巨大芽孢杆菌WSH-002丙氨酸脱氢酶066晶体制备及X-射线衍射分析

丙氨酸脱氢酶可逆催化丙氨酸脱氨生成丙酮酸,在氨基酸和酮酸的合成及代谢中至关重要.本研究通过PCR从巨大芽孢杆菌WSH-002中克隆并构建了丙氨酸脱氢酶基因(aldBM066)的原核表达载体,经原核表达后,采用Ni-NTA亲和层析法和阴离子交换色谱法纯化获得蛋白AldBM066,在289 K下以座滴法进行晶体生长条件筛选和制备.通过对蛋白质结晶条件的筛选,最终在蛋白质浓度为15 mg/mL及含有0.1 mol/L 乙酸钠（pH 5.0）和2.4 mol/L甲酸钠的缓冲液中获得了理想的蛋白质晶体,晶体大小约为210 μm×180 μm×150 μm,X-射线衍射数据显示,该蛋白质晶体衍射分辨率为2.88 A,空间群为三方晶系,晶胞参数为a=b=118.71 A,c=150.51 A,α=β=90°,γ=120°,每个不对称单位中含有1个AldBM066单体,马修斯系数为2.62 A3/Da,溶剂含量约为53.02%.衍射数据的成功收集为解析巨大芽孢杆菌WSH-002中丙氨酸脱氢酶的三维结构奠定了前期基础,将有助于阐明以单体存在的丙氨酸脱氢酶的催化机制.     

假坚强芽孢杆菌四氢嘧啶羟化酶的晶体制备及X-射线衍射研究

摘要:【目的】假坚强芽孢杆菌四氢嘧啶羟化酶蛋白纯化、晶体制备及X-射线衍射研究。【方法】通过PCR从假坚强芽孢杆菌OF4中克隆获得四氢嘧啶羟化酶基因,构建原核表达载体,经过原核表达,采用Ni-NTA亲和层析法和分子排阻色谱法纯化蛋白,289 K下采用座滴法进行晶体筛选和制备,在低温100 K下通过X-射线衍射仪(Rigaku MicroMax-007 HF)收集晶体衍射数据。【结果】通过原核表达及纯化成功获得了适合晶体生长的蛋白BpEctD。通过筛选最终在蛋白浓度为6.5 mg/mL及含有0.2 mol/L MgCl2·6H2O,0.1 mol/L Bis-Tris pH6.5,25% (W/V) 聚乙二醇3,350的缓冲液中获得了理想的蛋白晶体,其大小约为360 μm×240μm×60 μm,并在100K下成功收集了衍射数据,晶体衍射分辨率为2.40,空间群为三斜晶系P1,晶胞参数为a=45.18,b=58.87,c=68.81,α=77.48°,β=86.03°,γ=66.97°,每个不对称单位中含有2 个BpEctD单体,马修斯系数为2.44 3/Da,溶剂含量约为49.53%。【结论】衍射数据的成功收集为假坚强芽孢杆菌OF4四氢嘧啶羟化酶三维结构的解析奠定了前期基础,将有助于阐明四氢嘧啶羟化酶的催化机制。     

重组肺炎链球菌甘油脱氢酶活性及晶体培养的初步分析

甘油脱氢酶能够氧化胞内甘油为代谢活动提供能量,并参与调控与宿主粘附相关细菌蛋白质的表达,是潜在的抗菌药物靶点. 本文利用大肠杆菌BL21原核表达肺炎链球菌甘油脱氢酶,获得大量上清表达的目的蛋白. 再用Ni-NAT亲和层析、DEAE离子交换层析以及Superdex 200分子筛进行纯化. 经数据拟合,证实该酶在溶液中以同源二聚体形式存在. 光谱实验证实该重组表达甘油脱氢酶仍具有氧化甘油生成1, 3-二羟基丙酮的活性. 用Hampton试剂盒初筛晶体及棋盘法优化晶体,在0.1 mol/L Bicine PH 9.6,13% PEG MME 5000,0.2 mol/L KSCN,4% Dioxone条件下,得到了晶型好且有一定衍射能力的单晶,为解析肺炎链球菌甘油脱氢酶的三维结构及研究结构与酶活之间的关系奠定了基础.     

