＲ技术,从正常人胎肝染色体ＤＮＡ中克隆到长度为１５７２ｂｐ的人促红细胞生成素（ＥＰＯ）基因组基因片段,它包含除第一个外显子和第一个内含子外所有外显子及内含子。再人工合成１３ｂｐ外显子１的编码区,并与１５７２ｂｐ片段拼接,从而得到除第一个内含子的人促红细胞生成素基因组基因。将克隆得到的ＥＰＯ基因插入载体ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ得到ｐＳＶ２－ＥＰＯ表达载体,转染ＣＯＳ－７细胞后获得高效表达。利用自行研制的小鼠抗人ＥＰＯ单抗及兔抗人ＥＰＯ多抗,对表达产物进行ＥＬＩＳＡ定量测定,细胞分泌ＥＰＯ量高达２５１±７Ｕ／ｍｌ．Ｋｒｙｓｔａｌ法测得体外生物活性２４１．５±６．５Ｕ／ｍｌ．用ＥＰＯ单抗免疫沉淀结合ＳＤＳ－ＰＡＧＥ对转染细胞的表达产物做了进一步鉴定,清晰地看到了ＥＰＯ条带。从高效表达ＥＰＯ的转染细胞中分离纯化ｍＲＮＡ,用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增并克隆到ＥＰＯ的ｃＤＮＡ,这为ＥＰＯ在其它系统中的表达及ＥＰＯ的功能与结构的研究打下了基础。     

HBV—C基因探针的制备及应用

应用ＰＣＲ技术扩增出ＨＢＶ ＤＮＡ Ｃ基因片段并与ｐＡＴ１５３质粒重组,转化到Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲＩ中,经体内扩增,提纯,用光生物系标记,制备了Ｃ基因的重组质粒探针。该探检测灵敏度在Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹中达１ｐｇ,在点印迹中为５ｐｇ。用此探针以Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹方式配合ＰＣＲ技术检测乙肝病人血清中的ＨＢＶ ＤＮＡ,在５３例ＰＣＲ产物电泳检测阴性的样品中,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交又检出１８例阳性。     

HBV─C基因探针的制备及应用

应用ＰＣＲ技术扩增出ＨＢＶＤＮＡＣ基因片段并与ｐＡＴ１５３质粒重组,转化到Ｅ．ｃｏｌｉＲＲＩ中,经体内扩增,提纯,用光生物素标记,制备了Ｃ基因的重组质粒探针。该探针检测灵敏度在Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹中达１ｐｇ,在点印迹中为５ｐｇ。用此探针以Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹方式配合ＰＣＲ技术检测乙肝病人血清中的ＨＢＶＤＮＡ,在５３例ＰＣＲ产物电泳检测阴性的样品中,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交又检出１８例阳性。     

p53和c-myc异常表达与胃癌细胞多药耐药性关系的研究

应用ＳＡＢＣ免疫组织化学方法研究６７例胃标本中ｐ５３和ｃ－ｍｙｃ的表达与多药耐药性（ＭＤＲ）的关系。结果显示本组胃癌中ｐ５３阳性３２例,阳性率４７．８％;ｃ－ｍｙｃ阳性３７例,阳性率５５．２％;Ｐ－ｇｐ阳性３９例,阳性率５８．２％。ｐ５３的异常表达与ｍｄｒ－１基因表达呈显著正相关（ｒ＝０．６３,Ｐ＜０．０５）,而ｃ－ｍｙｃ和ｍｄｒ－１的表达无明显相关。提示ｐ５３异常表达可增加ｍｄｒ－１基因的表达,从而使胃癌细胞获得ＭＤＲ表型     

短芽孢杆菌α—乙酰乳酸脱羧酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

用ＰＣＲ方法扩增短芽孢杆菌α－乙酰乳酸脱羧酶基因,引入原核表达载体ｐＢＶ２２０中,得到重组质ｐＡＬＤ１．ｐＡＬＤ１的ＡＬＤＣ基因在大肠杆菌中高效表达,每毫升发酵液产酶８０单位以上,双原始菌株提高２００余倍。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白质分析表明,大肠杆菌ＤＨ５α表达的ＡＬＤＣ占细胞总蛋白量的４０％以上。研究了重组质粒稳定性,大肠杆菌ＤＨ５α和ＨＢ１０１分别大无选择压力下３０℃连续培养５０代以上,４１℃诱导     

