盐地碱蓬(Suaeda salsa)APX 基因的克隆及盐胁迫下的表达

从盐地碱蓬 (Suaedasalsa)中克隆了抗坏血酸过氧化物酶 (ascorbateperoxidase ,APX)的全长cDNA(SsAPX) ,基因注册号为AY0 34 893。SsAPX全长 1.1kb ,推导的氨基酸序列长为 2 5 0个氨基酸残基。BLAST同源性分析表明 ,该cDNA与已报告的菠菜(Spinaciaoleracea)细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因同源性最高 ,在核苷酸水平上一致性为 87% ,在氨基酸水平上一致性为 89%。Southern杂交表明APX基因在盐地碱蓬基因组中只有 1个拷贝。盐 (NaCl 40 0mmol/L)处理不同时间后的Northern杂交分析表明盐地碱蓬中SsAPX基因在盐胁迫下表达量增加 ,而且在盐胁迫下抗坏血酸过氧化物酶的活性也显著地增加 ,说明该基因受盐诱导。推测抗坏血酸过氧化物酶可能在保护盐地碱蓬免受氧化损伤的过程中起到一定作用     

盐地碱蓬(Suaeda salsa)中SsINPS基因的分子克隆及表达特性分析

肌醇 1 磷酸 (I 1 P)合成酶 (EC5 .5 .1 .4,INPS)是肌醇生物合成中的关键酶 ,催化葡萄糖 6 磷酸 (G 6 P)到I 1 P的反应。从该实验室已构建的NaCl40 0mmol/L处理的盐地碱蓬 (Suaedasal sa)cDNA文库中克隆了肌醇 1 磷酸合成酶的全长cDNA (S .salsamyo inositol 1 phosphatesynthase,SsINPS) ,基因注册号为AF43 3 879。SsINPS全长约 1 986bp ,含有开放式阅读框架 1 5 3 0bp ,3′和 5′的非翻译区分别为 1 3 9bp和 3 1 7bp ;推导的氨基酸序列全长 5 1 0个氨基酸残基 ,分子量约为 5 6 .7kD ,pI值为 5 .3 5。BLAST同源性分析表明 ,该cDNA与已报告的冰叶日中花 (Mesembryanthemumcrys tallinum)的INPS基因同源性最高 ,其中 ,核苷酸水平的同源性为 91 % ,氨基酸水平上的同源性为84%。以SsINPS全长cDNA为探针进行的South ern杂交结果表明 ,SsINPS基因在盐地碱蓬基因组中只有一个拷贝 ;Northern结果表明 ,在盐处理(40 0mmol/L的NaCl)下 ,SsINPS在叶中的表达量有显著的增加。从而说明SsINPS在盐胁迫下是上升调节的     

盐地碱蓬过氧化氢酶基因的克隆及盐胁迫下的表达分析

过氧化氢酶是清除H2O2的重要酶类.从400 mmol/L NaCl处理的盐地碱蓬(Suaeda salsa(L.)Pall)地上部分的cDNA文库中克隆了两个编码过氧化氢酶的cDNA(Sscat1和Sscat2),其中Sscat1(1.7kb)是一个全长cDNA克隆,编码一个492个氨基酸的开放阅读框架,而Sscat2(1.1kb)是一个cDNA片段.据编码Sscat1 3＇端的287个氨基酸的cDNA序列与Sscat2的cDNA序列进行的BLAST同源性分析表明,Sscat1和Sscat2在核苷酸水平的一致性为71.9%,在氨基酸水平上的一致性为75%.Southem杂交表明,Sscat1在盐地碱蓬基因组中为多拷贝基因,Sscat2则为一个单拷贝基因.Northern杂交结果表明在盐胁迫条件下Sscat1和Sscat2的表达存在差异:400 mmol/L NaCl处理48h的盐地碱蓬根中的Sscat1和Sscat2 mRNA水平比对照显著提高,但是在叶中仅Sscatl受盐诱导表达.不同盐处理时间下的表达分析也证实,在盐地碱蓬叶中仅Sscat1受盐诱导表达.这说明Sscat1和Sscat2在盐地碱蓬中是差异调控的.生理分析表明过氧化氢酶的活性在盐胁迫条件下显著提高.     