富硒螺旋藻中含硒藻蓝蛋白的纯化、结晶及初步晶体学研究

从富硒螺旋藻中提取含硒藻蓝蛋白,经凝胶色谱和离子交换色谱纯化,应用悬滴气相扩散法,采用(NH4)2SO4和PEG4000作沉淀剂,获得了该蛋白质晶体的两种晶型.晶型Ⅰ属于单斜晶系,晶胞参数a=10.80 nm,b=11.70 nm,c=18.40 nm,β=90.2°,晶体空间群属于P21.单位晶胞中每个晶体学不对称单位含12个(αβ)单体,晶体衍射的最高分辨率达0.28 nm.晶型Ⅱ为六方晶系,晶胞参数为a=b=15.5 nm,c=4.03 nm,晶体空间群属于P63.晶体衍射的最高分辨率达0.28 nm.单位晶胞中每个晶体学不对称单位含1个(αβ)单体.对分子在晶体中的可能堆积方式进行了讨论.     

利用巨大芽孢杆菌酶系合成L-丙氨酸和L-缬氨酸

本文研究了利用巨大芽孢杆菌ATCC_(39118)酶系合成氨基酸,同时也研究了丙氨酸脱氢酶、缬氨酸脱氢酶及葡萄糖脱氢酶的提纯工艺。所获得的AlaDH、ValDHc和GlcDH的比活性分别为11.2u/mg,7.8u/mg和23.0u/mg。为了进一步探讨由α-酮酸酶法转化成氨基酸的最适条件,我们对以上三种酶的主要性质,包括稳定性,最适pH、动力学常数、底物专一性及底物和产物对酶的抑制作用等进行了测定。同时用粗酶提取液和纯酶进行了由丙酮酸合成L-丙氨酸,由α-酮异戍酸合成L-缬氨酸的批量实验,在转化中葡萄糖脱氢酶作为NADH的再生酶。结果粗酶提取液催化L-丙氨酸产量的克分子转化率为80％,而纯酶催化的克分子转化率增加到92％。L-缬氨酸产量的克分子转化率也类似(93％)。     

解淀粉芽孢杆菌产凝乳酶发酵优化

对实验室前期筛选到的一株解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens JNU002进行培养基和培养条件优化。单因素实验确定最佳碳源为乳糖,除麸皮外,其他氮源对产酶无明显促进作用,KH2PO4和Ca CO3等对产酶有促进作用。通过正交试验确定最佳培养基成分为麸皮16 g/L、乳糖10 g/L、KH2PO41 g/L、Ca CO31 g/L,其中麸皮对解淀粉芽孢杆菌产凝乳酶影响较大。在发酵温度37℃、种子液培养时间18 h、接种量0.5%、500 m L摇瓶装液量100m L时,较适宜解淀粉芽孢杆菌产凝乳酶。优化后解淀粉芽孢杆菌产凝乳酶活力达到12 766 SU/m L,比优化前提高了3.5倍。     

高粱NADP苹果酸脱氢酶的纯化及其分子特性

用Sephadex G-100柱和制备性等电聚焦电泳纯化了高梁叶片NADP苹果酸脱氢酶,得到电泳均一的酶制剂,酶比活力提高350倍。天然酶含有两个分子量为4万D的亚基。动力学研究表明Km(OAA)=31μmol/L:K_m(NADPH)=48 μmol/L;K_m(Mal)=11m mol/L:K_m(NADP)=45μmol/L。NADP为NADPH的竞争性抑制剂,抑制常数K_i=190 μmol/L。 在体外DTT为NADP苹果酸脱氢酶的激活所必需。DTT对该酶的激活受一小分子蛋白、NADP及离子强度所调节。     

