测定λ原噬菌体诱导频率的新方法

本文报道两种测定λ原噬菌体紫外诱导频率的新方法—菌落计数法和平板诱导法。将溶源菌液经紫外诱导暗培养稀释后直接涂布在平板上培养 ,根据平板上菌落形成单位数计算λ噬菌体紫外诱导频率。另一种是将溶源菌与指示菌混合制备的平板用紫外线诱导 ,根据平板上噬菌体形成单位确定λ噬菌体紫外诱导频率。这两种方法不仅能准确测定噬菌体紫外诱导频率 ,而且操作简便 ,节省时间和用具 ,重复性好。本研究还将冬虫夏草浸出汁与溶源菌混合后进行紫外辐射 ,通过几种方法进行比较 ,结果证明建立的新方法确实可行 ,易操作 ;同时也表明冬虫夏草具有较强的抗紫外辐射作用     

测定λ原噬菌体诱导频率的新方法

本文报道两种测定λ原噬菌体紫外诱导频率的新方法 - 菌落计数法和平板诱导法.将溶源菌液经紫外诱导暗培养稀释后直接涂布在平板上培养,根据平板上菌落形成单位数计算λ噬菌体紫外诱导频率.另一种是将溶源菌与指示菌混合制备的平板用紫外线诱导,根据平板上噬菌体形成单位确定λ噬菌体紫外诱导频率.这两种方法不仅能准确测定噬菌体紫外诱导频率,而且操作简便,节省时间和用具,重复性好.本研究还将冬虫夏草浸出汁与溶源菌混合后进行紫外辐射,通过几种方法进行比较,结果证明建立的新方法确实可行,易操作;同时也表明冬虫夏草具有较强的抗紫外辐射作用.     

用凝胶电泳方法鉴定苏云金芽孢杆菌溶源性菌株

根据原噬菌体的可诱导性,将苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称B t)培养液用丝裂霉素C(MMC)诱导,诱导液经高速离心除菌和2.5×SDS-EDTA染料混合液处理后,琼脂糖凝胶电泳检测有无DNA带,以确定菌株的溶源性。实验证明,该DNA为溶源菌诱导出的噬菌体DNA,而非溶源菌以同样方法不能获得DNA。用此方法,可作为鉴定B t溶源性菌株的一个手段,有助于B t工业发酵中噬菌体污染的预防。     

诱导溶源性嗜盐古生菌产生噬菌体的方法

目的:用简单易行的诱导手段,从溶源性的嗜盐古生菌中诱导产生新的噬菌体,为分离嗜盐古生菌噬菌体提供一种新的途径.方法:分别用紫外线与丝裂霉素C对10株对数期的嗜盐古生菌菌株进行诱导,上清液采用双层平板法进行噬菌斑鉴定,并用脉冲场凝胶电泳对噬菌体基因组进行分析.结果:经1 μg/mL丝裂霉素C诱导的嗜盐古生菌融合子F5产生了一株新的嗜盐古生菌噬菌体SNJ1,该噬菌体能感染Natrinema属的菌株J7.结论:丝裂霉素C能诱导原噬菌体从宿主中分离,为嗜盐古生菌噬菌体分离提供了一条新的途径.     

λ 原噬菌体缺失突变株的诱导和分离

对CSH45(λcI857S7)菌株进行热诱导(42℃),原噬菌体DNA产生部分缺失的菌株,然后用λcIb221进行感染,并通过EMB-麦芽糖平皿进行粗筛。最后在不同温度条件下,分别以λvir和λcIb221感染,从而分离得到5株所需菌株,筛选频率为10％。这些菌株在EMB-麦芽糖平皿上为红色菌落。在32℃时能被λvir裂解,而对λcIb 221具有免疫性;在42℃时既能被λvir裂解,也能被λcIb221裂解,从而证实了这些菌株仍携带有原噬菌体的cI基因,可作为控制携带有λpLN基因的克隆载体的受体菌株。     

红霉素链霉菌2-62溶源性菌株的确证与特性研究

我们从红霉紊产生菌Streptomyces erythreus的27株系谱菌株中分离到一株带确噬菌体的2—62菌株,并对2—62菌株作了多方面的考察。根据单菌落传代、孢子加热,柠檬酸钠洗涤消除噬菌体后仍继续释放噬菌体;2—62菌株释放的噬菌体经纯化后制备抗血清,用此抗血清处理2—62菌株的斜面孢子,以中和游离的噬菌体,这种孢子在培养过程中仍继续释放噬菌体;2—62菌株对其自身释放的噬菌体具有免疫力等特性,确证2—62菌株为溶源性菌株。用紫外线或丝裂霉素C进行诱导试验,噬菌体释放量增加不多。将2—62菌株释放的温和性噬菌体感染P32一102敏感菌,得到的溶源化菌林亦释放噬菌体,并且溶源化菌林的性状保持稳定。     