盐地碱蓬过氧化氢酶基因的克隆及盐胁迫下的表达分析

过氧化氢酶是清除H2O2的重要酶类,从400mmol/LNaCl处理的盐地碱蓬（Suaeda salsa(L.)Pall)地上部分的cDNA文库中克隆了两个编码过氧化氢酶的cDNA(Sscat1和Sscat2)。其中Sscatl(1.7kb)是一个全长cDNA克隆,编码一个492个氨基酸的开放阅读框架。而Sscat2(1.1kb)是一个cDNA片段。据编码Sscatl3′端的287个氨基酸的cDNA序列与Sscat2的cDNA序列进行的BLAST同源性分析表明,Sscat1和Sscat2在核苷酸水平的一致性则为一个单拷贝基因。Northern杂交结果表明在盐胁迫条件下Sscat1和Sscat2的表达存在差异;400mmol/LNaCl处理48h的盐地碱蓬根中的Sscat1和Sscat2mRNA水平比对照显著提高,但是在叶中仅Sscat1受盐诱导表达,不同盐处理时间下的表达分析也证实。在盐地碱蓬叶中仅Sscat1受盐诱导表达。这说明Sscat1和Sscat2在盐地碱蓬中是差异调控的,生理分析表明过氧化氢酶的活性在盐胁迫条件下显著提高。     

硫腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及其在盐胁迫条件下的不同表达

硫腺苷甲硫氨酸作为甲基供体在转甲基反应中起到重要作用.为了解硫腺苷甲硫氨酸在盐地碱蓬(Suaedasalsa (L.)Pall)耐盐中的作用,我们对可能编码硫腺苷甲硫氨酸合成酶的基因(SsSAMS2)进行了分析.该基因在经400 mmol/L NaCl处理的盐地碱蓬地上部分的λ-Zap cDNA文库中克隆到,其插入片段全长1 531 bp,包含一个395个氨基酸的开放阅读框架,该基因推断的分子量约为43 kD.SsSAMS2与长春花(Catharanthus roseus)的SAMS2在氨基酸水平上的一致性为93%.Southern杂交显示,SsSAMS2在盐地碱蓬基因组中可能是两个拷贝.Northern分析显示硫腺苷甲硫氨酸合成酶基因受NaCl等胁迫的正调控.酶活性检测表明,NaCl胁迫条件下该酶活性增强.     

硫腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及其在盐胁迫条件下的不同表达

硫腺苷甲硫氨酸作为甲基供体在转甲基反应中起到重要作用。为了解硫腺苷甲硫氨酸在盐地碱蓬(Suaeda salsa (L.) Pall)耐盐中的作用,我们对可能编码硫腺苷甲硫氨酸合成酶的基因(SsSAMS2)进行了分析.该基因在经400mmol/L NaCl处理的盐地碱蓬地上部分的λ-Zap cDNA文库中克隆到,其播入片段全长1531bp,包含一个395个氨基酸的开放阅读框架,该基因推断的分子量约为43kD.SsSAMS2与长春花(Catharanthus roseus)的SAMS2在氨基酸水平上的一致性为93%.Southern杂交显示,SsSAMS2在盐地碱蓬基因组中可能是两个拷贝.Northern分析显示硫腺苷甲硫氨酸合成酶基因受NaCl等胁迫的正调控.酶活性检测表明,NaCl胁迫条件下该酶活性增强.     

