一种鉴别临床常见致病性葡萄球菌方法的建立与初步评价

目的建立一种鉴别临床常见致病性葡萄球菌的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCRRFLP）方法。方法采用经全自动微生物鉴定系统和分子生物学方法准确鉴定的金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌各3株,提取细菌DNA,PCR扩增tuf基因,扩增产物Alu I、Hinf I双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳,分析不同葡萄球菌酶切后带型的差异。收集临床分离葡萄球菌142株,采用建立的PCRRFLP对其进行分类鉴别,随机选择分类鉴别的葡萄球菌各20株,PCR扩增16S r DNA,扩增产物测序,将结果与Gen Bank数据库进行比对,初步评价该方法的准确性。结果金黄色葡萄球菌,表皮葡萄球菌,溶血葡萄球菌均能扩增出长668 bp DNA片段。扩增产物经Alu I、Hinf I双酶切后电泳条带不同,金黄色葡萄球菌出现三条带（108 bp/192 bp/217 bp）,表皮葡萄球菌出现两条带（192 bp/304 bp）,溶血葡萄球菌出现两条带（192 bp/217 bp）。PCR-RFLP结果显示,142株葡萄球菌中金黄色葡葡球菌、表皮葡葡球菌和溶血葡葡球菌分别为67、29和46株。随机挑选的20株不同种葡萄球菌16S r DNA测序结果与Gen Bank数据库对应序列的相似性均〉99%,说明建立的PCR-RFLP方法能准确区分三种常见葡萄球菌。结论 PCRRFLP能准确鉴别临床常见的致病性葡萄球菌,为葡萄球菌病的分子诊断奠定了基础。     

利用PCR鉴定四川雉鹑性别

四川雉鹑是我国特有珍稀濒危雉类,为国家Ⅰ级保护动物.本文通过设计引物,扩增四川雉鹑W染色体上雌性特异基因HINTW,利用PCR产物有无对其进行性别鉴定,发现在四川雉鹑中雄性个体无阳性产物,而雌性扩增出500 bp和300 bp 2条条带.应用通用引物扩增四川雉鹑基因组CHD基因,其中雄性个体扩增出约500 bp的条带,而雌性个体则扩增出500 bp和750 bp 2条条带,通过其Z/W染色体上基因片段长度差异可进行性别鉴定.上述两种方法对9个四川雉鹑的性别鉴定结果均一致.     

鸵鸟性别鉴定的分子标记方法

鸵鸟(Struthiocamelus)属于平胸总目鸟类,雌雄鸵鸟在性成熟前外部形态相同,很难通过外观和形态来鉴定性别,给早期分群饲养造成了很大的困难。实验利用鸵鸟羽毛提取基因组DNA,之后利用EE0.6和CHD基因中2个引物组合对3对已知性别和9只未知性别鸵鸟的性别基因片段进行特异性扩增。结果显示,这对引物组合在雄性鸵鸟的DNA中未扩增出片段,在雌性鸵鸟DNA中扩增出1条片段,可以对鸵鸟的性别作出准确鉴定,从而解决幼雏期鸵鸟难以从外貌上区分其性别的问题。     

大麻性别的RAPD和SCAR分子标记

利用随机扩增多态性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)技术获得与大麻性别连锁的分子标记.将10株雄性大麻或10株雌性大麻的单个DNA样品等量混合分别组成雄性或雌性DNA池(DNApool),以提供具有相同遗传背景的雌、雄性DNA样品.每个随机引物分别用三个不同的循环程序进行PCR扩增.在30个随机引物中,用引物401扩增得到一条约2.5kb雄性多态性片段.对该片段进行了克隆和序列分析,并根据序列分析结果将上述RAPD分子标记转化为重复性和特异性更好的SCAR(sequencecharacterizedamplifiedregions)分子标记.     

大麻性别的RAPD和SCAR分子标记

利用随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA,RAPD)技术获得与大麻性别连锁的分子标记,将10株雄性大麻或10株雌性麻的单个DNA样品等量混合分别组成雄性或雌性DNA池（DNApool),以提供具有相同遗传背景的雄,雄性DNA样品。每个随机引物分别用三个不同的循环程序进行PCR扩增,在30个随机引物中,用引物S401扩增得到一条约2．5kb雄性多态性片段,对该片段进行了克隆和序列分析 ,并根据序列分析结果将上述RAPD分子标记转化为重复性和特异性更好的SCAR（Sequence characterized amplified regions)分子标记。     