热诱导速度对噬菌体包装蛋白提取物效价的影响

 <正> 利用D蛋白和E蛋白基因缺陷λ的溶原菌热诱导制备蛋白质提取物,进行噬菌体的体外包装,提取物的效价高低,对重组噬菌体的包装是至为关键的,直接影响到外源基因库的完整性和随机性。目前一般包装效价为10~7—10~8Pfu/μgDNA本文比较了快、慢诱导对效价的影响,快诱导的体外包装效价可达2.8×10~8Pfu/μgDNA,而慢诱导包装效价低。     

分枝杆菌噬菌体整合及裂解的分子机理

结核病仍旧威胁着全球人类健康,中国是结核病高发国家之一,寻求新的药物和疫苗势在必行。随着对噬菌体研究的深入,分枝杆菌噬菌体成为结核病新型药物发现和药敏实验的研究热点之一。噬菌体进入宿主菌体内,以裂解和溶源两种途径进入循环。以分枝杆菌的溶源性噬菌体为例,综述了分枝杆菌噬菌体整合和裂解分子机理。分枝杆菌溶源性噬菌体的整合需噬菌体基因组的附着位点attachment site(attP),宿主菌分枝杆菌基因组的附着位点attachment site(attB),整合酶integrase(Int)和整合宿主因子integration host factor(mIHF)。部分溶源性噬菌体如Ms6进入裂解循环,复制转录组装成新的子代噬菌体,在裂解素(Lysin)和穿孔素(Holin)的协同作用下裂解宿主菌,释放子代噬菌体。目前国内未见对分枝杆菌噬菌体的研究报道。研究分枝杆菌噬菌体整合及裂解机理对结核病治疗新药开发有一定的启示。     

双启动子对重组溶源性枯草杆菌中外源蛋白表达的增强作用

探讨了双启动子对基于溶源性噬菌体构建的重组枯草杆菌中外源蛋白表达的影响。分别将不含或含有本身启动子的α-淀粉酶基因(来源于Bacillus amyloliquefaciens)和青霉素酰化酶基因(来源于Bacillus megaterium)克隆到溶源性枯草杆菌中,得到重组菌B.subtilisAMY1,B.subtilisAMY2,B.subtilisPA1以及B.subtilisPA2。由于同源重组,所克隆的片段整合到溶源性枯草杆菌中的噬菌体基因组上,并处于噬菌体强启动子的下游。在重组菌AMY1和PA1中,在热诱导的情况下外源基因的转录只受到噬菌体启动子的作用,而在重组菌AMY2和PA2中,在热诱导下外源基因的转录同时受到噬菌体启动子和基因本身所带启动子的作用。双启动子的应用使重组α-淀粉酶的表达量提高了133%,使重组青霉素酰化酶的表达量提高了113%。     

利用噬菌体破细胞壁分离胞内产物的展望

介绍了利用噬菌体破细胞壁的两类方法;构建可诱导裂解的溶源菌和克隆可诱导裂解的噬菌体裂解基因。对λ噬菌体裂解细胞的行为进行了详细分析。以产聚－β－羟基丁酸酯（ＰＨＢ）的重组大肠杆菌为例,提出将带有琥珀突变的λ噬菌体的裂解基因Ｓ＾－ＲＲｚ和目标产物的基因克隆到同一质粒上,以用来破细胞壁生产目的产物的方法,可望解决细胞中产物积累量最大和细胞破碎率最高的矛盾,具有一定的应用前景。     

利用平板法获得高效价λ噬菌体悬液

我们研究了在平板上获得高效价λ噬菌体的方法,并将平板增殖的高效价λ噬菌体用于λDNA的简易制备。材料与方法1.菌株:λ噬菌体用E.Coli w1485(cI85757)经热诱导获得;指示菌为E.Coli 266 YMC Lac~-。由中国科学院微生物研究所提供。2.培养基:(1)BPY培养基:用于斜面     

香蕉条斑病毒ORFⅠ、ORFⅡ在大肠杆菌中的原核表达和自激活特性的鉴定

目前,香蕉条斑病毒所有3个ORF表达产物功能均不明确,通过双杂技术研究病毒未知蛋白与宿主蛋白的互作,可以初步推断未知蛋白的功能。本实验旨在构建香蕉条斑病毒ORFⅠ和ORFⅡ在细菌双杂系统中的诱饵质粒。首先以课题组保存的连接有香蕉条斑病毒河口分离物全基因组的pMD-18T载体DNA为模板,经过PCR扩增,切胶回收,并通过与带有λcI基因的pBT载体共同双酶切及T4连接酶连接后,得到与λcI基因融合表达的重组载体pBT-ORF1和pBT-ORF2。转化大肠杆菌XL1-BlueMRF'报告菌株,用IPTG(0.1mmol/L)诱导目的基因片段表达。Westernblotting结果表明,ORF1-λcI和ORF1-λcI两种融合蛋白均成功表达,且大小与预期一致。之后,pBT-ORF1及pBT-ORF2分别与空质粒pTRG共转化XL1-BlueMRF'报告菌株,pBT空质粒和pTRG-Gal11p共转化作为阴性对照。结果显示pBT-ORF1及pBT-ORF2均无自激活现象,可以进行后续的细菌双杂工作。本实验为BSV与宿主的细菌双杂系统的建立及蛋白组学的研究奠定了基础。     