新疆3种藜科盐生植物NHX基因的克隆与序列分析比较

从新疆野生植物盐角草(Salicornia europaea)、盐爪爪(Kalidium foliatum)和盐穗木(Halostachys caspica)中分别克隆了约1.7kb的NHX基因cDNA片段,此片段均包含了NHX完整基因,三者之间有较高的同源性,盐角草NHX基因与盐爪爪NHX基因同源性达92.81%,盐角草与盐穗木同源性达92.19%,盐爪爪与盐穗木同源性达97.66%.它们与其它几种藜科盐生植物如滨藜、碱蓬、灰绿藜的NHX基因同源性也很高,达到80%以上,与拟南芥同源性也达到86%.此基因在植物尤其是藜科盐生植物中高度保守,其编码的功能性蛋白可能在影响植物耐盐中起作用.     

盐胁迫下盐地碱蓬叶片液泡膜H+-ATPase H 亚基的克隆与表达分析

利用EST随机挑取克隆测序的方法从盐地碱蓬叶片cDNA文库中分离得到了盐地碱蓬V-H -ATPase H亚基cDNA序列,并进行了H、c亚基基因表达及V-H -ATPase活性分析.结果表明,H亚基基因全长1 969 bp,包括100 bp的5′-非编码区和471 bp的3′-非编码区.开放阅读框为1 398 bp,编码465个氨基酸残基,分子量约52.8 kD.N orthern杂交分析表明盐胁迫明显诱导了H亚基表达,而且盐胁迫下H、c亚基及V-H -ATPase活性存在协同作用.这些结果表明盐胁迫下H和c亚基基因上调及V-H -ATPase活性的增加为N a 区隔化到液泡中提供了质子驱动力.     

盐地碱蓬延伸因子(SsEF-1α)的克隆与表达分析

从盐胁迫下的盐地碱蓬(Suaeda salsa)的cDNA文库中获得了一个延伸因子(SsEF-1α)的cDNA片段。以此片段为探针,对其在不同胁迫处理下的盐地碱蓬中表达利用Northern杂交进行分析,结果表明,不同盐浓度处理、同一盐浓度不同时间处理下及双氧水刺激条件下延伸因子在碱蓬叶中的表达量先呈现减少然后增加的趋势;聚乙二醇(PEG)及低温诱导下均呈现上升趋势。由此可见该基因在盐、氧化、高渗和低温胁迫条件下产生一定的反应。     

灰绿藜和碱蒿NHX基因 3''''-UTR序列的差异性分析

采用3'末端快速扩增技术,分别从新疆野生盐生植物灰绿藜和碱蒿中克隆CgNHX和AaNHX cDNA 3'末端.测序结果表明克隆获得的片段为CgNHX和AaNHX基因3'末端,并且CgNHX和AaNHX3'-UTR的不同拷贝之间存在很大的差异性.序列同源性分析结果显示,AaNHX基因3'-UTR与CgNHX基因3'-UTR同源性高达52%,两者与SsNHX(碱蓬NHX)同源性分别达到60%和54%,表明NHX基因的加工方式可能相同,同时说明该基因在野生盐生植物中的功能是很重要的.     

谷胱甘肽转移酶基因过量表达能加速盐胁迫下转基因拟南芥的生长

盐地碱蓬谷胱甘肽转移酶基因(glutathione s-transferase gene,GST)克隆到植物表达载体pROKⅡ35s启动子的下游,通过农杆菌介导,利用花絮浸泡法转化拟南芥.转化子在含有卡那霉素的培养基上经过筛选以后,将初步验证为阳性的转基因植株通过PCR-Southem进一步证实.经过选育,筛选并分离到卡那霉素的抗性并且遗传稳定的T3代纯合子转基因拟南芥品系.通过Northern杂交证实外源基因在转基因拟南芥中表达.在盐胁迫条件下,通过测量转基因植株(GT)和野生型植株(wY)的生物量和谷胱甘肽(氧化型:GSSG;还原型:GsH)发现:转基因植株的生物量较野生型有一定程度的提高;GssG含量在转基因品系中比野生型的含量明显高.因此,过量表达GsT能够提高转基因植株在盐胁迫条件下的生长,而且这很可能是由于还原型谷胱甘肽被氧化的结果.     