乳腺特异性表达172~（HIS）突变型p53转基因鼠的建立

ｐ５３基因突变几乎存在于所有人类肿瘤中,尤其与严重危害妇女健康的恶性肿瘤──乳腺癌关系密切。研究表明：野生型ｐ５３基因是抑癌基因,而突变型ｐ５３基因则是癌基因──呈显性负调控突变型。本研究首次构建了这种类型的１７２ＨＩＳ突变型ｐ５３基因的转基因鼠,用以研究ｐ５３基因突变与乳腺癌发生的关系。用重组ＰＣＲ法把小鼠ｐ５３基因的第１７２个密码子ＣＧＣ突变成ＣＡＣ（由编码精氨酸突变为编码组氨酸）,得到１７２ＨＩＳ突变型ｐ５３基固。将其插入到大鼠乳清酸性蛋白（ＷＡＰ）启动子与ＳＶ４０ｐｏｌｙ（Ａ）信号序列之间。获得置于载体ｐＢＬ１１９（Ｆｉｇ．１）上的表达结构ＷＡＰ－１７２ＨＩＳｍｔｐ５３－ＳＶ４０。经过ＢｓｓＨＩＩ酶切,纯化该表达结构部分。通过显微注射,将其分别导入ＦＶＢ和Ｃ５７ＢＬ品系小鼠受精卵中,获得３２只Ｆ０代鼠。经ＰＣＲ鉴定,其中９只为转基因阳性鼠（Ｆｉｇ．２）。对其进行的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分析（Ｆｉｇ．３）证实了ＰＣＲ的鉴定,并得出了每只鼠中整合的转基因拷贝数（Ｔａｂｌｅ１）。当这９只鼠哺乳第二天时,取乳腺制备ＲＮＡ,进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交分析,其中５只的乳腺中有转基因表达,其中３只呈较高水平表达（Ｆｉｇ．     

表达流行性感冒病毒血凝素蛋白的重组腺病毒的构建

用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增流感病毒血凝素基因,将其克隆到５型腺病毒载体质粒ｐＡＤ５Ｃ中。用此质粒与ＥｃｏＲＩ酶切回收的５型腺病毒基因组片段共转染２９３细胞,通过ＰＣＲ初步筛选得到重组病毒。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳、Ｗｅｓｔ－ｅｒｎ ｂｌｏｔ重组病毒能表达流感病毒的血凝素蛋白。此重组病毒经滴鼻免疫Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠,ＥＬＩＳＡ实验证明能诱导小鼠产生针对流感的循环抗体ＩｇＧ和分泌型抗体ＩｇＡ。本实验证明,利用Ｅ     

人GM—CSF cDNA的克隆和在大肠杆菌中的表达

从诱导的人胚肺细胞ＨＦＬ株中提取总ＲＮＡ．经ＲＴ－ＰＣＲ反应获取了人ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ,ＤＮＡ序列测定表明其顺序与文献报道完全一致。为了获得高效表达,应用ＰＣＲ改造了人ＧＭ－ＣＳＦ的ｃＤＮＡ５’端核苷酸序列,并将改造的人ＧＭ－ＣＳＦ基因插入含Ｔ７启动子的质粒ｐＥＴ－１１ｄ构建成表达质粒ｐＥＴＣ－５,将此质粒转化大肠杆菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）得到表达菌株ＢＬＥＣ４。表达菌株用０．５ｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导２小时后,产生大量重组蛋白并形成包涵体。ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳图谱扫描结果表明,ｒｈＧＭ－ＣＳＦ产量占菌体总蛋白量的１６％。ＥＬＩＳＡ和ＴＦ－１细胞培养测定表明,初步纯化和复性的ｒｈＧＭ－ＣＳＦ具有天然的ｈＧＭ－ＣＳＦ生物活性。     