排硫硫杆菌D6中硫化氢脱氢酶的纯化及性质

从烟气生物脱硫系统的好氧产硫磁性稳态流化床反应器中,经反复纯化分离出脱硫优势菌排硫硫杆菌菌株D6,采用四步工艺纯化出膜结合型硫化氢脱氢酶。SDS-PAGE测定显示其由α1β1亚基组成,光谱分析表明含有1 mol FAD/mol酶,血红素染色揭示小亚基上结合有1 mol血红素c/mol酶,该酶属于氧还蛋白家族。该酶的最适pH为8.6,对马心细胞色素c和硫化物的表观Km分别为2.5μmol/L和6.1μmol/L,反应计量实验表明其氧化产物为元素硫。硫化氢脱氢酶受到硫和亚硫酸盐的抑制,100μmol/L的氰化钾对该酶抑制率达72%。     

球形芽孢杆菌Ts-l毒蛋白的分离纯化

球形芽孢杆菌Ts-1对蚊虫幼虫有高效杀灭能力,其有毒成份为一种蛋白质。纯芽孢一晶体复合物经超声波处理后,以0．05 mol／L的NaoH抽提毒素,经sephadex G-2 00葡聚糖凝胶柱层析纯化,用SDS—PAGE检验柱层析得到的杀虫活性部分,Ts—1的芽孢-晶体复合物中主要为4zkD和43KD的两种蛋白质。经聚丙烯酰胺凝股制备电泳分离纯化,生物活性测定表明这两种蛋白质都有杀蚊毒效,经DEAE纤维素柱层析进一步纯化,获得了分子量为42kD的毒蛋白。     

黄瓜27 kD LHC-Ⅱ复合物三维结构的电子晶体学初步研究

从黄瓜(Cucumis sativus L.)叶片中分离出只含有一种亚基(27 kD)的LHC-Ⅱ复合物.采用batch方法获得了其二维晶体,大小为0.7 μm×1.0μm,衍射能力达30 A.负染样品的二维投影结果表明,该晶体为p3对称性,晶胞参数为15.4 nm×15.4 nm,不同于以往报道的菠菜(Spinacia oleracea L.)或豌豆(Pisum satium L.)LHC-Ⅱ晶体,为另外一种晶型.采用tomography技术,收集了0°～-55°系列倾斜照片,进行三维重构.LHC-Ⅱ复合物是由6个单体组成的六元环,相邻2个单体分别从膜的两侧插膜,方向相反,在膜区靠疏水-疏水相互作用成二聚体,3个相同的二聚体相互连接成六元环.     

高渗提高凝结芽孢杆菌P4-102B菌株的电击转化效率

【目的】凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)是一种非常有工业应用前景的微生物,但遗传转化的困难是限制对其进行代谢工程改造的关键因素。本研究主要考察生长培养基、电击缓冲液、复苏培养基中添加高渗剂如山梨醇、甘露醇等对凝结芽孢杆菌转化效率稳定性的影响,并对凝结芽孢杆菌电击转化条件进行优化。【方法】用穿梭质粒p NW33N电转化凝结芽孢杆菌P4-102B,系统地考察高渗条件下细胞生长阶段、感受态菌体浓度、电击缓冲液组分和复苏培养基组成等因素对转化效率的影响。【结果】同一电场压力下高渗体系转化效率较低渗体系明显提高且稳定性较好,菌体在含有0.5 mol/L山梨醇的LB培养基中生长到OD600为0.8时收集,用SMG[0.5 mol/L山梨醇,0.5 mol/L甘露醇,10%(质量体积比)甘油]电击缓冲液洗涤菌体4次制备感受态,在固定电场强度14 k V/cm、脉冲时间5 ms、1 mm规格的电转杯进行电击转化,电转化后立即加入含有0.5 mol/L山梨醇和0.38 mol/L甘露醇的LB复苏培养基培养,能够获得最佳的转化效率2.7×102 CFU/μg DNA。【结论】使用高渗电击转化法能够提高电击转化的稳定性和重复性,并且可以获得较高的转化效率。     