红霉素链霉菌的溶源转换研究

2-62菌株是一溶源性菌株,合成红霉素能力稳定,气生菌丝生长良好。经42℃培养后筛选得到的4株无活性菌株(Em-)便不再释放噬菌体,成为去溶源菌株,并对P4噬菌体敏感。当此菌株再次溶源化后,又恢复了合成红霉素的能力,表明p4噬菌体与红霉素产生密切相关。 经诱变获得的1-9及10-25Em-菌株,气生菌丝生长受抑制,呈光秃型,经连续传代20次仍保持菌落类型纯一。当1-9及10-25菌株成为1-9(P4)及10-25(P4)时,选择恢复气生菌丝生长的菌落用琼脂块法测定,均获得产生红霉素的性能,并都释放噬菌体。说明P4噬菌体具有溶源转换的性能,它与红霉素的生物合成及气生菌丝的形成等性状相关。     

利用噬菌体破细胞壁分离胞内产物的展望

介绍了利用噬菌体破细胞壁的两类方法;构建可诱导裂解的溶源菌和克隆可诱导裂解的噬菌体裂解基因。对λ噬菌体裂解细胞的行为进行了详细分析。以产聚β羟基丁酸酯(PHB)的重组大肠杆菌为例,提出将带有琥珀突变的λ噬菌体的裂解基因SRRz和目标产物的基因克隆到同一质粒上,以用来破细胞壁生产目的产物的方法,可望解决细胞中产物积累量最大和细胞破碎率最高的矛盾,具有一定的应用前景。     

基因标记、转化、表达与检测

930450采用交叉调节系统使大肠杆菌表达I组蛋白[会,英]/Kalli0,P.…,Abstr.Pap.Am.Ch—em.Soc.一1992,203Meet,Pt.1.一BI OT‘84[译自DBA,1992,11(15),92—083573 这个新表达系统的产物礞白是氯霉素酰基转移酶。CAT基因和cI阻遏物基因的转录由tac启动子来调节,而lacI基因的转录则由九·噬菌体pL一启动子调控。加入诱导物IPTG可提高CAT蛋白和cI阻遏物的表达,从而抑制lac阻遏物的表达,进一步增强CAT的表达。叙述了在各种拷贝数的质粒中对新系统的构建,并将CAT表达的结果与通常使用的构成性调节系统散了比较。分批诱导的结果与…     

噬菌体ΦEc-SL25对大肠埃希菌临床分离株裂解作用的研究

目的分离鉴定大肠埃希菌噬菌体并分析其裂解特性,为噬菌体疗法应用于大肠埃希菌感染提供实验依据。方法采用双层琼脂噬斑法从污水中分离噬菌体,通过透射电镜观察噬菌体的形态学特征,利用限制性酶切图谱初步分析噬菌体的基因组,测定噬菌体对宿主菌的最佳感染复数和一步生长曲线,分析噬菌体对宿主菌的裂解谱,观察噬菌体在不同的pH及温度下对宿主菌的裂解特性,SDS-PAGE分析噬菌体的主要和次要蛋白。结果通过噬斑法从污水中分离出1株能裂解大肠埃希菌的噬菌体,命名为ΦEc-SL25;电镜显示,噬菌体ΦEc-SL25的形态特征符合有尾病毒目、管尾病毒科噬菌体;ΦEc-SL25的最佳感染复数为0.01;一步生长曲线表明,噬菌体ΦEc-SL25的潜伏期为5 min,爆发期为10 min;ΦEc-SL25对26株大肠埃希菌的裂解率可达30.8%;在温度70℃20min时以及在pH 4~10的范围内,噬菌体ΦEc-SL25仍保持其裂解活性;蛋白电泳可观察到2条主要蛋白带和至少3条次要蛋白。结论噬菌体ΦEc-SL25是一种潜伏期短、裂解较性强的毒性噬菌体,可用于开发针对大肠埃希菌感染的生物制剂。     