HCV5＇端非编码区cDNA的体外转录

采用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从广东省一例慢性丙型肝炎病人血清中获得丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）５＇端非编码区（５＇ＮＣＲ）３０２ｂｐ的ｃＤＮＡ片段,经补齐和提纯后插入ｐＵＣ１９质粒,获得的重组体ｐＵＮ进行序列测定。将ｐＵＮ的目的基因亚克隆进体外转录载体ｐＳＰＯＲＴＩ多克隆位点的ＥｏｏＲＩ和ＰｓｔＩ切点之间,所得重组体ｐＳＮ线性化后由Ｔ＿７ＲＮＡ多聚酶及ＳＰ６ＲＮＡ多聚酶引导体外转录反应,产物经凝胶电泳及特异引物ＲＴ－ＰＣＲ,证实ＳＰ６引导的是正义ＲＮＡ,Ｔ７合成的是反义ＲＮＡ,其大小分别力４２９ｂｐ和３６２ｂｐ。并证实所得ＲＮＡ力ＨＣＶ５＇ＮＣＲｃＤＮＡ转录而来。获得的ＨＣＶ５＇ＮＣＲｃＤＮＡ和ＲＮＡ在常规逆转录和ＰＣＲ步骤中用于设立有效的模板对照,对消除假用性及评估试剂有重要意义。同时,ＨＣＶ５＇ＮＣＲ体外转录载体的构建可用于制各ＲＮＡ探针和反义ＲＮＡ,改进后还可作为定量ＰＣＲ的竞争性模板。     

hBMP—2cDNA在COS细胞和小鼠肌肉中的表达

研究了骨形态发生蛋白ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ在ＣＯＳ细胞和小鼠肌肉中的表达的情况,从ｐＳＰＳ６５ＢＭＰ－２质粒中回收ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ,删除５端的非翻译序列,插入ｐＳＶＬ载体中,构建了含有ＢＭＰ－２全长编码序列的重组表达质粒ｐＳＶＬＢＭＰ－２将表达质粒导入ＣＯＳ－７细胞中,细胞ＲＮＡ点杂交结果表明,转染ＢＭＰ－２基因的细胞内ＢＭＰ－２的ｍＲＮＡ水平明显升高,细胞培养上清的ＥＬＩＳＡ显示,转染ＢＭＰ－２ｃ     

广东两株人免疫缺陷病毒的分离和鉴定

从我省两名经性途径感染艾滋病的病人中采血,分离外周血单核细胞（ＰＢＭＣｓ）,将其与正常人ＰＢＭＣｓ共培养分离人免疫缺陷病毒（ＨＩＶ）,３周后检测上清ＨＩＶ－１ｐ２４抗原（ＥＬＩＳＡ法）超过阈值。将共培养第四周细胞和上清分别感染Ｈ９细胞（Ｔ细胞淋巴瘤传代细胞）,一周后检测ＨＩＶ－１ ｐ２４怕,证明有病毒生长。用ＨＩＶ－１ ＥＮＶ基因引物的套式聚合酶链反应（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）证实,两株新分离的病毒     

转译优化对EPO基因在COS7细胞中表达的影响

利用ＣＯＳ７细胞暂时表达系统,研究转译起始序列对ＥＰＯ－ｃＤＮＡ表达的影响。通过ＤＮＡ重组技术,构建了原ＥＰＯ－ｃＤＮＡ表达载体ｐＣＳＶ－ＥＰＯ（１）,其转译起始序列为５＇ＡＡＴＴＣＡＴＧＧ３＇。同时通过定点突变技术,将起始序列改变成５＇ＣＣＡＣＣＡＴＧＧ３＇,而构建了另一表达载体ＰＣＳＶ－ＥＰＯ（２）。后经序列分析证明无误后和前均通过ＤＥＡＥ－ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞上清,测定结果为     