蛋鸽早期性别DNA分子鉴定

蛋鸽早期性别的鉴定一直是制约蛋鸽业发展的瓶颈问题。在本研究中,我们采用PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测的方法,对20日龄期的100只蛋鸽的性别连锁基因染色体解旋酶DNA结合基因CHD(chromo-helicase DNA binding)进行跨内含子扩增检测。蛋鸽早期DNA分子电泳检测结果与成年后的真实性别核对结果表明:所有雌性蛋鸽扩增结果含有两条带,其大小分别为280bp和250bp,雄性蛋鸽仅有一条280bp的条带;泊松统计分析发现,蛋鸽早期DNA分子判定结果达到统计学上显著水平,可以作为蛋鸽早期性别鉴定的一种方法。本实验实现了以DNA分子为基础的早期蛋鸽性别鉴定,将对蛋鸽业早期的饲养成本降低和早期雄性蛋鸽的淘汰起到准确的指导作用。     

半滑舌鳎雌性特异AFLP标记CseF783的克隆及其在遗传性别鉴定中的应用

半滑舌鳎性别控制和全雌育种等研究领域中迫切需要一种能够快速鉴定鱼类个体遗传性别的有效方法。文章采用AFLP技术, 利用选择性引物组合(E-ACT/M-CAA)从半滑舌鳎中筛选到一条雌性特异的AFLP标记。对该标记进行二次PCR扩增、琼脂糖凝胶回收、克隆、测序。分析表明, 序列全长为791 bp, 与GenBank中的序列无同源性。以该雌性特异AFLP标记DNA序列为模板, 设计了一对特异的PCR引物, 成功地将其转化为SCAR(Sequence characterized amplified regions)标记, 并在100尾已知性别的半滑舌鳎个体(雌雄各50尾)中进行验证, 结果表明, 该SCAR标记在所有雌性个体中均扩增得到一条长度为324 bp的DNA条带, 而在49尾雄性个体中均扩增不到该DNA条带(有1尾雄性个体例外), 证明该SCAR标记是雌性特异的, 并可用于半滑舌鳎个体遗传性别鉴定。随后, 利用该SCAR标记检测了3日龄半滑舌鳎幼苗, 结果表明, 雌性个体比例为41.7%。     

银杏雌雄基因组DNA间的差异性分析

本研究应用RAPD技术,应用300个10bp随机单引物及200对随机双引物组合,检测了雌雄异株银杏基因组DNA的多态性。结果表明:雌雄基因组间具有极高的相似性,在检测到的3450个标记中,仅获得1个与银杏雄性基因组相关的RAPD标记。以该标记为探针,与雌雄银杏基因组DNA的Southern杂交分析,其杂交信号在两性之间表现为限制性片段长度多态性,该结果为寻找银杏早期性别鉴定的探针以及在细胞和分子水平进一步研究其性别问题奠定了基础。     

λ DNA酶切片段与pUC19克隆载体的构建与鉴定

目的:构建λDNA片段/p UC19重组质粒并鉴定。方法:将克隆质粒p UC19和λDNA进行Hind III酶切、碱法提取质粒,琼脂糖凝胶电泳纯化鉴定、紫外分光光度测定,T4DNA连接酶切产物、冰Ca Cl2转化E.coli DH5α菌株使之成为感受态细胞、蓝白斑筛选法筛选并鉴定重组转化子。结果:1所提质粒p UC19电泳获得预期的3条带,经由标准DNA Markar比对准确,提取浓度满足酶切需要。2酶切质粒p UC19电泳获得预期的1条带,λDNA片段电泳获得的4条带,经由标准DNA Markar比对准确。3培养皿不同区域出现数量不等的蓝色、白色菌斑。结论:应用质粒p UC19可成功构建λDNA片段/p UC19重组质粒。经鉴定,该克隆载体能够导入菌株E.coli DH5α,转化效率较高。     

中华鲟性别相关的扩增片段长度多态性分子标记筛选

性别鉴定是生产养殖和物种保护中常用的技术。中华鲟Acipenser sinensis是我国特有的一种大型海河洄游性鱼类,已极度濒危。由于中华鲟性成熟时间长,缺乏第二性征,基于外部特征难以进行性别鉴定,因此,筛选中华鲟性别特异性分子标记具有重要意义。利用扩增片段长度多态性(AFLP)分子标记,用10条Eco R I-ANN引物和8条Mse I-CNN引物组成的80对引物,对9尾雄性和15尾雌性中华鲟个体进行PCR扩增和毛细管电泳荧光分型,检测其基因组DNA多态性,寻找与其性别相关的分子标记。在100~500 bp范围,共获得864个位点,其中具有多态性DNA位点411条,多态性位点比例为48.58%,并未发现雌雄特异性位点。但发现33个位点在雌雄个体中的比例存在较大差异,聚类分析显示大部分雄鱼聚为一支,雌鱼聚为一支,从而推断这些位点可能与中华鲟性别具有密切相关性。该研究首次尝试在中华鲟基因组中寻找性别特异性的AFLP分子标记,尽管未找到特异性标记,但这些数据为进一步研究中华鲟性别相关基因和性别决定机制奠定了基础。