产几丁质酶侧孢短芽孢杆菌的筛选及其酶学性质研究

筛选并鉴定高产几丁质酶的芽孢杆菌菌株,旨在研究其酶学特性为高效利用几丁质酶资源奠定基础。分离纯化产几丁质酶芽孢杆菌,将目的菌株的几丁质酶基因异源表达并纯化后研究其酶学参数。考虑到菌株的生物安全性,选择侧孢短芽孢杆菌CDY64为进一步研究对象,将其几丁质酶基因表达于大肠杆菌BL21中。酶学研究表明,纯化后的几丁质酶最适反应温度为60℃,在p H6.0-8.0范围内均表现出良好的活性;使用胶体几丁质作为底物时Km与kcat值分别为5.85μmol/L和29.27 S-1。结果表明,侧孢短芽孢杆菌CDY64所产几丁质酶在高温下具有良好的催化能力,在体外对多种植物病原真菌表现出了良好的拮抗作用。     

单斜Al－（L－丙氨酸）胰岛素初步晶体学研究

用微量气相扩散方法在含酚的柠檬酸缓冲体系中,得到了可供Ｘ射线晶体学分析用的Ａｌ－（Ｌ－丙氨酸）胰岛素晶体,晶体衍射能力为２．５Ａ。经Ｘ射线衍射分析确定,该晶体属于单斜晶系,空间群为Ｐ２_１,晶胞参数：ａ＝６１．５Ａ,ｂ＝６２．２Ａ,ｃ＝４８．３Ａ,α＝γ＝９０．０°,β＝１１０．９°。晶胞中每个结晶学不对称单位含有一个Ａｌ－（Ｌ－丙氨酸）胰岛素六聚体。     

地衣芽孢杆菌原生质体电转化方法的研究

为了解决地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)工业菌株难以转化的问题,将原生质体制备、电穿孔和原生质体再生技术相结合,建立了一种地衣芽孢杆菌原生质体电击转化方法。在对菌体生长状态、溶菌酶作用时间、电转电压、渗透压保护剂等条件进行优化后,试验了将不同类型的表达载体,即游离型质粒p GJ103(3.3kb)和整合型质粒p AX01(9.3kb),分别转入两株地衣芽孢杆菌工业生产菌株B.licheniformis CICC 10181和B.licheniformis CICC 20204中。实验结果显示,对数生长期后期的菌体酶解40min后制备的地衣芽孢杆菌原生质体得率为96%,再生率达25%以上。原生质体与质粒DNA在最适电压0.6k V/mm下电击转化,并以0.5mol/L山梨醇或甘露醇作为渗透压保护剂进行再生培养后,最终游离型质粒的转化率可达0.88×102~1.1×102CFU/μg p GJ103,整合型质粒的转化率达到0.45×102~0.52×102CFU/μg p AX01。该方法为地衣芽孢杆菌野生工业菌株的遗传改造提供了一种新的、高效的转化手段。     

湖南、江西铀矿床区土壤中(B.cereus)分离及形态学比较

从湖南、江西两地铀矿床区采集土壤样品 13份 ,用选择性培养基从 10 -3 稀释的平板中分离到卵黄反应阳性菌 2 38株 (其中xw1,xw2 无该菌 )。从中筛选 8株 ,经纯化培养 ,对 8株进行了显微镜和电镜的形态观察 ,其形态为典型的杆菌 ,大小为 1.2～ 1.4μm× 2 .6～ 3.4μm ,芽孢为椭圆或橄榄果实形。没有孢囊和伴孢晶体 ,周生鞭毛。生理生化分析结果证明 ,8株均为典型的蜡状芽孢杆菌 (Bacilluscereus)。     

枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的克隆及其序列分析

根据Lampel报道的葡萄糖脱氢酶基因序列设计合成两条引物,以野生型枯草芽孢杆菌染色体DNA为模板,PCR扩增得到含有葡萄糖脱氢酶基因的大约780bp的DNA片段,将其克隆到pUC-T载体中。序列分析表明,克隆得到的葡萄糖脱氢酶基因含有783bp,编码261个氨基酸的蛋白质。得到的基因序列与文献报道的进行比较,其核苷酸同源率为75．5％,编码氨基酸序列的同源率为83．9％。     