Cloning and Differential Expression of Two Catalases in Suaeda salsa in Response to Salt Stress

Two different cDNA clones (Sscat1 and Sscat2) encoding catalase, the primary important H2O2_scavenging enzyme, were isolated from a λZap_cDNA library constructed from a 400 mmol/L NaCl_treated library of Suaeda salsa (L.) Pall aerial tissue. Sscat1 (1.7 kb) contains a full open reading frame of 492 amino acids and Sscat2 (1.1 kb) is a partial clone. BLAST analysis indicates that the two clones share 71.9% identity in nucleotide sequence and 75% identity in deduced amino acid sequence within the last 287 amino acid residues of Sscat1. Southern blotting analysis showed that Sscat1 is multicopy in S. salsa genome, while Sscat2 is a single copy gene. Northern blotting analysis showed a rapid increase in the steady_level of both genes in roots after 48 h salt treatment, but only Sscat1 was induced in salinity treated leaves. Time_course analysis carried out in leaves confirmed that Sscat1 was induced by salt stress, in contrast to Sscat2. These implied that the expression of Sscat1 and Sscat2 genes are differentially regulated in S. salsa. The activity of total catalase is dramatically increased in response to salt stress.     

黄瓜扩张蛋白基因CsEXP10的克隆与表达

以cDNA-AFLP差示片段的序列（CO434610）为基础,通过RACE延伸和与EST序列拼接,得到长度为1191bp的、包含完整3’末端的CsEXP10基因cDNA序列。Southern杂交结果表明,该基因在黄瓜基因组中以单拷贝形式存在．RT-PCR检测发现,该基因不在根、茎和叶中表达,而在果实中表达．Northern杂交显示,该基因在授粉后迅速生长的幼果中丰量表达,而在幼小子房、开花当天的未授粉子房和生长停止的果实中不表达,由此推测CsEXP10基因与授粉后黄瓜果实膨大生长有密切关系。     

日本血吸虫新基因Sj-MA的克隆、表达及保护性免疫

为发现新基因 ,寻找日本血吸虫病新疫苗候选分子 ,采用Sj雄虫免疫血清筛选Sj成虫cDNA文库。经测序发现新基因Sj MA含有一个完整的阅读框 ,推测其由 2 4 9个氨基酸组成 ,编码分子量为 2 8.8kD的可溶性蛋白质 ,并带有多个能被磷酸化激活的位点 ,提示其可能为一重要的信息传递分子。将Sj MA的cDNA亚克隆至原核表达载体pGEX 5X ,获得Sj MA原核表达的重组体rSj MA/GST ,并在E .coli中高效表达为谷胱甘肽S 转移酶 (GST)融合蛋白 ,分子量为 5 4 .8kD ,Western印迹显示融合蛋白质能被抗雄虫和抗GST血清识别。融合蛋白质免疫小鼠可诱导 34.2 9%的减虫率 ,与对照组有显著性差异 (P <0 .0 0 1 )。表明新基因Sj MA表达的蛋白质能诱导小鼠的抗日本血吸虫的保护性免疫 ,提示其作为日本血吸虫疫苗候选分子的潜在价值     

The gene for the microsomal glutathione S-transferase is on human chromosome 12

The microsomal glutathione S-transferase (GST) is a unique membrane-bound GST structurally distinct from the cytosolic GSTs. A cDNA encoding this 154 amino acid protein has recently been isolated and characterized. Using the cDNA as the hybridization probe, we now report the assignment of the human microsomal GST gene to chromosome 12 through the use of a panel of mouse-human somatic cell hybrid lines. This locus has recently been designated as GST 12. In addition, genomic Southern blotting data suggest that the human microsomal GST is encoded by a single- or very-low-copy gene. Therefore, the human GST gene superfamily resides on at least four separate chromosomes: 1 (GST 1), 6 (GST 2), 11 (GST 3), and 12 (GST 12).     