AMP激活的蛋白激酶α2亚基在大肠杆菌中的克隆及表达

目的:AMP激活的蛋白激酶(AMPK)在脑内作为多功能能量感受器发挥作用,主要协调代谢和能量的需要。脑神经元中AMPKα2亚基的含量明显高于α1亚基,本研究选择α2亚基作为对象,研究其在大肠杆菌中的表达情况,为以蛋白原核表达为前提的研究技术的应用提供实验依据。方法:大鼠AMPKα2蛋白编码区片段通过PCR方法从重组pcDNA3质粒中扩增后,克隆至带有λcI基因的pBT载体,构建融合表达载体pBT-AMPKα2。通过核苷酸序列测定证实结果正确后,转化pBT-AMPKα2入大肠杆菌XL-1 Blue MR菌株,IPTG诱导目的蛋白表达。结果:Western blotting显示AMPKα2-λcI融合蛋白表达,分子量约为89ku,与预期相符合。结果还表明AMPKα2-λcI融合蛋白以可溶性蛋白和不溶性包涵体两种形式存在,前者不稳定易发生降解,生成AMPKα2和λcI蛋白,分子量分别是62ku和27ku;后者稳定不发生降解。结论:AMPKα2亚基能以AMPKα2-λcI融合蛋白的形式在大肠杆菌中表达,这为今后以pBT-AMPKα2融合表达载体为工具利用大肠杆菌双杂交系统筛选AMPKα2的相互作用蛋白奠定基础。     

基于MS2噬菌体lys基因的质粒型条件自溶菌的构建与应用

【背景】传统外源蛋白的原核表达通常需要以超声破碎或者酶解的方式破碎菌体,过程比较烦琐。【目的】构建基于MS2噬菌体lys基因的质粒型条件自溶菌,以简化外源蛋白的获取流程。【方法】从MS2噬菌体中克隆lys基因,构建重组表达质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达,以此构建质粒型条件自溶菌,通过生长曲线和菌落形成单位反映自溶菌裂解效率,利用SDS-PAGE检测外源蛋白释放情况。【结果】构建了pBAD-lys BL21(DE3)、pBAD-Opti-lys BL21(DE3)及pCDF-BAD-Opti-lys BL21(DE3)这3种质粒型条件自溶菌。以上自溶菌在阿拉伯糖诱导后其宿主裂解效率均为99.99%以上,CFU结果显示含pCDF-BAD-Opti-lys质粒的宿主裂解效果更优,在此自溶菌BL21(DE3)中表达含His标签的重组绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP),经阿拉伯糖诱导后菌体中约63.00%以上的eGFP释放至胞外,利用Ni-NTA可以直接从培养基中纯化得到约30 kDa的单一目的蛋白。【结论】基于MS2噬菌体lys基因成功构建了阿拉伯糖诱导的质粒型条件自溶菌,此自溶菌能够以自我裂解的方式释放大部分胞内外源蛋白,简化传统外源蛋白获取流程。     

链霉菌基因克隆载体及基因文库的构建

利用麦迪霉素产生菌中分离的质粒pSMY1(10．8kb),将pIJ30的硫链丝菌素抗性基因(tsr)克隆到psMY1上,获得了具有硫链丝菌素抗性选择标记质粒pSJ10。通过DNA体外缺失,片段播入、λ-COS片段的插入及与大肠杆菌质粒的重组等基因技术,获得了一系列psMY1衍生质粒,包括双标记质粒pSM3,大肠杆菌／链霉菌穿梭质粒pBMJ2和穿梭粘粒pNMJ1。通过对这些质粒的分析,确定了质粒psMY1的复制必需区为3．06kd的EcoRI—sphI片段。质粒pSJ10、pSM3、pNMJ1具有可选择标记,多个单一确切的可克降位点,有一定范围的宿主并能在链霉菌中稳定存在等特点,故可作为链霉菌基因克隆的载体。其中pNMJl(11．15kb)是大肠杆菌／链霉菌穿梭粘粒,能有效地运载28—38kb的外源DNA片段,并能在体外包装λ噬菌体外壳,转导大肠杆菌。利用载体pNMJl,通过λ-噬菌体蛋白体外包装,在大肠杆菌中建立了螺旋霉素产生菌的基因文库,其基因覆盖率可达90％。重组DNA分子可通过转化转移到链霉菌中。     

一个热诱导穿梭表达载体的构建及其在链霉菌中的应用

为探索大肠杆菌λ噬菌体表达调控元件在链霉菌中的应用,构建了一个链霉菌大肠杆菌穿梭表达载体pHZ1080,并将来自链霉菌FR-008的聚酮合酶(PKS)基因置于其中的λ噬菌体启动子P_R下游,得到表达PKS的穿梭质粒pHZ1067。与在大肠杆菌中一样,该质粒在变铅青链霉菌中也受热诱导表达100kD的PKS蛋白;表达的PKS蛋白可由SDSPAGE和Western-blot实验检测到。PKS在链霉菌中的热诱导表达表明,构建的载体也能用于链霉菌诱导表达外源基因。  