EB病毒转化Hu－TLC－SCID小鼠脾细胞的实验研究

利用ＥＢ病毒转化可产生较高水平人ＩｇＧ和特异性抗２型登革病毒人抗体的Ｈｕ－ＴＬＣ－ＳＣＩＤ小鼠脾细胞,通过免疫组化、免疫荧光和ＰＣＲ法检测转化细胞的人Ｂ细胞表面标志、ＥＢ病毒抗原和ＥＢ病毒基因。结果表明,被转化的Ｈｕ－ＴＬＣ－ＳＣＩＤ小鼠脾细胞能继续产生抗２型登革病毒的特异性人抗体,并具有人Ｂ细胞的、ＳｍＩｇＧ标志及ＥＢ病毒潜伏膜蛋白－１（ＬＭＰ－１）基因,可表达ＬＭＰ－１和ＥＢ病毒核抗原（ＥＢＮＡ）。     

P物质对大鼠DRG神经元胞体膜的作用

本文在大鼠ＤＲＧ神经元标本上应用细胞内记录,以确定ＳＰ对ＤＲＧ细胞的膜反应及其可能的离子机制。实验所测ＤＲＧ细胞静息膜电位为－５８．９±８．２ｍＶ（Ｘ±ＳＥ,ｎ＝８１）。传导速度：Ａ_（α／β）细胞为２０．４±４．８ｍ／ｓ（Ｘ±ＳＥ）,范围１４．１－２８．７ｍ／ｓ（４７／６０）;Ａδ及Ｃ类细胞为９．８±５．２ｍ／ｓ,范围１．２－１３．７ｍ／ｓ（１３／６０）。浴槽滴加ＳＰ（１０￣（－７）－３×１０￣（－４）ｍｏｌ／Ｌ）在大多数细胞可引起明显的膜去极化反应（５６／６０）。少数细胞对ＳＰ无反应（４／６０）。在ＳＰ去极化期间膜电导值有所增加,从平均值２．７２×１０￣（－８）ｍｈｏ增加２４．６％（ｎ＝３）。所测逆转电位值在＋４０－＋５０ｍＶ之间（ｎ＝３）。浊流平衡液（ＢＳＳ）中ＮａＣｌ以氯化胆碱置代,或用含ＴＴＸ（１０￣（－５）ｍｏｌ／Ｌ）的ＢＳＳ灌流,可使ＳＰ－去极化幅值大大减小但不能完全消除。而高（２０ｍｍｏｌ／Ｌ）和低（０ｍｍｏｌ／Ｌ）Ｃａ￣（２＋）的ＢＳＳ灌流时,使ＳＰ－去极化幅值相应的增加和降低。用含１０￣（－４）ｍｏｌ／ＬＣｄ￣（２＋）及１０￣（－２）ｍｏｌ／ＬＴＥＡ的ＢＳＳ灌流,均使ＳＰ－去极化明显减小。     

PCR—单链构象多态性分析对p53基因点突变检测的研究进展

单链构象多态性（ＳＳＣＰ）对分析基因的突变是一种有效的手段,并具有其独特的优点。ＰＣＲ与ＳＳＣＰ结合后检测灵敏度更高,而在许多类型的肿瘤都存在有ｐ５３抑癌基因的突变,章综述了ＰＣＲ－ＳＳＣＰ分析技术检测ｐ５３基因突变的进展。     

生长素结合蛋白cDNA的克隆及其在烟草中的表达

基于拟南芥内质网生长素结合蛋白基因的ｃＤＮＡ序列,设计合成了Ａｐ５和Ａｐ３两个引物,应用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增了拟南芥的ＡＢＰ基因。将该基因克隆在植物表达载体ｐ３５ＳＳＩＮ的３５Ｓ启动子必Ｎｏｓ３‘端之间,得到植物表达载体ｐ３５ＳＥ。通过农杆菌介导的方法对烟草ＳＲ１进行了转化,由分子杂交等检测证明,生长素结合蛋白基因已在烟草中表达,同时转基因烟草后代对生长素的敏感性明显增加。