石油污染盐碱土壤翅碱蓬根围的细菌多样性及耐盐石油烃降解菌筛选

为了更好地了解石油污染盐碱土壤翅碱蓬根围的细菌多样性,采用16S rRNA基因克隆文库方法对其进行分析,在此基础上采用富集培养方法从该生境中分离筛选耐盐石油烃降解菌.16S rRNA基因克隆文库分析结果表明,海杆菌属(Marinobacter)、食烷菌属(Alcanivorax)和假单胞菌属(Pseudomonas)是该生境中的优势菌.他们可能在石油污染盐碱土壤翅碱蓬植物修复过程中起重要作用.进一步采用富集培养方法,从该生境中分离得到8株耐盐石油烃降解菌,可以耐受6％-10％浓度的NaCl,石油烃降解率在32.3％-57.0％之间.经16S rRNA基因序列分析,8株菌隶属于戈登氏菌属(Gordonia)、无色杆菌属(Achromobacter)、迪茨菌属(Dietzia)、芽胞杆菌属(Bacillus)和假单胞菌属(Pseudomonas).他们可能参与石油污染盐碱土壤翅碱蓬植物修复过程中的石油烃降解.     

西府海棠(Malus micromalus)MaMAPK基因的克隆及表达特性

依据高等植物MAPK基因的保守区设计简并引物,用 RT-PCR方法,首次从西府海棠幼苗叶片中克隆了促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)基因(MaMAPK)的cDNA全序列.Southern杂交结果表明在西府海棠中存在一个小的MAPK基因家族.20%PEG处理西府海棠幼苗不同时间后的Northern杂交分析表明,该基因在根系和叶片中均有表达,随着胁迫时间延长表达量增加,说明西府海棠MaMAPK基因在转录水平上受水分胁迫诱导表达.     

猪流行性腹泻病毒CH/JL毒株S基因的克隆、序列分析及线性抗原表位区的鉴定

以猪流行性腹泻病毒CH/JL毒株的RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得的3个相互重叠的cDNA克隆覆盖了S基因,序列比对结果表明:PEDV CH/JL株S基因与CV777、Brl/87、JS、KPEDV和Chinju99毒株S基因核苷酸序列的同源性分别为96.97%、96.87%、96.41%、94.02%和93.93%,氨基酸序列的同源性分别为96.17%、95.88%、96.10%、92.36%和92.05%;分子进化树分析结果显示,PEDV CH/JL株S基因与JS毒株S基因亲缘关系最近,处于同一群。利用DNAstar Protean程序预测了PEDV CH/JL株S蛋白一个抗原表位区(83~276aa),将其克隆到原核表达载体pGEX-6p-1后转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,在终浓度1.0mmol/L的IPTG诱导下获得了表达,Western blot结果显示,预测的抗原表位区GST融合蛋白能与猪流行性腹泻病毒多克隆抗血清反应,提示该抗原表位区含有线性抗原表位。     

高亲和K+转运载体SsHKT1的抗体制备及表达分析

利用RT-PCR及RACE技术从盐生植物盐地碱蓬(Suaeda salsaL.)根中克隆了高亲和K 转运载体SsH-KT1的基因。以SsHKT1基因的cDNA为模板,扩增了cDNA中的亲水片段(403~612 bp),连接至原核表达载体pGEX-6P-3中并转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达了融合蛋白。该蛋白主要以包涵体的形式存在,纯化后免疫新西兰兔,得到了特异性较高的SsHKT1多克隆抗体。利用此抗体进行了W estern b lot分析,表明SsHKT1可能主要存在于质膜上。进一步研究了K 饥饿及盐胁迫条件下SsHKT1蛋白表达量的变化,结果表明K 饥饿及盐胁迫条件下SsHKT1的表达量都明显增加,表明SsHKT1在盐地碱蓬K 吸收特别是高盐条件下K 营养中有重要作用。