合成利巴韦林的关键酶瞟呤核苷磷酸化酶的原核表达及活性分析

目的：在枯草芽孢杆菌中表达嘌呤核苷磷酸化酶（PNPase）并分析其活性。方法：将PNPase的编码基因deoD克隆入pDG148表达载体,构建原核穿梭型表达载体pDG148-deoD,采用电转化方法将表达载体转入枯草芽孢杆菌WB600后诱导表达重组PNPase;研究重组PNPase的活性。结果与结论：获得的重组PNPase活性较对照提高了193．9％,其最适催化条件为65℃、pH7．5、500μmol／L底物浓度和1％1,2,4-三氮唑-3-羧甲酰胺;对重组菌的发酵条件进行了初步优化,IPTG诱导6h后在发酵液中添加0．5％的Tween-80能大幅度提高重组PNPase的酶活力。     

苏云金杆菌伴孢晶体的研究进展

苏云金杆菌能产生伴孢晶体蛋白,又叫δ—内毒素,对鳞翅目、双翅目、甚至鞘翅目的许多种昆虫幼虫有毒性。这类蛋白在芽孢形成期大量合成。对鳞翅目昆虫有毒的伴孢晶体一般为双金字塔形,蛋白质分子量为1.3×10~5道尔顿,对双翅目昆虫有毒的伴孢晶体一般为不规则的立方体,蛋白质分子量6.5×10~4道尔顿。对鞘翅目昆虫有毒的伴孢晶体一般为扁平长方形,蛋白质分子量为6.4×10~4道尔顿。对毒素蛋白的分离纯化办法、物理化学性质、毒理以及其它方面的研究现状做了介绍。     

福氏志贺菌硫氧还过氧化物酶的晶体生长和初步晶体学研究（英文）

过氧化物酶是一类广泛存在于生物体内的抗氧化剂,清除有氧代谢过程中产生的活性氧,对于保护机体内的生物大分子有重要的生物学功能.福氏志贺菌硫氧还过氧化物酶(SF2523)作为过氧化物酶家族的一员,通过清除福氏志贺菌体内的活性氧,在维持其活性和致病性上起重要作用.目前,SF2523的三维结构还没有得到解析,其具体的功能机制也尚不清楚.为了得到SF2523蛋白的三维结构,进而了解具体的功能机制,实验获得了均一稳定的可溶蛋白,验证具有体外活性,培养出可用于X射线衍射的蛋白质晶体.在中国科学院高能物理研究所同步辐射装置收到晶体的衍射数据供结构解析使用.SF2523晶体属于空间群P2_12_12_1,晶胞参数为a=35.80,b=50.63,c=88.52,α=β=γ=90.00°,每个晶体学不对称单位含有1个蛋白质分子,马修斯系数为2.03~3/u,溶剂含量为39.56%.     

抗生素类作为防腐剂对苏云金杆菌芽孢及伴胞晶体的影响

报道了14种抗生素作为防腐剂对苏云金杆菌CH菌株芽孢萌发的抑制作用和对伴胞晶体的影响。结果表明,红霉素,盐酸环丙沙星对CH菌株芽孢萌发有较强的抑制作用,在0.5μg/mL低剂量下可抑制芽孢的萌发;氧氟沙星和麦迪霉素抑制作用稍差,在5μg/mL的剂量下抑制作用随时间延长而减弱,96h后基本丧失抑制作用。其它几种抗生素对苏云金杆菌芽孢萌发的抑制终浓度均在30μg/mL以上;SDS-PAGE分析和生物测定表明,红霉素,盐酸环丙沙,氧氟沙星和麦迪霉素对伴胞晶体均无明显损伤作用。其中氧氟沙星45oC条件下放置4d,发酵液毒力保持率为96.2%。